方法文章

衣藻中心粒的单颗粒重构分离与荧光成像

DOI：

10.3791/58109

⸱

2018年9月21日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, Sciences III, University of Geneva

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们开发了一种策略，可用于纯化并成像大量处于不同取向的中心粒，适用于超分辨率显微镜和单颗粒平均法分析。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

中心粒是大型大分子复合物，在细胞分裂、细胞运动或细胞信号传导等基本细胞生物学过程中发挥重要作用。Chlamydomonas reinhardtii（一种绿色藻类）已被证明是研究中心粒结构、功能及蛋白质组成的有力模型。尽管在理解中心粒结构方面已取得显著进展，当前的一个挑战仍是确定中心粒组分在中心粒结构区域内的精确定位，以更深入地阐明其在中心粒生物发生中的作用。一个主要限制因素在于荧光显微镜的分辨率，由于中心粒的尺寸接近衍射极限，使得对其内蛋白质定位的解释变得复杂。为解决这一问题，我们提供了一种方法，利用超分辨率显微镜对大量不同取向的C. reinhardtii中心粒进行纯化和成像。由于获取的中心粒数量众多，该技术可通过荧光单颗粒平均法（Fluo-SPA）对数据进行进一步处理。Fluo-SPA可生成不同取向的染色C. reinhardtii中心粒的平均图像，从而有助于将不同蛋白质定位至中心粒的亚结构区域。重要的是，该方法也可应用于成像其他物种的中心粒或其他大型大分子复合物。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

中心粒是一种在进化上保守的细胞器，位于动物细胞中心体的核心位置，在许多真核生物中可作为纤毛或鞭毛的模板，即基体（下文统称为中心粒）1,2。因此，中心粒在从纺锤体组装到细胞信号传导等一系列基本的细胞生物学过程中发挥着关键作用。正因如此，中心粒的组装或功能异常已被证实与多种人类疾病相关，包括纤毛病和癌症3。

中心粒是具有九重对称性的圆柱形结构，由微管三联体构成，通常长约 450 nm，宽约 250 nm4,5,6,7。对来自不同物种的中心粒进行的传统电子显微镜观察和冷冻电子断层扫描显示，中心粒沿其长轴呈极性分布，可分为三个不同的区域：近端区域、中央核心区域和远端区域5,7,8,9,10,11。重要的是，每个区域均表现出特定的结构特征。首先，长约 100 nm 的近端区域腔内含有中心车轮结构，该结构通过钉头元件与微管三联体相连12。其次，长约 300–400 nm 的中央区域腔内存在纤维状密度物质，且在微管内表面具有多种结构特征：Y 形连接体、C 微管尾部和 A 微管残端9。最后，长约 50–100 nm 的远端区域具有亚远端和远端附属结构，环绕在中心粒的远端部分5,13。

过去二十年来，越来越多的中心粒蛋白被发现，目前估计约有100种不同的蛋白质构成中心粒的一部分14,15,16,17。尽管取得了这些进展，这些蛋白质在中心粒内部的精确定位仍不明确，尤其是在结构亚区域中的定位。重要的是，将蛋白质精确定位于中心粒的结构区域，对于更好地理解其功能至关重要。在这方面，C. reinhardtii 的中心粒在两个方面都发挥了关键作用：首先明确了沿中心粒圆柱体分布的不同结构特征9,18,19，随后使研究人员能够通过荧光显微镜将一部分蛋白质的定位与特定亚结构区域相对应。例如，Bld12p 和 Bld10p 蛋白定位于近端区域，特别是定位于中心轮结构20,21,22,23。定位于亚结构的蛋白质列表还包括 POB15 和 POC16，这是两种通过质谱鉴定出的新型蛋白，分布于 C. reinhardtii 中心粒的内侧核心区域17。

本文详细描述了一种用于分离和成像C. reinhardtii中心粒的方法，以便后续进行超分辨率显微镜观察和单颗粒平均分析。为实现这一目标，有必要明确需要克服的技术局限性。首先，中心粒的纯化过程可能影响其整体结构，其中在分离的多个步骤中，车轮状结构（cartwheel structure）常常会丢失9。其次，中心粒的尺寸接近光学显微镜的衍射极限。事实上，共聚焦显微镜的横向分辨率约为200 nm24，与中心粒的直径相近，而z轴方向的分辨率则低约2–3倍，导致成像体积呈现各向异性。第三，抗体标记的异质性以及中心粒取向的多样性可能限制对特定中心粒亚区域中蛋白质定位的准确解析。最后，每个细胞中仅存在两个中心粒，这使得获取大量图像并确定明确的中心粒取向变得困难。为克服这些技术难题，我们开发了一种方法，即对大量具有不同取向的分离中心粒进行超分辨率显微成像。我们将首先介绍一种纯化C. reinhardtii中心粒的方案，该方案能够获得结构完整且包含车轮状结构的中心粒和前中心粒。接着，我们将逐步描述一种将中心粒富集于盖玻片上的方法，以便通过常规或超分辨率荧光显微镜进行成像。这一关键步骤有助于增加在多种取向下成像的中心粒数量。最后，我们将介绍一种在荧光显微镜获取的数据上进行单颗粒平均分析的操作流程，以促进对不同取向中心粒的识别。总体而言，该方法可广泛应用于成像来自不同物种的中心粒或其他大型大分子复合物。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. C. reinhardtii 培养与中心粒分离的培养基制备

