杀虫剂抗性家蝇 Musca domestica 中羧酸酯酶的功能表征

摘要

本文介绍了一种制备家蝇羧酸酯酶蛋白的实验方案 体外 利用杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统表达相关基因，并通过基于细胞的 MTT 实验对这些基因在代谢氯菊酯中的功能作用进行表征，从而阐明其介导拟除虫菊酯抗性的机制 体外 代谢研究

摘要

羧酸酯酶介导的代谢被认为在多种昆虫的杀虫剂抗性中发挥重要作用。在抗性家蝇品系中，多个羧酸酯酶基因被发现上调表达，但其在赋予杀虫剂抗性中的具体作用仍有待探究。本文设计了一套用于羧酸酯酶功能表征的实验方案，展示了三个示例实验：（1）通过杆状病毒介导的昆虫细胞系统表达并分离羧酸酯酶蛋白；（2）利用荧光底物测定法分析羧酸酯酶的酶活性；（3）通过RNA干扰技术在活体中抑制目标羧酸酯酶基因的表达，进而评估其对杀虫剂敏感性的影响。该综合方法有助于阐明特定羧酸酯酶在杀虫剂代谢与抗性机制中的功能角色。 羧酸酯酶，杀虫剂抗性，杆状病毒表达系统，酶活性测定，RNA干扰，家蝇 草地贪夜蛾 （Sf9）细胞表达系统；（2）基于细胞的MTT（3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴化物）细胞毒性检测法，用于评估昆虫细胞对不同氯菊酯处理的耐受性；以及（3） 体外 代谢研究旨在探索羧酸酯酶对氯氰菊酯的代谢能力。从抗性家蝇品系ALHF中克隆了羧酸酯酶基因MdαE7，并用于构建重组杆状病毒以感染Sf9细胞。采用MTT法检测不同氯氰菊酯处理下细胞的存活率。实验组（感染MdαE7重组杆状病毒的细胞）相较于对照组（感染CAT重组杆状病毒的细胞和感染GFP重组杆状病毒的细胞）在氯氰菊酯处理下表现出更强的细胞耐受性，表明MdαE7具有代谢杀虫剂的能力，从而保护细胞免受化学损伤。此外，还在昆虫Sf9细胞中表达并分离羧酸酯酶蛋白，以开展进一步的实验 体外 代谢研究。我们的结果表明具有显著性 体外 MdαE7对氯菊酯的代谢效率，直接表明羧酸酯酶参与了杀虫剂的代谢，从而赋予家蝇对杀虫剂的抗性。

引言

杀虫剂抗性目前是全球家蝇防控面临的主要问题之一^1,2。阐明杀虫剂抗性机制的研究有助于更深入理解这一问题，从而提出新的策略，有效预防或最大限度地减缓抗性扩散³。羧酸酯酶作为主要的解毒酶之一，因其在多种昆虫中对杀虫剂的结合与代谢作用而受到广泛关注^4,5,6。我们先前的研究已在家蝇中鉴定出多种羧酸酯酶，其表达水平不仅在抗性品系ALHF中组成型上调，还可因氯菊酯处理而进一步诱导升高⁷。然而，这些羧酸酯酶基因在杀虫剂代谢中的功能特性仍有待深入研究。

自20世纪80年代初首次报道以来⁸由于其高效的蛋白质表达能力和真核生物蛋白质加工特性，杆状病毒介导的外源基因表达系统已被广泛应用⁹该二元系统由两个关键组分构成：一是携带外源基因并将其导入宿主细胞的重组杆状病毒，二是被重组杆状病毒感染的细胞对目标蛋白进行的大规模表达。在过去数十年中，杆状病毒介导的细胞表达系统已被广泛用于在昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达数千种重组蛋白，涵盖从胞质酶到膜结合蛋白等多种类型。¹⁰我们之前的研究已利用该系统在昆虫Sf9细胞中成功表达了多种CYP450酶¹¹在本研究中，我们构建了羧酸酯酶重组杆状病毒以感染昆虫Sf9细胞，探究了细胞对不同氯氰菊酯处理的耐受性，并实现了羧酸酯酶蛋白的大规模表达 体外 用于功能探索。不同于以往研究中采用昆虫匀浆中多种羧酸酯酶同工酶混合物的方法^12,13该杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统可实现目标蛋白的特异性表达与分离，从而更深入地表征其生物化学与结构特性。

