本文介绍了一种制备家蝇羧酸酯酶蛋白的实验方案 体外 利用杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统表达相关基因，并通过基于细胞的 MTT 实验对这些基因在代谢氯菊酯中的功能作用进行表征，从而阐明其介导拟除虫菊酯抗性的机制 体外 代谢研究
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摘要
摘要
羧酸酯酶介导的代谢被认为在多种昆虫的杀虫剂抗性中发挥重要作用。在抗性家蝇品系中，多个羧酸酯酶基因被发现上调表达，但其在赋予杀虫剂抗性中的具体作用仍有待探究。本文设计了一套用于羧酸酯酶功能表征的实验方案，展示了三个示例实验：（1）通过杆状病毒介导的昆虫细胞系统表达并分离羧酸酯酶蛋白；（2）利用荧光底物测定法分析羧酸酯酶的酶活性；（3）通过RNA干扰技术在活体中抑制目标羧酸酯酶基因的表达，进而评估其对杀虫剂敏感性的影响。该综合方法有助于阐明特定羧酸酯酶在杀虫剂代谢与抗性机制中的功能角色。 羧酸酯酶，杀虫剂抗性，杆状病毒表达系统，酶活性测定，RNA干扰，家蝇 草地贪夜蛾 （Sf9）细胞表达系统；（2）基于细胞的MTT（3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴化物）细胞毒性检测法，用于评估昆虫细胞对不同氯菊酯处理的耐受性；以及（3） 体外 代谢研究旨在探索羧酸酯酶对氯氰菊酯的代谢能力。从抗性家蝇品系ALHF中克隆了羧酸酯酶基因MdαE7，并用于构建重组杆状病毒以感染Sf9细胞。采用MTT法检测不同氯氰菊酯处理下细胞的存活率。实验组（感染MdαE7重组杆状病毒的细胞）相较于对照组（感染CAT重组杆状病毒的细胞和感染GFP重组杆状病毒的细胞）在氯氰菊酯处理下表现出更强的细胞耐受性，表明MdαE7具有代谢杀虫剂的能力，从而保护细胞免受化学损伤。此外，还在昆虫Sf9细胞中表达并分离羧酸酯酶蛋白，以开展进一步的实验 体外 代谢研究。我们的结果表明具有显著性 体外 MdαE7对氯菊酯的代谢效率，直接表明羧酸酯酶参与了杀虫剂的代谢，从而赋予家蝇对杀虫剂的抗性。
引言
杀虫剂抗性目前是全球家蝇防控面临的主要问题之一1,2。阐明杀虫剂抗性机制的研究有助于更深入理解这一问题，从而提出新的策略，有效预防或最大限度地减缓抗性扩散3。羧酸酯酶作为主要的解毒酶之一，因其在多种昆虫中对杀虫剂的结合与代谢作用而受到广泛关注4,5,6。我们先前的研究已在家蝇中鉴定出多种羧酸酯酶，其表达水平不仅在抗性品系ALHF中组成型上调，还可因氯菊酯处理而进一步诱导升高7。然而，这些羧酸酯酶基因在杀虫剂代谢中的功能特性仍有待深入研究。
自20世纪80年代初首次报道以来8由于其高效的蛋白质表达能力和真核生物蛋白质加工特性，杆状病毒介导的外源基因表达系统已被广泛应用9该二元系统由两个关键组分构成：一是携带外源基因并将其导入宿主细胞的重组杆状病毒，二是被重组杆状病毒感染的细胞对目标蛋白进行的大规模表达。在过去数十年中，杆状病毒介导的细胞表达系统已被广泛用于在昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达数千....
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方案
1. 利用杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统表达与分离目标蛋白
- 从家蝇中扩增目标蛋白的平末端PCR产物并进行定向克隆。
- 根据绿色荧光蛋白（GFP）和家蝇 MdαE7 基因的序列以及所选载体的特殊要求，设计 PCR 引物表1).
- 使用耐热的、具有校对功能的DNA聚合酶以及步骤1.1.1中的引物进行扩增 150 µL PCR 反应（30 µL 反应缓冲液 3 µL 10 mM dNTPs， 1.5 µL DNA聚合酶 6 µL 家蝇模板DNA 7.5 µL 上游引物 7.5 µL 反向引物，加水至终体积 150 µL）。将PCR反应加热至 98 °C 30秒，随后进行35个循环的 98 °C 10秒， 53 °C 30 秒，以及 72 °C 60 秒，随后进行最终延伸扩增 72 °C 2 分钟。
- 使用1%琼脂糖凝胶电泳 150 µL PCR产物
- 用锋利且洁净的手术刀从琼脂糖凝胶中切下目标DNA片段：MdαE7为1317 bp，GFP为858 bp。使用 commercially available gel extraction kit 按照制造商说明书纯化DNA材料清单）。将纯化的 DNA 溶解于 15 µL 蒸馏水。
- 使用1%琼脂糖凝胶电泳 1 µL 使用纯化的 DNA 检查其完整性。另取一份 1 ....