  1. 培养基的制备 C. reinhardtii 细胞
    注意：以下步骤描述了1x TAP（Tris-乙酸盐-磷酸盐）培养基储备液的配制方法。
    1. 通过混合250 mL的1 M K2HPO4 (174.2 克 K2HPO4 用蒸馏水定容至1 L）中加入约170 mL 1 M KH2PO4 （136.09 g KH₂PO₄）2PO4 在1 L中）。调节混合物至pH 7。
    2. 将96.8 g Tris、40 mL 磷酸盐缓冲液（pH 7）和40 mL 乙酸混合，用蒸馏水定容至1 L，配制40倍浓缩液A。
    3. 使用16 g NH₄HCO₃配制溶液B（40倍浓缩液）4Cl，2 g CaCl₂2，以及 4 g MgSO₄4。注意小心溶解 CaCl2 分别用蒸馏水溶解后，再加入其他组分。用蒸馏水将溶液定容至1 L。
    4. 配制Hutner微量营养素缓冲液25 如下所示。
      1. 对于 1 L 缓冲液，将每种化合物溶解于指定体积的水中：EDTA 二钠盐（50 g 溶于 250 mL 水中），ZnSO₄4.7H2O（22 g 在 100 mL 中），H3BO3 （11.4 g 溶于 200 mL），MnCl₂2.4H2O（5.06 g，溶于50 mL），CoCl2.6H2O（1.61 g，50 mL），CuSO₄40.5H2O（1.57 g，溶于50 mL），(NH4)6Mo7O24.4H2O（1.10 g 溶于 50 mL），以及 FeSO4.7H2O（4.99 g，溶于50 mL）
        注意：EDTA 应在沸水中溶解，且 FeSO4 应最后准备以避免氧化。
      2. 将除EDTA外的所有溶液混合并加热至沸腾。然后加入EDTA，溶液应变为绿色。待所有成分完全溶解后，将溶液冷却至70 °C。在此温度下，加入85 mL预热的20% KOH溶液（20 g溶于100 mL水）。用室温（RT）蒸馏水定容至1 L。
      3. 在烧瓶中加入棉塞，静置1至2周，每天摇动1次。溶液最初呈绿色，随后变为紫色，并产生红棕色沉淀；使用滤纸除去沉淀，直至溶液澄清。将溶液分装后冷冻，并于-20 °C保存。
    5. 制备1x TAP培养基用于培养 C. reinhardtii 将以下组分混合以制备细胞：25 mL 溶液 A（40 倍浓缩液）和 25 mL 溶液 B（40 倍浓缩液）与 1 mL Hutner 微量元素缓冲液25，用蒸馏水定容至1 L。使用0.4 µm滤器对混合液进行灭菌。
  2. 中心粒纯化的培养基制备
    1. 使用蒸馏水将5%蔗糖溶于10 mM HEPES（pH 7）中，定容至500 mL，配制去鞭毛缓冲液。
    2. 配制250 mL 0.5 M乙酸溶液。
    3. 通过先加入50 mL H₂O，配制250 mL 1 M K-PIPES储存液（pH 7.2）2O以溶解PIPES粉末，然后加入10 N KOH直至溶液开始变澄清。用10 N和1 N KOH滴定至pH 7.2，并用H2O定容至终体积250 mL。2O.
    4. 配制5种蔗糖溶液（质量分数，w/w），具体如下。
      ​注意：所有蔗糖溶液在溶解后均需使用装有0.4 µm滤器的注射器进行过滤。60%和70%蔗糖溶液较难溶解，应置于60 °C预热的水浴中以促进溶解。每10分钟混匀一次，直至蔗糖完全溶解。
      1. 配制25%蔗糖溶液：称取25 g蔗糖，加入10 mM K-PIPES（pH 7.2）并定重至100 g。
      2. 配制60%蔗糖溶液：称取60 g蔗糖，用10 mM K-PIPES（pH 7.2）定容至100 g。
      3. 制备蔗糖梯度所需的蔗糖溶液。称取40 g蔗糖，用10 mM K-PIPES（pH 7.2）定容至100 g，配制40%蔗糖溶液。同样方法配制50%（w/w）和70%（w/w）蔗糖溶液。
      4. 将溶液于 -20 °C 保存。解冻后务必充分重悬蔗糖溶液。
    5. 制备100 mL的 通过混合1 mM HEPES（pH 7）、0.5 mM MgCl制备裂解缓冲液2，以及1% NP-40，置于4 °C保存。该缓冲液须在实验当天新鲜配制。在进行中心粒分离当天加入蛋白酶抑制剂片剂。
    6. 通过将 8 g NaCl、2 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄ 和 0.24 g KH₂PO₄ 溶于 800 mL 去离子水中，用 HCl 调节 pH 至 7.4，定容至 1 L，制备 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）（pH 7.4）。2HPO4，以及 0.24 g KH2PO4 在800 mL蒸馏H2O. 用 HCl 将 pH 调至 7.4，用去离子水定容至 1 L2O.