基于四唑盐的比色法（MTT法）是一种为检测细胞活力而开发并优化的高通量比色方法。该方法的原理是只有活细胞才能将黄色的MTT试剂代谢为深紫色的甲臜沉淀物，后者经有机溶剂溶解后可通过比色法进行分析^14,15。近年来，已开发出若干更为精确但耗时较长的方法，如台盼蓝排斥法和胸苷掺入法^16,17。然而，基于细胞的MTT法目前仍被公认为是快速检测细胞活力最快且操作最简便的方法。本文中，我们采用MTT法来探究细胞对杀虫剂处理的耐受性。当细胞感染表达羧酸酯酶的重组杆状病毒后，其耐受性显著增强，这有力地支持了羧酸酯酶在杀虫剂代谢中的作用，也进一步提示其参与了杀虫剂抗性的形成。

此外，一个 体外 本研究还进行了代谢活性检测。与使用α-萘乙酸酯（α-NA）和β-萘乙酸酯（β-NA）等常见底物来反映羧酸酯酶水解活性的一般羧酸酯酶检测方法相比，该方法 体外 代谢研究被认为是直接测定羧酸酯酶对杀虫剂活性的准确方法¹⁸该方法已成功应用于多种昆虫，用于鉴定与杀虫剂抗性相关的多种细胞色素P450^11,19,20然而，该方法尚未应用于羧酸酯酶的研究。随着杆状病毒表达系统生产的羧酸酯酶蛋白的获得，我们可以开展一项 体外 羧酸酯酶对氯氰菊酯的代谢研究，可为进一步阐明羧酸酯酶在家蝇拟除虫菊酯抗性中的作用提供有力证据。

