犬尿氨酸通路（KP）神经活性代谢物的改变与精神疾病相关。研究犬尿氨酸通路代谢异常的功能性后果 体内 在啮齿类动物中可能有助于阐明新的治疗策略。本方案结合生化与行为学方法，研究急性犬尿氨酸刺激对大鼠的影响。
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摘要
摘要
犬尿氨酸通路（KP）是色氨酸降解的重要途径，已被证实与精神疾病相关。特别是由星形胶质细胞产生的代谢物犬尿喹啉酸（KYNA），其为多种受体的拮抗剂 N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体和α7烟碱型乙酰胆碱（α7nACh）受体参与健康与疾病状态下的认知过程。由于精神分裂症患者脑内犬尿氨酸（KYNA）水平升高，谷氨酸能和胆碱能受体功能障碍被认为与该病精神病理学核心领域之一的认知功能障碍存在因果关系。KYNA可能在精神分裂症患者的病理生理过程中发挥重要作用。通过给予啮齿类动物直接生物前体犬尿氨酸，可提高其脑内内源性KYNA水平。大鼠的临床前研究表明，KYNA的急性升高可能影响其学习与记忆过程。本实验方案详细描述了这一研究方法，结合了以下三个方面：a）采用高效液相色谱法对血液中犬尿氨酸水平及脑内KYNA生成进行生化分析；b）利用被动回避范式开展行为学测试，以评估依赖海马的情境记忆；c）通过遥测记录脑电图（EEG）与肌电图（EMG）信号，评估大鼠的睡眠-觉醒行为。综上，本研究旨在探讨KYNA升高与睡眠及认知之间的关系，并详细阐述一种用于理解犬尿氨酸升高及KYNA生成功能后果的实验方法。 体内 在大鼠中。通过本方案的不同变体所获得的结果将验证以下假设：犬尿氨酸通路（KP）和犬尿酸（KYNA）在健康与疾病状态下对睡眠和认知功能的调节具有关键作用。
引言
犬尿氨酸通路（KP）负责降解近95%的必需氨基酸色氨酸1。在哺乳动物大脑中，星形胶质细胞摄取犬尿氨酸后，主要通过犬尿氨酸氨基转移酶（KAT）II将其代谢为具有神经活性的小分子KYNA2。KYNA在脑内作为NMDA受体和α7nACh受体的拮抗剂2,3,4，同时也作用于信号传导相关受体，包括芳香烃受体（AHR）和G蛋白偶联受体35（GPR35）5,6。在实验动物中，脑内KYNA水平升高已被证明会损害其在多种行为学检测中的认知表现2,7,8,9,10。一个新兴假说认为，KYNA通过影响睡眠-觉醒行为在调节认知功能中发挥关键作用11，从而进一步支持了星形胶质细胞来源的分子在调....