2. C. reinhardtii 中心粒的分离

注意：见图1。

  1. 培养与扩增 C. reinhardtii 细胞
    1. 在第1天晚上，接种一个 cw15- 从固体培养板中将菌株接种至含有10 mL 1x TAP的培养锥形瓶中。在白色荧光灯（60 µE/m²/s）下培养细胞2在23 °C下孵育2–3天。
    2. 第3天，用1× TAP培养基将培养物稀释10倍（至100 mL），在23 °C光照条件下继续培养细胞2–3天。
    3. 第6天，用1x TAP将培养物稀释10倍，获得1 L培养液。在23 °C光照条件下培养细胞，直至培养物呈深绿色，表明细胞密度约为~1 x 107 cells/mL26 （第9–10天）
  2. 纯化 C. reinhardtii 中心粒
    1. 离心 cw15- 600 × 离心细胞 g 在50 mL锥形管中孵育10分钟。用50 mL 1×PBS重悬细胞沉淀，洗涤1次，然后以600 × g离心。 g 10 分钟。用移液器将沉淀重悬于 100 mL 室温去鞭毛缓冲液中。
    2. 通过磁力搅拌器缓慢滴加0.5 M乙酸，将细胞进行pH冲击去鞭毛处理，直至终pH达到4.5–4.7，随后将细胞孵育2分钟。再缓慢滴加1 N KOH，将pH恢复至7.0。
    3. 以 600 x g 离心细胞 g 孵育10分钟以去除脱落的鞭毛。移除上清液，将沉淀物置于冰上保存。用50 mL预冷至4 °C的1×PBS洗涤沉淀物2次。随后，以600 × g 4 °C 下离心 10 分钟。
    4. 将沉淀重悬于30 mL 1×PBS中，缓慢地将悬液加至20 mL 25%蔗糖垫上层，注意不要混合（图1B).
    5. 以 600 x 离心 g 4 °C下离心15分钟，以去除上清液中残留的鞭毛；将细胞铺在25%蔗糖溶液中图1C）。仅保留最底部的 20 mL（红色箭头， 图1C) 通过使用移液器小心地吸除上清液。
    6. 加入20 mL冷的1×PBS洗涤剩余物。将样品在600 × g下离心 g 4 °C下离心10分钟。将沉淀重悬于10 mL预冷的4 °C 1×PBS中。确保无细胞团块存在，以保证后续裂解步骤能够同时作用于所有细胞。
    7. 将重悬的沉淀转移至一个新的250 mL瓶中。向细胞中加入100 mL裂解缓冲液，该缓冲液需添加5,000单位的DNase。务必注意将裂解缓冲液加入细胞中，而不是相反操作。在4 °C孵育混合物1小时，每15分钟轻轻倒置瓶子混匀，避免产生气泡。
    8. 将裂解的细胞在 600 x g 在4 °C下以50 mL锥形管离心10分钟，以去除任何细胞碎片。若裂解操作正确，细胞沉淀应呈白色（图1D）。用移液器收集上清液，并将其加入预置于冰上的含有60%蔗糖垫的30 mL圆底管中。随后，以10,000 x g 4 °C 下孵育 30 分钟。
      注意：若干个圆底管（材料表可能需要根据上清液的体积来决定。
    9. 吸去上清液，保留约1 mL上清液在蔗糖垫上方。注意观察剩余1 mL上清液与2 mL蔗糖垫之间的黄色界面。用剪去尖端的P1000吸头轻轻混合蔗糖垫和剩余上清液。此步骤切勿涡旋，否则可能导致前中心粒在此阶段丢失。将所有蔗糖垫混合后置于冰上保存。
    10. 在4 °C下，将3 mL 70%蔗糖溶液轻柔加入薄壁38.5 mL聚丙烯管中，随后加入3 mL 50%蔗糖溶液，最后加入3 mL 40%蔗糖溶液，制备40%–70%蔗糖梯度。将合并的界面组分缓慢加至40%–70%蔗糖梯度上，操作需缓慢，因低温蔗糖溶液黏度较高。用10 mM K-PIPES缓冲液（pH 7.2）平衡离心管，并在68,320 × g (例如，使用SW32Ti转子在4 °C下离心1小时15分钟。
    11. 在4 °C条件下，使用0.8 mm针头在管底打孔，收集12份500 µL组分，操作时避免扰动不同的蔗糖层。用剪去尖端的P200移液枪头从每份组分中额外取出10 µL等分试样，用于后续免疫荧光实验。将各组分在液氮中速冻。
      注意：可通过电子显微镜分析分离的中心粒，以确保中心粒的整体超微结构得以保存。

3. 盖玻片上分离中心粒的定量：离心与免疫荧光

注意：参见图2。

  1. 准备试管和盖玻片
    1. 每个组分使用1个玻璃圆底试管（15 mL）来分析中心粒组分（共12个试管）。
    2. 将一个定制的盖玻片支撑适配器（以下简称适配器）放入圆底管中。将一片无菌的12 mm盖玻片放入圆底管内。
      注意：此处我们使用了12 mm的盖玻片，但该方案也可适用于18 mm的盖玻片，此时需使用30 ml的圆底管。
    3. 加入5 ml预冷的10 mM K-PIPES缓冲液（pH 7.2，4 °C）。确保盖玻片未漂浮，并紧贴在适配器上。将试管置于冰上。
  2. 中心粒的离心分离
    1. 将每份10 µL组分用100 µL冰冷的10 mM K-PIPES（pH 7.2）稀释。充分重悬稀释液，直至蔗糖完全消失图2A将每份稀释后的组分加入圆底管中。
    2. 将离心管在10,000 x g 10 分钟（例如，使用JS-13.1水平转子，在4 °C下离心。
    3. 使用自制的钩状工具插入适配器槽口边缘的孔中，轻轻上提，取回盖玻片。
      注意：手工制作的钩状装置可用注射器针头手工弯折成钩状，并固定在自制的棒状物上图2B-2D).
    4. 当移至圆底管顶部时，用戴手套的手指固定适配器边缘，用镊子取下盖玻片。注意记住盖玻片哪一侧含有中心粒。随后对盖玻片进行免疫荧光处理。
  3. 免疫荧光染色与分离样本的成像 C. reinhardtii 中心粒
    注意：参见 图2.
    1. 按如下步骤准备免疫荧光染色所需的材料。
      1. 在聚苯乙烯晶体透射实验盒（长60 mm，宽50 mm，高43 mm）中准备一个盖玻片染色架，加入100%甲醇，并于-20 °C保存。
      2. 准备一个湿盒。为此，将浸过水并湿润的纸巾沿方形培养皿内壁边缘放置，组装成湿盒（图2E）。加入一片实验室密封膜（参见 材料表将抗体混合物置于免疫荧光实验步骤（3.3.2–3.3.3）中使用的培养皿中央。用铝箔覆盖皿盖和湿盒，以避光。
    2. 按如下步骤对分离的中心粒进行免疫染色。
      1. 在离心后（步骤 3.2.4），立即将含有中心粒的盖玻片放入装有 -20 °C 甲醇的容器中孵育 5 分钟，以固定盖玻片（步骤 3.3.1.1）。
      2. 用镊子取下盖玻片，并将其放入透明实验盒中（参见 材料表用50 mL 1×PBS填充，并在室温下洗涤5分钟。
      3. 在湿盒内的实验室封膜上滴加60 µL一抗混合液（将一抗用含1%牛血清白蛋白（BSA）和0.05% Tween-20的PBS稀释）。小心将盖玻片盖在抗体混合液滴上，使中心粒正对液滴。在湿盒中于室温孵育45分钟。
        注意：用于获得代表性结果的一抗为兔多克隆 Bld12 抗体（1:300）和小鼠 α-微管蛋白抗体（DM1A）（1:300）。
      4. 移除盖玻片，并按照步骤 3.3.2.2 中所述，用 1× PBS 洗涤 5 分钟。将盖玻片在含有 1% BSA 和 0.05% Tween-20 的 PBS 中与二抗孵育 45 分钟。
        注意：用于获得代表性结果的二抗为 Alexa 488 标记的山羊抗小鼠抗体（1:1,000）和 Alexa 568 标记的山羊抗兔抗体（1:1,000）。
      5. 按照步骤 3.3.2.2 中所述，取出盖玻片并在 1x PBS 中洗涤 5 分钟。
    3. 在载玻片上滴加3 µL封片剂，将盖玻片小心地覆盖于其上（中心粒面向封片剂），完成盖玻片的封固。用指甲油密封盖玻片边缘。
    4. 使用63倍油镜（数值孔径1.4）在共聚焦显微镜下对分离的中心粒进行成像，同时应用去卷积处理27 （参见 材料表).
      注意：此处使用的设置为：Alexa 488 采用 500–545 nm，Alexa 568 采用 580–635 nm。