方案

1. 利用杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统表达与分离目标蛋白

1. 从家蝇中定向克隆目标蛋白的平末端PCR产物。
   1. 根据绿色荧光蛋白（GFP）和家蝇MdαE7基因的序列以及所选载体的特殊要求设计PCR引物（表1）。
   2. 使用耐热的、具有校对功能的DNA聚合酶以及步骤1.1.1中的引物进行150 µL的PCR反应（30 µL反应缓冲液，3 µL 10 mM dNTPs，1.5 µL DNA聚合酶，6 µL家蝇模板DNA，7.5 µL正向引物，7.5 µL反向引物，加水至终体积150 µL）。将PCR反应在98 °C预变性30秒，随后进行35个循环：98 °C变性10秒，53 °C退火30秒，72 °C延伸60秒，最后在72 °C延伸2分钟。
      1. 取150 µL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。
   3. 用锋利洁净的手术刀从琼脂糖凝胶中切下目标DNA片段：MdαE7为1317 bp，GFP为858 bp。使用市售的凝胶回收试剂盒按照制造商说明书纯化DNA（材料表）。将纯化后的DNA溶解于15 µL蒸馏水中。
   4. 取1 µL纯化后的DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳以检测完整性。另取1 µL纯化DNA用分光光度计测定浓度。
2. 构建目标蛋白的入门质粒
   1. 设置克隆反应。将步骤1.1.3中新鲜纯化的DNA产物与含有attL位点的市售入门载体（材料表）按1:1的摩尔比混合（浓度为70–200 ng/µL的新鲜PCR产物0.5–2 µL : 载体0.5 µL）。然后加入1 µL市售盐溶液（1.2 M NaCl₂ 和 0.06 M MgCl₂），加水至终体积6 µL。轻轻混匀后室温孵育1小时。
   2. 将步骤1.2.1中4 µL的克隆反应产物转入50 µL化学感受态E. coli细胞中。冰上孵育30分钟。在42 °C水浴中热激30秒，期间不振荡。
   3. 将离心管放回冰上再孵育2分钟。加入250 µL室温S.O.C.培养基（2%胰蛋白胨；0.5%酵母提取物；10 mM NaCl；2.5 mM KCl；10 mM MgCl₂；10 mM MgSO₄；20 mM葡萄糖）。37 °C轻摇培养1小时。
   4. 取步骤1.2.3中的菌液50–200 µL涂布于选择性LB平板上（1 g胰蛋白胨；1 g NaCl；0.5 g酵母提取物；1.5 g琼脂溶于100 mL蒸馏水中，高压灭菌后加入终浓度0.1%的50 mg/mL卡那霉素）。37 °C培养16小时以获得单菌落。
   5. 挑取5–10个单菌落，分别悬浮于5 µL蒸馏水中。
   6. 进行PCR反应：加入5 µL反应缓冲液，0.5 µL 10 mM dNTPs，0.25 µL DNA聚合酶，1 µL悬浮菌液，1.25 µL 10 µM M13正向引物，1.25 µL 10 µM目标基因反向引物，加水至终体积25 µL。PCR程序为：98 °C预变性30秒，随后35个循环：98 °C变性10秒，53 °C退火30秒，72 °C延伸60秒，最后72 °C延伸2分钟（表1）。
   7. 将步骤1.2.5中悬浮菌液的3 µL接种至TB培养基中（100 mL磷酸盐缓冲液含0.17 M KH₂PO₄和0.72 M K₂HPO₄，与含6 g胰蛋白胨、12 g酵母提取物和2 mL甘油的基础肉汤培养基450 mL混合，灭菌后加入终浓度0.1%的50 mg/mL卡那霉素），37 °C培养16小时。按照制造商说明书提取超纯质粒DNA。
   8. 取步骤1.2.7中200 ng/µL的超纯质粒进行商业Sanger测序，使用M13正向和反向引物。根据制造商提供的序列图谱验证目标基因是否正确插入载体。
   9. 将经测序验证的MdαE7和GFP超纯质粒DNA样品保存于-20 °C。
      注：这些即为MdαE7和GFP的入门质粒DNA。
3. 通过Lambda重组（LR）反应构建重组杆状病毒。
   1. 分别将步骤1.2.7中获得的GFP或MdαE7入门质粒DNA（300 ng/µL）1 µL，或细胞转染试剂盒提供的氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）入门质粒DNA，与5 µL市售的C端线性DNA（含attR位点，含attL位点）在250 µL PCR管中混合。加入TE缓冲液至总体积8 µL。
      注：GFP和CAT的反应作为对照组。
   2. 向步骤1.3.1的每种混合物中加入2 µL市售的Lambda重组（LR）酶混合液（材料表），以催化LR反应。轻轻混匀后于25 °C过夜孵育（约16小时）。
      注：LR反应可使含attL位点的入门质粒DNA与含attR位点的C端线性DNA发生重组，生成含attB位点的表达病毒。此步骤为各目标蛋白生成相应的重组杆状病毒。
   3. 将步骤1.3.2中LR反应产物稀释20倍。使用多角体蛋白正向引物和V5反向引物进行PCR（表1）。取5 µL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳以检测质量。图1展示了MdαE7基因LR反应产物的一个示例。

图1：MdαE7 LR反应的PCR分析结果示例。将2 µL LR反应产物稀释200倍，取2 µL稀释液，联合多角体蛋白正向引物和V5反向引物进行25 µL PCR反应。取5 µL PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，以检测LR反应的质量。a