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结果
不同氯氰菊酯处理下的细胞活力（MTT 法）
在MdαE7重组杆状病毒感染的Sf9细胞（实验组）以及CAT重组杆状病毒（由杆状病毒感染试剂盒提供）感染的细胞（对照组）中检测了氯氰菊酯的细胞毒性。MdαE7表达细胞对氯氰菊酯耐受性的增强有力地支持了该羧酸酯酶在代谢杀虫剂中的作用，从而保护细胞免受化学损伤。在本研究中，将不同浓度氯氰菊酯（50、100、200和400 µM）处理下的细胞活力与仅用乙腈处理的细胞进行比较。结果显示，当暴露于不同浓度的氯氰菊酯时，MdαE7表达细胞的活力显著高于对照细胞（分别为86.00%至101.92%（图4B）和67.59%至81.43%（图4A）），表明MdαE7在昆虫细胞中代谢氯氰菊酯方面具有重要作用。
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讨论
近几十年来，异源表达系统已被广泛用于表达和分离大量蛋白质，从而实现对酶的生化特性及功能的测定与表征 体外迄今为止，已有多种不同的模型系统，包括 大肠杆菌, Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiae，以及 草地贪夜蛾 已适用于重组蛋白表达，且表达系统的选择取决于 体外 该系统对于大规模生产目标蛋白至关重要22,23,24,25在本研究中，我们选用杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统来表达家蝇羧酸酯酶，因为该系统可提供与昆虫细胞相似的细胞内环境，并保留某些重要的真核生物蛋白加工能力9尽管杆状病毒介导的表达系统具有诸多优势，但其局限性也应予以关注。杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统只有在昆虫细胞被构建好.......
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Q5 高保真 DNA 聚合酶 | New England Biolabs 公司 | M0491L | |
| QIAquick 琼脂糖凝胶回收试剂盒 | QIAGEN | 28704 | |
| pENTR/D-TOPO 克隆试剂盒，含 One Shot TOP10 化学感受态 E. coli | Invitrogen（隶属于 Life Technologies） | K240020 | 本试剂盒包含S.O.C.培养基和通用M13序列引物。 |
| PureLink HiPure 质粒小提试剂盒 | Invitrogen（隶属于 Life Technologies） | K210002 | |
| Gateway LR Clonase II 酶混合物用于 BaculoDirectTM 试剂盒 | Invitrogen（原life technology） | 11791-023 | |
| BaculoDirect C端线性DNA转染试剂盒 | Invitrogen（隶属于 Life Technologies） | 12562-019 | 本试剂盒包含Cellfectin转染试剂和更昔洛韦 |
| pENTR-CAT 质粒 | Invitrogen（隶属于 Life Technologies） | BaculoDirect C-末端线性DNA转染试剂盒内含物，浓度：0.5 ug/uL | |
| 经热灭活的认证胎牛血清 | Gibco（Life Technologies 公司旗下品牌） | 10082-139 | |
| Sf-900 III 无血清培养基中的 Sf9 细胞 | Gibco（生命技术公司） | 12659017 | |
| 昆虫细胞-PE LB昆虫细胞蛋白提取 &和裂解缓冲液 | G Biosciences，隶属于Geno Technology, Inc. | 786-411 | |
| Sf-900 III SFM (1×无血清完全培养基 | Gibco（生命技术公司旗下品牌） | 12658-019 | |
| Grace's 昆虫细胞培养基，未添加补充物 | Gibco（隶属于 Life Technologies） | 11595030 | |
| 氯菊酯（异构体）分析标准品 | SUPELCO，隶属于Solutions WithinTM | 442748 | |
| 甲醇（分析纯） | Sigma-Aldrich | 67-56-1 | |
| 乙腈（分析纯） | Sigma-Aldrich | 75-05-8 | |
| GHP Acrodisc 25 mm 注射器滤器，孔径 0.45 μm GHP 膜（HPLC 认证） | Pall Life Sciences | 21890388 | |
| Alliance Waters 2695 高效液相色谱系统 | 沃特斯 | ||
| T100 热循环仪 | 伯乐生命科学公司 | 1861096 | |
| Nanodrop 2000/2000c 分光光度计 | 赛默飞世尔科技 | ND2000CLAPTOP | |
| Cytation 5 细胞成像多功能酶标仪 | BioTek |
参考文献
- Scott, J. G., et al. Insecticide resistance in house flies from the United States: Resistance levels and frequency of pyrethroid resistance alleles. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 377-384 (2013).
- Li, M., et al.
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