4. 将中心粒浓缩至盖玻片中央

注意：参见图3。

  1. 材料准备
    1. 在冰上准备一个15 mL玻璃圆底管、一个定制的盖玻片支撑适配器（以下简称适配器，.stl文件作为补充文件1提供）、一个定制的浓缩器（.stl文件作为补充文件2提供），以及4 °C的10 mM K-PIPES（pH 7.2）缓冲液。
    2. 准备多聚-D-赖氨酸（PDL）包被的盖玻片。用H2O将1 mg/mL的PDL储备液稀释至10倍浓度。首先用70%乙醇清洗盖玻片，去除乙醇后让盖玻片自然干燥。用PDL包被盖玻片，并在室温下孵育30分钟。用去离子水洗涤盖玻片3次，然后让其干燥。
      注意：使用PDL包被盖玻片可增加附着于盖玻片上的孤立中心粒数量。
  2. 离心
    1. 将一片无菌的12 mm盖玻片放置在浓缩器凹陷的底端，确保PDL涂层朝下。将适配器直接置于盖玻片上方进行封盖。将圆底管倒置，并套在浓缩器、盖玻片和适配器的外部。
    2. 用镊子轻轻推动整个组件，直至其到达圆底管底部，然后将管子翻转。向圆底管中加入10 mM K-PIPES缓冲液（pH 7.2），直至液面达到浓缩器顶部。确保浓缩器中央圆柱体内无任何气泡残留。
    3. 向含有富集中心粒组分的一个等分试样中轻轻加入100 µL的10 mM K-PIPES缓冲液（pH 7.2），并充分混匀。
    4. 从浓缩器的中空中心区域移除100 µL的10 mM K-PIPES缓冲液（pH 7.2），然后向该中空中心区域加入100 µL用10 mM K-PIPES缓冲液（pH 7.2）悬浮的富集中心粒组分，注意保持内容物位于中空中心区域内。
    5. 在预冷至4 °C的离心机中，以10,000 x g离心10分钟（例如，使用JS-13.1摆桶转子）。
    6. 用镊子取出浓缩器。
    7. 将自制的钩状工具插入适配器槽边的小孔中，轻轻上提以回收盖玻片。当适配器升至圆底管顶部时，用戴手套的手指固定适配器边缘，再用镊子取出盖玻片。操作时请注意记住盖玻片哪一侧含有中心粒。随后进行免疫荧光处理。
      注意：该自制钩状工具可通过手动弯曲注射器针头并将其固定在自制手柄上制成（图2B-D）。
    8. 对浓缩后的中心粒进行固定及免疫荧光染色，操作步骤同3.3.2–3.3.4步。