4. 转染昆虫Sf9细胞
   1. 在T25培养瓶中加入5 mL完全细胞生长培养基（无血清培养基加10%胎牛血清（FBS）），于27 ˚C培养昆虫Sf9细胞。
   2. 移除上清液，用3 mL新鲜的完全细胞生长培养基冲洗贴壁细胞，将0.5 mL重悬细胞转移至新的T25培养瓶中，加入4.5 mL完全生长培养基。于27 °C孵育3–4天，直至下次传代。
   3. 将2 mL对数生长期的昆虫Sf9细胞培养物（≈3.0–5.0×10⁶个细胞）均匀接种至细胞培养孔中。在生物安全柜中室温静置，使细胞贴壁至少3小时。
   4. 在250倍倒置相差显微镜下观察细胞贴壁情况。吸除细胞培养基，更换为2 mL Grace's昆虫培养基。
   5. 分别在1.5 mL离心管中配制转染混合液A（8 µL市售细胞感染试剂（材料表）与100 µL Grace's昆虫培养基）和转染混合液B（来自步骤1.3的9 µL LR反应产物与100 µL未添加补充物的Grace's昆虫培养基）。
   6. 轻轻敲击离心管使转染混合液A和B充分混匀。在生物安全柜中室温孵育35分钟。
   7. 将步骤1.4.6所得混合液逐滴均匀加入步骤1.4.4中已接种的细胞孔中。用封口膜密封孔板，于27 °C过夜孵育。
   8. 将2 mL Grace's昆虫培养基更换为2 mL完全生长培养基。每孔加入100 µM更昔洛韦，用于阴性筛选非重组型杆状病毒。用封口膜密封孔板，于27 °C孵育72小时。
   9. 收集各孔感染后72小时的细胞培养上清液，转移至1.5 mL离心管中。在4 °C条件下以1,500 × g离心5分钟，去除细胞或大颗粒碎片。
   10. 将上清液转移至新的1.5 mL离心管中，避光保存于4 °C。
       注：此为各目标基因的P1代病毒原液。
   11. 将低滴度P1病毒原液（1×10⁵–1×10⁶ pfu/mL）扩增至高滴度P2病毒原液（5×10⁷–1×10⁸ pfu/mL）。
   12. 将2 mL对数生长期的昆虫Sf9细胞培养物（≈3.0–5.0×10⁶个细胞）均匀接种至细胞培养孔中。在生物安全柜中室温静置，使细胞贴壁至少3小时。
   13. 分别向步骤1.4.12中已接种细胞的孔中加入5 µL步骤1.4.10获得的P1病毒原液，随后每孔加入100 µM更昔洛韦。密封孔板，于27 °C孵育72小时。
   14. 收集感染后72小时的P2代病毒原液，避光保存于4 °C。
       注：此为各目标基因的P2代病毒原液。
   15. （可选）使用5 µL P2病毒原液重复步骤1.4.12–1.4.14，收集P3代病毒原液。
       注：此为各目标基因的P3代病毒原液。
   16. 将构建的所有杆状病毒避光保存于4 °C。
       注：GFP和CAT基因作为对照组。图2展示了GFP重组杆状病毒感染细胞在不同扩增阶段的细胞表型变化。

图 2：Sf9细胞在不同杆状病毒扩增阶段感染特征的示例。 该图展示了在自然光和荧光光下表达GFP的重组杆状病毒感染的细胞。在P1感染阶段，感染比例较低；在P2感染阶段，感染比例显著提高；在P3感染阶段，几乎所有细胞均表现出从培养板脱落、细胞直径增大以及细胞生长停止等感染症状。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 在昆虫Sf9细胞中大规模表达目标蛋白
   1. 在T25未处理培养瓶中，使用完全培养基培养10 mL处于对数生长期的昆虫Sf9细胞。
   2. 向步骤1.5.1中的细胞培养物中加入200 µL P2病毒储备液（来自步骤1.4.14），感染72小时。
   3. 收集感染后72小时的细胞培养上清液，在4 °C条件下以1,500 × g离心5分钟。
   4. 弃去上清液，用1 mL 0.1 M PBS缓冲液（pH 7.5）将沉淀洗涤两次。
   5. 用1 mL昆虫细胞蛋白提取与裂解缓冲液（材料表）充分溶解细胞沉淀，并在细胞裂解液中加入10%甘油。立即于-80 °C保存。
   6. 使用CAT蛋白的P2病毒储备液重复步骤1.5.1–1.5.5，作为对照组。
      注意：不同蛋白制备实验应重复步骤1.5三次。