5. 单颗粒平均法

注意：见图4。

  1. 单颗粒平均成像
    1. 使用常规抗荧光淬灭封片剂将盖玻片封固于载玻片上。采用CFI Apochromat TIRF物镜（100倍，数值孔径1.49，工作距离0.12 mm）和背照式EM CCD相机进行结构照明显微成像（2D SIM）。
      注意：采集时间设置为100 ms，相机读出速率为3 MHz。SIM成像使用了2.5倍镜头。
      注意：此处展示的数据集是在3-D SIM显微镜上获取的（参见 材料表).
    2. 通过设置Z轴层扫的顶部和底部位置分别位于中心粒信号的上方和下方，获取包含完整中心粒信号的大量图像堆栈，以成像中心粒。随后对图像堆栈进行投影，并按照步骤5.2和5.3进行单颗粒平均分析。
  2. 图像堆栈的投影
    1. 使用 ImageJ 打开图像堆栈，然后点击“图像 → 图像组 → Z 轴投影。将投影类型设置为“最大强度'.
    2. 单击“反转图像”以反转图像编辑 → 反转'保存生成的投影图像（.tif 格式）。
  3. 使用 Scipion 进行单颗粒分子影像对齐
    1. 在 Scipion 中通过按下红色的“新建项目”按钮来创建一个新项目创建项目' 页面顶部的按钮。在左侧面板中，双击“导入 → 导入显微图像'.
    2. 填充“文件目录' 和 '模式 根据数据目录和名称设置字段。保持默认参数。点击 执行.
    3. 双击 颗粒 → 拾取 → xmipp3 - 手动拾取（步骤 1）. 点击靠近该位置的放大镜图标 输入显微图像 领域并选择步骤 5.3.1 中导入的显微照片。点击 执行.
    4. 在新打开的窗口中，通过单击不同显微照片中的颗粒来选择它们。完成每张显微照片的选取后，点击红色按钮 + 坐标.
    5. 双击 颗粒 → 提取 → xmipp3 - 提取颗粒. 点击靠近该位置的放大镜图标 输入坐标 字段并选择步骤 5.3.4 中选取的坐标。填充 粒子盒尺寸（像素） 根据颗粒的尺寸。在 预处理 选项卡，设置去尘：否（可能产生伪影）；反转对比度：否（黑色颗粒，白色背景）；相位翻转：否（与CTF校正相关）；归一化：是。
    6. 然后，单击 执行工作完成后，通过选中该任务的方框（边框会变粗）并点击“分析结果 （主菜单左下角）
    7. 双击 二维 → 对齐 → xmipp3 - 使用 cl2d 进行对齐. 点击靠近该位置的放大镜图标 输入颗粒 区域并选择步骤 5.3.5 中提取的颗粒。不要使用参考图像。点击 执行.
    8. 双击 2D → 对齐 → 更多 → xmipp3 - 应用2D对齐. 点击靠近该位置的放大镜图标 输入颗粒 区域并从步骤 5.3.7 中选择已比对的颗粒。
    9. 点击 执行 如步骤5.3.6所述。可通过点击检查结果 分析结果 选择工作框后。
    10. 双击 颗粒 → 掩膜 → xmipp3 - 应用2D掩膜.
    11. 点击靠近的放大镜图标 输入颗粒 领域，并从步骤 5.3.9 中选择已对齐的粒子。该 掩模源 设定为 几何学。然后，将掩膜参数设置为：掩膜类型：圆形；半径（像素）：寻找一个周围无其他结构的单个颗粒（一个中心粒），点击“魔棒 左侧的图标，打开窗口以帮助找到最佳数值；中心偏移：否（如果颗粒完全居中）或是（如果颗粒发生偏移）；X轴中心偏移：根据颗粒位置确定；Y轴中心偏移：根据颗粒位置确定。点击 执行.
    12. 使用 分析结果 按钮以检查掩膜是否正确应用。若未正确应用，请右键单击 应用二维掩膜 工作与选择 编辑. 调整掩膜的参数（大小和/或位移），然后重新运行 执行 按钮
    13. 双击 2D → 分类 → xmipp3 - cl2d.
    14. 点击靠近的放大镜图标 输入颗粒 区域，并从步骤 5.3.11 中选择已掩膜的颗粒。类别数量应设置为每类约获得 50 个颗粒。点击 执行.
    15. 通过点击检查结果 分析结果 按钮。在打开的窗口中，点击 眼 紧邻右侧的图标 "展示内容".
    16. 新窗口允许通过选择来检查生成的类 二维分类 在 块 菜单。通过选择查看每个课程的内容 Class00N_颗粒 在同一菜单中，检查每个类别，确定哪些类别仅包含不良颗粒。然后返回到 二维分类 通过点击各个类别来查看并选择包含优质颗粒的类别。可通过按住键位同时选择多个类别 Ctrl 选择期间按下的键
    17. 当所有包含优质颗粒的类别被选中后，点击 + 颗粒 创建一个包含这些颗粒的子集。
    18. 在同一窗口中，选择几组代表颗粒不同取向的类别。通过点击创建新的子集 + 平均值.
    19. 针对所选的每种取向/平均方式，执行以下步骤。
      1. 双击 2D → 对齐 → xmipp3 - 使用 cl2d 进行对齐.
      2. 点击靠近的放大镜图标 输入颗粒 领域并从步骤 5.3.17 中筛选出优质颗粒。设置 使用参考图像 到 是. 点击靠近该位置的放大镜图标 参考图像 字段并点击其左侧的白色箭头 创建子集 从步骤5.3.18中选择作业，并选取图像用作参考。双击某个对象，可在单独窗口中打开以查看该对象的具体信息。单击 执行.
      3. 双击 2D → 对齐 → 更多 → xmipp3 - 应用2D对齐. 点击靠近该位置的放大镜图标 输入颗粒 选择第5.3.19.2步中已比对的粒子。
      4. 点击 执行.
      5. 检查比对结果（'分析结果）；它将显示比对后的颗粒及其平均图像。
      6. 如果平均结果良好且所有颗粒的取向一致，单击以保存该平均结果 高级 → ImageJ 使用 ImageJ 保存图像。
      7. 如果平均结果可以改进，则选择所有取向良好的图像，并创建一个新的子集 + 颗粒 按钮。重复步骤 5.3.19.1–5.3.19.4，直至子集被清理完毕（所有不良颗粒已被去除）。每次执行比对（步骤 5.3.19.2）时，均将参考图像设为上一轮生成的平均图像（随着迭代进行，平均图像的质量逐步提高）。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. reinhardtii 中心粒的分离：
为了分离中心粒，将 cw15- C. reinhardtii 细胞在光照条件下液体培养数天，随后在 600 × g 离心 10 分钟以收集细胞沉淀。将细胞沉淀用 PBS 洗涤一次，并重悬于去鞭缓冲液中，通过加入 0.5 M 乙酸将 pH 值调节至 4.5–4.7，进行 2 分钟的 pH 冲击以诱导去鞭（图 1A）。随后加入 1 N KOH 将 pH 恢复至 7.0。为了将脱落的鞭毛与细胞体分离，先将去鞭后的细胞进行离心，以去除大部分鞭毛。将沉淀用 PBS 洗涤两次，并重悬于 30 mL PBS 中，然后缓慢加至 25% 蔗糖垫上（图 1B）。在 4 °C 下以 600 × g 离心 15 分钟，以去除大部分脱落的鞭毛。离心后，细胞体分布在蔗糖垫中（图 1C），通过移除约 30 mL 上清液（至 图 1C 中红色箭头处）回收细胞体。将所得的 20 mL 洗涤后细胞重悬于 20 mL 冷 PBS 中，并在 600 × g 离心 10 分钟。接着弃去上清液，将细胞完全重悬于 10 mL PBS 中。将细胞转移至 250 mL 瓶中，并立即向重悬的细胞中加入裂解缓冲液。加入 DNase 后在 4 °C 下孵育 1 小时。经过一次离心以去除细胞碎片（见 图 1D 中的白色沉淀）后，收集上清液并小心地加至 2 mL 60% 蔗糖垫上，随后在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 30 分钟。注意，对于 100 mL 裂解液，此步骤使用了 8 个 15 mL 离心管，每管加载 12.5 mL 裂解液至 2 mL 蔗糖垫上。离心后，移除上清液至距蔗糖垫上方 1 mL 处。将剩余的 1 mL 上清液与 2 mL 蔗糖垫一同收集，混合并合并，最终获得 24 mL 混合液。将该混合液加至 40%、50%、70% 蔗糖梯度中，在 4 °C 下以 68,320 × g 离心 1 小时 15 分钟。最后，通过用针在离心管底部打孔的方式收集分离出的中心粒，并将滴出液分装为 12 × 500 µL 的组分。由于不同浓度蔗糖的密度较高，初始阶段（70% 蔗糖）液滴形成非常缓慢，随后逐渐加快（40% 蔗糖）。

分离中心粒的免疫荧光染色
为了评估分离步骤的质量，将每份收集的梯度组分各取 10 µL，使用盖玻片支撑适配器离心至盖玻片上（图 2A-2D）。重要的是，为安全移除盖玻片，专门设计了一种带钩的定制工具（图 2B）。随后，通过免疫荧光对盖玻片进行分析。本研究中使用了针对 CrSAS-6（Bld12p）的抗体以指示中心粒车轮结构的存在，以及针对 α-微管蛋白（DMA1）的抗体以标记中心粒壁。通过计数每个视野中同时表达 CrSAS-6 和 α-微管蛋白的中心粒数量，并计算各组分中中心粒的总数，可确定哪些组分富含分离的中心粒（图 2F-2H）。有趣的是，有 6 个组分富含中心粒（图 2F 和 2G，第 #1–6 组分），其中第 #3 组分达到峰值，而最后几个组分则无此富集现象，表明纯化过程成功。需注意，在本实验中，第 #3 组分中 95% 的中心粒对 CrSAS-6 和 α-微管蛋白呈阳性反应，说明大多数分离得到的中心粒保留了其车轮结构。若在前几个组分中未观察到中心粒的富集，则表明分离步骤失败，需重复实验。需注意，部分鞭毛碎片主要出现在不含中心粒的组分中。

接下来，为计算每微升（µL）中的中心粒总数，应将每个视野中的中心粒数量乘以图2H中所示的比例。然后将所得数值除以用于免疫荧光实验的样品体积，从而获得每微升中的中心粒数量。在本项特定的分离流程中，富集程度最高的组分在0.00846 mm2面积内含有约37个中心粒（视野大小为92 × 92 µm2）。离心管截面半径为7.5 mm，总表面积为176 mm2。因此对应的比例为176 / 0.00846 = 20,803.8，即在10 µL样品中共计含有769,740个中心粒（37 × 20,803.8）。因此，每1 µL样品中的中心粒数量为76,974个。

在盖玻片上浓缩分离的中心粒：
增加每个视野中的中心粒数量，可提高检测到明确中心粒取向的概率，同时也增加了检测到相似取向的可能性，这些相似取向可用于后续的颗粒平均分析。由于来自浓缩组分的中心粒在盖玻片上仍然较为稀疏，我们开发了一种离心辅助装置，用于将中心粒富集到盖玻片中央（图3A），该装置称为浓缩器。请注意，本文随附提供了用于3D打印的精确尺寸.stl文件。

首先，将一个12 mm的盖玻片安装在浓缩装置上（图3B）。将适配器置于盖玻片上方，倒置圆底管并套在已组装的适配器和浓缩装置上。随后轻轻翻转圆底管，以便加入样品（方案步骤4.2）。接着在4 °C条件下以10,000 × g 离心10分钟，使中心粒沉淀。之后对中心粒进行免疫荧光染色，标记CrSAS-6/Bld12p和α-微管蛋白（图3C-3E）。重要的是，未使用浓缩装置时，每个视野中约可见30个中心粒（图3C），而使用浓缩装置后，每个视野中可见约183个中心粒（图3D-3F）。需要注意的是，中心粒仅分布在盖玻片中央直径为4 mm的圆形区域内。该结果表明，浓缩步骤有效，可在盖玻片的特定区域实现中心粒约6倍的富集，从而显著提高其检测与成像的便利性。

分离的C. reinhardtii中心粒的荧光单颗粒平均成像：
本实验中，使用可达到约120 nm分辨率的SIM显微镜，对中心粒微管中存在的微管蛋白修饰——单谷氨酰化微管蛋白（GT335抗体标记，图4）进行成像24。C. reinhardtii中心粒长约500 nm，通常以成对形式存在，并常伴有新复制的前基体（下文简称前中心粒）以及条纹状微管相关纤维19。因此，该完整组装结构的尺寸约为1 µm。鉴于此，并为了完整成像整个中心粒结构，我们建议对分离的中心粒采集Z轴层扫图像。

采集图像后，使用 ImageJ28 进行最大强度投影生成最终图像（图像/堆栈/Z 投影/最大强度投影，图 4B）。基于此类图像，利用冷冻电子显微镜软件对单颗粒进行分析，将具有相似取向的中心粒归类，随后进行平均化处理。具体操作中，首先对图像颜色进行反转，以便更清晰地观察目标结构（图 4C）。使用免费开源的 Scipion 软件29 手动选取颗粒，每个颗粒以中心点为基准划定选区框，该软件集成了包括 Xmipp3 在内的多种电子显微镜分析程序（图 4D）。需注意，选区框的尺寸需由用户自行设定。本研究中，采用的选区框大小为 50 × 50 像素，对应像素尺寸为 31.84 nm。随后，提取所有颗粒（图 4E），并使用 Xmipp3 进行对齐（图 4F）。接着，应用半径为 12 像素的圆形掩膜，以将各个中心粒从中心粒成对结构中分离出来（图 4G）。然后利用 Xmipp3 对颗粒进行分类，生成多个平均图像。仅保留均一性良好的类别平均图像，即手动剔除与类别平均图像差异较大的颗粒。该步骤重复进行，以针对每种选定取向生成接近完美的平均图像。经过五次迭代后，最终获得两类平均图像：一类为 63 个对象的单谷氨酰化中心粒顶面视图（图 4H），另一类为 98 个颗粒的侧面视图（图 4I）。通过测量单谷氨酰化信号强度分布曲线中峰之间的距离，确定目标结构的尺寸。

重要的是，侧视图类别平均长度为 260 nm，直径为 250 nm，与单谷氨酰化微管蛋白信号的测量结果相当，后者被证明定位于中心粒核心区域内长度为 286 ± 33 nm 的区域17。

Centrifugation process; diagram; sucrose gradient; cell fractionation; sedimentation analysis.
图1: 纯化 C. reinhardtii 中心粒 (A这是获得分离产物的每一步的示意图 C. reinhardtii 中心粒。它包含该方案的代表性步骤（B) 之前和（C) 经离心后在25%蔗糖梯度中的位置。图中红色箭头指示 C 表示离心后应保留的最小体积。D此图显示离心后裂解细胞的白色沉淀，黑色箭头指示沉淀位置。 请点击此处以查看此图的放大版本。