2. 基于细胞的 MTT 细胞毒性检测

1. 培养5 mL对数生长期细胞（1.5-2.5×10⁶ 细胞/mL）昆虫Sf9细胞加入完全培养基，置于T25未处理培养瓶中。
2. 将25 µL P1病毒储备液（步骤1.4.14中获得）加入步骤2.1的细胞培养物中，在27 ˚C下轻轻振荡培养48 h。
3. 配制100 mM的氯菊酯标准储备液于乙腈中。取氯菊酯储备液，分别加入500 µL、250 µL、125 µL和62.5 µL至总体积为1,000 µL，用乙腈稀释，得到50 mM、25 mM、12.5 mM和6.25 mM的标准溶液。
4. 将步骤2.2中感染的细胞培养物均匀接种200 µL，加入300 µL完全培养基，接种于24孔板中，细胞密度为2×10⁵⁵ 细胞/毫升
5. 向每个孔中分别加入 4 µL 氯菊酯标准溶液（6.25 mM、12.5 mM、25 mM 和 50 mM），使终浓度分别为 50 µM、100 µM、200 µM 和 400 µM。用于细胞活力计算的孔中仅加入 4 µL 乙腈图3).
6. 用封板膜密封后，于27 °C避光孵育48 h。
7. 配制 5 mg/mL MTT（噻唑蓝四氮唑溴盐）试剂，溶于缓冲液（2.0 g NaCl、0.05 g KCl、0.36 g NaH₂PO₄、0.05 g KH₂PO₄、0.5 g 葡萄糖，用去离子水定容至 1 L，pH 7.4）中₂PO₄∙2H₂O，0.28 g NaH₂PO₄，0.05 g KH₂PO4 溶于 200 mL 蒸馏水，pH 7.5。
8. 从第2.6步中移除细胞培养基，此时已孵育48小时，操作时勿触碰底部贴壁的细胞层。在第2.7步中向每孔加入200 µL MTT试剂。于37 °C孵育4小时，直至每孔中形成深紫色的甲臜沉淀。图3).
9. 37 °C 下孵育 4 小时，直至各孔中形成深紫色甲臜沉淀。加入 500 µL DMSO 以充分溶解沉淀。图3).

图3：MTT实验结果示例。 将表达CAT基因的细胞以500 µL均匀接种于24孔细胞培养板中，接种后48 h加入P1病毒储备液（CAT重组杆状病毒溶液）。分别向每行加入不同剂量的氯菊酯4 µL（6.25 mM、12.5 mM、25 mM和50 mM），使终浓度分别为50 µM、100 µM、200 µM和400 µM。对照组行仅用乙腈处理，并在板上标记为CK。(A) 在27 °C培养48 h后，弃去上层细胞培养基，每孔加入200 µL黄色MTT试剂，然后在37 °C继续孵育48 h。各孔中形成深紫色还原沉淀物，表明存活细胞能够将黄色MTT试剂代谢为深紫色沉淀物。(B) 每孔加入500 µL DMSO溶剂以溶解所形成的沉淀物，使用分光光度计在540 nm处检测各孔的吸光度值。随着氯菊酯浓度增加，颜色逐渐由深红色变为浅红色，表明细胞活力逐渐降低。请点击此处查看该图的放大版本。

10. 将200 µL溶解液转移至96孔板中。使用酶标仪（材料表）在540 nm处测定吸光度值。
11. 通过比较氯菊酯处理细胞与仅用乙腈处理细胞的吸光度值，计算细胞活力。
12. 对于对照组，使用步骤1.4中获得的氯霉素乙酰转移酶（CAT）重组杆状病毒P2病毒原液重复所有步骤。
13. 对不同病毒制备物重复4次。

3. 体外 代谢检测

1. 用乙腈配制100 mM的氯菊酯标准储备液。用乙腈稀释至50 mM、25 mM、12.5 mM和6.25 mM。采用高效液相色谱法（HPLC）检测各浓度下的相应峰面积。根据不同氯菊酯浓度下的峰面积绘制并计算氯菊酯的标准曲线。
2. 采用Bradford法测定步骤1.5中获得的蛋白浓度²¹。
3. 配制700 µL代谢反应体系，其中含40 µM氯菊酯标准品和步骤1.5中获得的1 mg蛋白，溶解于0.2 M Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）中。在30 °C下轻轻振荡孵育2小时，并避光操作。
4. 加入700 µL预冷的乙腈终止反应。继续在30 °C下轻轻振荡孵育30分钟，并避光操作。
5. 将反应混合物在室温下以16,000 × g离心2分钟。收集上清液，并通过0.45 µm滤膜过滤。将滤液转移至超洁净棕色玻璃小瓶中，用于HPLC分析。
6. 在最佳色谱条件下运行HPLC（流动相A：90%乙腈和10%水；流动相B：5%乙腈，用85%磷酸调节pH至2.3）。采用1 mL/min的流速进行梯度洗脱，并在232 nm波长下进行检测。
7. 通过与未添加蛋白样品的反应对照比较，计算氯菊酯的消耗百分比。
8. 使用步骤1.5.6中获得的CAT蛋白作为对照。
9. 在步骤1.5.7中使用不同的蛋白制备样品重复所有步骤。