色谱过程示意图、实验装置、梯度定量结果、数据分析。
图2： 用于对分离的中心粒进行免疫荧光的离心装置。（A）收集的每种组分各取10 µL，首先在100 µL的10 mM K-PIPES（pH 7.2）中稀释。（B）此为离心装置的示意图，包括一个15 mL圆底管、一片12 mm盖玻片、一个盖玻片适配器，以及一个定制的带钩装置，用于离心后回收盖玻片。图C和D为示意图，说明离心后如何回收盖玻片。（C）将带钩工具插入适配器槽边的孔中，并（D）轻轻拉出。（E）此为进行免疫荧光成像所需的湿室照片。箭头指示12 mm盖玻片的位置。（F）此为纯化过程中收集的梯度组分#1-8在63X（放大2倍）下的代表性共聚焦图像，染色标记为CrSAS-6（红色）和α-微管蛋白（绿色）。插图为低倍镜图像中白框所示区域的放大。比例尺 = 10 µm。（G）此图为各组分中每视野内同时表达CrSAS-6和α-微管蛋白的中心粒数量的统计图。注意组分#1-6中的富集情况。各组分每视野平均中心粒数量：#1 = 16.3 ± 4.7，#2 = 24.0 ± 4.6，#3 = 37.0 ± 17.0，#4 = 23.3 ± 11.4，#5 = 14.3 ± 2.1，#6 = 13.7 ± 9.3，#7 = 2.7 ± 1.2，#8 = 1.0 ± 0.0，#9 = 1.0 ± 0.0，#10 = 0.0 ± 0.0，#11 = 0.3 ± 0.6，#12 = 0.0 ± 0.0。对每个组分随机拍摄3个视野。注意，在计数富集程度最高的组分#3时，发现95%的中心粒同时表达CrSAS-6和α-微管蛋白（n = 205个中心粒）。（H）通过显微图像测量区域内的中心粒数量比例，可计算出整个管壁区域内的总中心粒数量。根据最初离心的10 µL组分，可进一步计算每微升中的中心粒数量。请点击此处查看本图的放大版本。

盖玻片浓缩装置示意图及显微镜结果；可视化蛋白质浓度增加。
图3：使用浓缩装置对分离的中心粒进行离心浓缩。（A）本图展示了在免疫荧光染色前将中心粒浓缩至盖玻片所需的离心装置，包括一个15 mL圆底管、一个浓缩装置、一个12 mm盖玻片以及一个支撑适配器装置。（B）本图展示了离心装置的组装步骤。图C–E显示了中心粒的共聚焦图像，分别用CrSAS-6（红色）和α-微管蛋白（绿色）染色：（C）未使用浓缩装置，或（D–E）使用浓缩装置。插图为低倍镜图像中白色方框所示区域的放大。比例尺为10 µm。请注意，中心粒在盖玻片中央区域富集（虚线表示浓缩区域的边界）。（F）该图展示了使用与未使用浓缩装置时每视野中心粒数量的比较。共分析了五个随机视野。未使用浓缩装置时，平均每视野中心粒数为29.8 ± 2.9；使用浓缩装置时为182.6 ± 11.5，P <0.0001。统计学显著性通过非配对t检验进行评估。请点击此处查看该图的放大版本。

单谷氨酰化过程；颗粒分析示意图；显微镜；颗粒比对与分类。
图 4： 对分离的 C. reinhardtii 中心粒进行单颗粒平均分析。（A）该图显示了使用SIM显微镜获取的、经GT335染色的中心粒Z轴层扫图像。（B）这些图显示了层叠图像的最大强度Z轴投影。比例尺 = 1 µm。（C）这些图显示了一张代表性图像，其对比度已反转。插图为局部放大图，以便更清晰地观察中心粒。（D）这些图显示了颗粒挑选结果。插图说明了颗粒的挑选方式。（E）这些是5个提取出的颗粒示例。（F）该图显示了颗粒比对后的结果。（G）该图显示了应用掩膜处理后的颗粒。（H）和（I）两图展示了两个分类平均结果：（H）顶视图（63个颗粒）和（I）侧视图（98个颗粒）。双箭头表示GT335信号的尺寸。比例尺 = 250 nm。请点击此处查看此图的放大版本。

补充文件 1. 请点击此处下载该文件。

补充文件 2. 请点击此处下载该文件。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

生物学中的一个挑战是解析蛋白质在结构背景下的精确定位。中心粒是应用这些方法的理想结构，因为其结构已通过冷冻电子断层扫描技术进行了研究，揭示了沿其长度方向有趣的超微结构特征。然而，由于其中心粒的尺寸接近光学显微镜的分辨率极限，使用常规显微镜通过免疫荧光技术将蛋白质精确地定位到中心粒的特定结构亚区域十分困难30。

光学显微镜的分辨率受限于光的衍射效应，其横向最大分辨率约为200 nm24。然而，过去20年光学显微镜领域的一项重大突破——超分辨率成像技术的发明，已经突破了这一限制。这些方法能够在不同分辨率水平上实现超越衍射极限的成像：SIM的分辨率为120 nm，受激发射损耗显微镜（STED）约为50 nm，单分子定位显微镜（SMLM）则达到20–40 nm24。随着超分辨率显微技术的最新发展，中心粒的结构亚区域已可被清晰观察。然而在实际应用中，由于每个细胞中仅存在两个成熟中心粒，且其空间取向随机，导致难以准确判断蛋白质在特定结构元件上的定位。为解决这一问题，本研究建立了一种实验方案，使研究人员能够通过超分辨率成像大量中心粒，从而提高观察到明确取向结构的概率。尤为重要的是，由于该方法依赖于分离的中心粒样本，我们提供了一种纯化完整C. reinhardtii中心粒的方法，其中包含成熟中心粒和前中心粒。

最后，由于本方案能够对多种朝向的中心粒进行成像，因此可利用电子显微镜软件进行单颗粒分析，从而生成特定朝向下中心粒的平均类别图像。重要的是，这些获得的二维图像可用于评估特定蛋白质在中心粒上的定位。事实上，该方法也可应用于双色超分辨率图像，其中一种颜色用于显示中心粒骨架（例如，微管蛋白），另一种颜色则对应于某一特定的中心粒蛋白。通过减去单色或双色获得的平均图像，可以更清晰地判断蛋白质在中心粒上的位置（近端、中央或远端）。需要注意的是，两个通道必须精确对齐，以避免产生误导性解释。此外，顶视图的平均图像有助于解析蛋白质是定位于中心粒腔内、微管壁上，还是中心粒外部。