结果

不同氯氰菊酯处理下的细胞活力（MTT 法）

在MdαE7重组杆状病毒感染的Sf9细胞（实验组）和CAT重组杆状病毒（由杆状病毒感染试剂盒提供）感染的细胞（对照组）中检测了氯氰菊酯的细胞毒性。MdαE7表达细胞对氯氰菊酯耐受性的增强有力地支持了该羧酸酯酶在代谢杀虫剂中的作用，从而保护细胞免受化学损伤。在本研究中，与仅用乙腈处理的细胞相比，计算了不同氯氰菊酯浓度（50、100、200和400 µM）下的细胞存活率。结果显示，当暴露于不同浓度的氯氰菊酯时，MdαE7表达细胞的存活率显著更高（范围为86.00%至101.92%）（图4B），而对照组细胞的存活率较低（范围为67.59%至81.43%）（图4A），表明MdαE7在昆虫细胞中代谢氯氰菊酯方面具有重要作用。

讨论

近几十年来，异源表达系统已被广泛用于表达和分离大量蛋白质，从而实现对酶的生化特性及功能的测定与表征 体外迄今为止，已有多种不同的模型系统，包括 大肠杆菌, Pichia pastoris, Sacccharomyces cerevisiae，以及 草地贪夜蛾 已适用于重组蛋白表达，且表达系统的选择取决于 体外 该系统对于大规模生产目标蛋白至关重要^22,23,24,25在本研究中，我们选用杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统来表达家蝇羧酸酯酶，因为该系统可提供与昆虫细胞相似的细胞内环境，并保留某些重要的真核生物蛋白加工能力⁹尽管杆状病毒介导的表达系统具有诸多优势，但其局限性也应予以关注。杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统只有在昆虫细胞被构建好...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Q5 高保真 DNA 聚合酶	New England Biolabs 公司	M0491L
QIAquick 琼脂糖凝胶回收试剂盒	QIAGEN	28704
pENTR/D-TOPO 克隆试剂盒，含 One Shot TOP10 化学感受态 E. coli	Invitrogen（隶属于 Life Technologies）	K240020	本试剂盒包含S.O.C.培养基和通用M13序列引物。
PureLink HiPure 质粒小提试剂盒	Invitrogen（隶属于 Life Technologies）	K210002
Gateway LR Clonase II 酶混合物用于 BaculoDirectTM 试剂盒	Invitrogen（原life technology）	11791-023
BaculoDirect C端线性DNA转染试剂盒	Invitrogen（隶属于 Life Technologies）	12562-019	本试剂盒包含Cellfectin转染试剂和更昔洛韦
pENTR-CAT 质粒	Invitrogen（隶属于 Life Technologies）		BaculoDirect C-末端线性DNA转染试剂盒内含物，浓度：0.5 ug/uL
经热灭活的认证胎牛血清	Gibco（Life Technologies 公司旗下品牌）	10082-139
Sf-900 III 无血清培养基中的 Sf9 细胞	Gibco（生命技术公司）	12659017
昆虫细胞-PE LB昆虫细胞蛋白提取 &和裂解缓冲液	G Biosciences，隶属于Geno Technology, Inc.	786-411
Sf-900 III SFM (1×无血清完全培养基	Gibco（生命技术公司旗下品牌）	12658-019
Grace's 昆虫细胞培养基，未添加补充物	Gibco（隶属于 Life Technologies）	11595030
氯菊酯（异构体）分析标准品	SUPELCO，隶属于Solutions WithinTM	442748
甲醇（分析纯）	Sigma-Aldrich	67-56-1
乙腈（分析纯）	Sigma-Aldrich	75-05-8
GHP Acrodisc 25 mm 注射器滤器，孔径 0.45 μm GHP 膜（HPLC 认证）	Pall Life Sciences	21890388
Alliance Waters 2695 高效液相色谱系统	沃特斯
T100 热循环仪	伯乐生命科学公司	1861096
Nanodrop 2000/2000c 分光光度计	赛默飞世尔科技	ND2000CLAPTOP
Cytation 5 细胞成像多功能酶标仪	BioTek