该方法的优势在于能够确定特定蛋白质的定位，而这些蛋白质可能因标记不均一而难以通过其他方法进行定位。需注意，已有其他方法被用于在中心粒内进行蛋白质定位，例如通过相关联的三维结构光照明显微镜/单分子定位显微镜（3-D SIM/SMLM）技术，利用SIM成像确定围绕中心粒呈环状结构的标记物的椭圆轮廓，从而评估中心粒的特定取向。利用这一参数，可实现精度达4–5 nm的蛋白质定位30。还需注意，本文所述方法使用的是带有完整前中心粒的分离中心粒，这表明中心粒结构很可能在很大程度上得以保留。然而，我们不能排除在纯化过程中某些结构特征受到干扰的可能性，例如中心粒直径可能随二价阳离子浓度变化而改变，这一点在人中心体的分离过程中已被放大证实5。

本方案中的一个关键步骤是获得足够浓度且具有不同取向的分离中心粒，以适用于Fluo-SPA。为此，首先应确保中心粒分离步骤的纯度和效率。若分离得到的中心粒浓度过低，将影响成像质量以及后续的图像处理。为提高每视野内的中心粒数量，我们提供了一种富集方法。根据所用组分中中心粒的数量，应调整加载至浓缩装置中的体积，最大体积不超过250 µL。

重要的是，该方法是针对无细胞壁的 cw15- C. reinhardtii 细胞开发的。在这种品系中，细胞壁的脆弱性使得细胞能够充分裂解，从而释放其内容物。本方案对于野生型 C. reinhardtii 细胞效率较低，因为细胞壁会阻碍有效的细胞裂解。因此，在应用本文所述的分离方案之前，需采用其他策略，例如超声处理或用自溶素（autolysin）对细胞进行预孵育——这是一种能够降解细胞壁的酶31，以预先改变细胞壁结构。

该装置可与多种类型的显微镜联用，从常规共聚焦显微镜到专用于高通量超分辨率成像的显微镜均可适用。需要注意的是，在进行单分子定位显微镜（SMLM）实验时，必须使用特殊的成像缓冲液，因此应采用适用于直径12 mm盖玻片且缓冲液位于盖玻片上方的成像腔室。后续成像将使用倒置显微镜进行。如果显微镜系统不支持12 mm盖玻片，本方案也可通过使用30 mL圆底管以及改进的适配器和浓缩装置应用于18 mm盖玻片。还需特别注意，SMLM最终重建图像的质量取决于染色质量、所用一抗的质量以及固定方法。

总之，我们提供了一种可用于成像大量中心粒的方法，随后通过Fluo-SPA获得不同取向中心粒的平均结构，从而实现对中心粒蛋白的精确定位。重要的是，该方法可更广泛地应用于来自其他物种的分离中心粒、其他细胞器或大型大分子复合物。最后，本文所展示的样品制备方法，结合近期开发的用于荧光单分子定位显微镜（SMLM）数据单颗粒分析的新算法32，有望进一步提升对大型大分子复合物分子图谱的解析能力。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢瑞士洛桑联邦理工学院（École Polytechnique Fédérale de Lausanne, EPFL）生物成像与光学平台（BioImaging & Optics Platform, BIOP）的 Pierre Gönczy 及其团队，本研究中的中心粒 SIM 图像在此获取。Nikolai Klena 和 Davide Gambarotto 由欧洲研究理事会（European Research Council, ERC）启动基金（StG）715289（ACCENT）资助；Maeva Le Guennec、Paul Guichard 和 Virginie Hamel 由瑞士国家科学基金会（Swiss National Science Foundation, SNSF）项目 PP00P3_157517 资助。Susanne Borgers 由日内瓦大学资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
小鼠单克隆抗α微管蛋白抗体（克隆 DM1A）Abcamab7291 稀释比例 1:300
DNaseIRoche10104159001
12 mm 盖玻片RothYX03.1
18 mm 盖玻片RothLH23.1
K2HPO4Fluka60355
KH2PO4Fluka60230
Tris 碱Biosolve Chimie SARL0020092391BS
乙酸Carlo Erba Reagents524520
NH4ClSigmaA-4514
CaCl2SigmaC-7902
MgSO4Sigma63140-500G-F
无菌滤器MilliporeSCGPT05RE
蔗糖SigmaS7903-1KG
HEPESAppliChem PanReacA3724,0250
PIPESSigmaP6757-500G
MgCl2ACROS ORGANICS197530010
NP-40AppliChem PanReacA1694,0250
圆底（Kimble）离心管 15 mLFisherscientific09-500-34
圆底（Kimble）离心管 30 mLFisherscientific09-500-37
盖玻片染色架Thomas scientific8542E40
透明聚苯乙烯透射实验盒FISHERS11712944
甲醇VWR20864.32
BSARoche10735086001
Triton X100Roth3051.3
与 Alexa 488 偶联的山羊抗小鼠二抗 invitrogenA11029稀释比例 1:1,000
与 Alexa 568 偶联的山羊抗兔二抗invitrogenA11036稀释比例 1:1,000
封片剂abcamab188804
薄壁聚丙烯离心管Beckman Coulter326823
聚-D-赖氨酸 1 mg/mLSIGMA A-003-E
小鼠单克隆抗多聚谷氨酰化修饰抗体（GT335）AdipogenAG-20B-0020稀释比例 1:1,000
含 DAPI 和 DABCO 的甘油封片剂Abcamab188804
50 mL 锥形离心管Falcon14-432-22
Eppendorf 5810R 离心机Eppendorf5811000622
Beckman JS-13.1 摆动桶转子Beckman Coulter346963
Beckman SW 32Ti 转子Beckman Coulter369694
Parafilm 封口膜Bemis 13-374-10
Leica TCS SP8 共聚焦显微镜（配备 Hyvolution 模式）Leica 
OSRAM L18W/954 LUMILUX Luxe Daylight/ OSRAM
Whatman 滤纸Sigma WHA1001325
CrSAS-6/Bld12 抗体稀释比例 1:300（Hamel 等, 2014）
Scipionhttp://scipion.i2pc.es/
EM CCD 相机（Andor iXON DU897）Andor

参考文献

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