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方案
我们的实验方案已获得马里兰大学机构动物照护与使用委员会的批准，并遵循美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》。
注意：所有实验均使用成年雄性Wistar大鼠（250–350 g）。生化分析、行为学实验和睡眠-觉醒记录分别使用不同的动物群组。动物饲养于马里兰精神病学研究中心的温度受控设施中，维持12/12小时明暗循环，光照开启时间为昼夜节律时间（ZT）0，关闭时间为ZT 12。实验期间，动物可自由获取食物和饮水。该设施已获得美国实验动物护理认证协会的全面认证。
1. 大鼠腹腔注射犬尿氨酸
注意：在本实验方案中，犬尿氨酸在 ZT 0（光相开始时）给予，组织在 ZT 2 和 ZT 4 采集，以确定犬尿氨酸代谢的时间进程。注射生理盐水的动物作为对照。例如，若一只大鼠体重为 500 g，目标剂量为 100 mg/kg，则应给予该大鼠 5 mL 浓度为 10 mg/mL 的犬尿氨酸溶液注射。
- 称取L-犬尿氨酸硫酸盐（“犬尿氨酸”），放入20 mL玻璃小瓶中。务必始终将犬尿氨酸置于冰上保存。
- 加入生理盐水以达到所需浓度，并使用1 N氢氧化钠（NaOH）将pH值调节至7.6。涡旋并超声处理溶液，直至犬尿氨酸完全溶解。
注意：操作NaOH时，请遵循所有推荐的安全防护措施。-
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结果
为了验证腹腔注射犬尿氨酸（kynurenine）作为升高脑内KYNA水平的方法，对组织样本进行了高效液相色谱（HPLC）分析。使用配套软件绘制标准曲线（图1），用于组织样本的定量分析。犬尿氨酸和KYNA的代表性色谱图见图2。犬尿氨酸的保留时间为6分钟，KYNA的保留时间为11分钟。为观察犬尿氨酸通路（KP）的动态变化，本实验采用100 mg/kg剂量的犬尿氨酸进行处理，并在注射后立即、2小时或4小时采集组织样本（图3a）。测定血浆中犬尿氨酸（图3b）以及海马组织中KYNA的含量（图3c）。HPLC检测犬尿氨酸代谢物所用的具体参数详见表1。本方案所得的剂量-效应曲线支持将急性犬尿氨酸注射描述为一种可升高脑内KYNA水平的方法，KYNA水平在注射后.......
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讨论
为了在外周给予犬尿氨酸后对脑内KYNA进行可靠评估，关键在于结合并解读生化与功能实验结果。本文提供了一套详细方案，可帮助新用户建立有效的方法，用于测定大鼠血浆中的犬尿氨酸及脑组织中的KYNA。血浆中犬尿氨酸的测定可验证给药的准确性，而代谢产物KYNA的测定则可确认 从头合成 脑内合成。该方法改编自Shibata的荧光检测HPLC法具有若干优势18，以在 Zn 存在下对 KYNA 进行衍生化2+，包括能够精确定量脑内纳摩尔浓度范围内的内源性KYNA。此外，通过调整荧光检测的激发和发射波长（如本方案所述），该方法已适用于检测血浆中微摩尔浓度范围内的生物前体犬尿氨酸。
方案中的关键步骤，例如给药与安乐死之间的特定时间间隔，均被详细描述，以准确确定脑内KYNA形成的时程，并指导行为学及睡眠-觉醒监测实验的设计与分析。采用被动回避范式评估海马依赖性学习能力，并通过脑电图（EEG）和肌电图（EMG）的遥测记录进行睡眠-觉醒分析。由于我们确定脑内KYNA水平在注射后2小时达到最高，因此相应地安排了行为学范式的.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究部分由美国国立卫生研究院（R01 NS102209）和克莱尔·E·福布斯信托基金的捐赠资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Wistar 大鼠 | Charles River Laboratories | 成年雄性，250–350 g | |
| L-犬尿氨酸硫酸盐 | Sai Advantium | ||
| ReproSil-Pur C18 色谱柱（4 mm × 150 mm） | Dr. Maisch GmbH | ||
| EZ 夹具 | Stoelting Co. | 59022 | |
| 固定材料螺丝 | PlasticsOne | 00-96 X 1/16 | |
| 不可吸收缝合线 | MedRep Express | 699B | CP Medical Monomid 黑色尼龙缝合线，4-0，P-3，18"，每盒12根 |
| 可吸收缝合线 | Ethicon | J310H | 4-0 涂层薇乔紫线 1×27'' SH-1 |
| 牙科水泥 | Stoelting Co. | 51458 | |
| 钻头 | Stoelting Co. | 514551 | 0.45 mm |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| Alliance HPLC 系统 | |||
| E2695 分离模块 | Waters | 176269503 | |
| 2475 荧光检测器 | Waters | 186247500 | |
| 柱后试剂管理器 | Waters | 725000556 | |
| 联想计算机 | Waters | 668000249 | |
| Empower 软件 | Waters | 176706100 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 大鼠被动回避箱 | |||
| 超高度中密度纤维板隔音箱 | MedAssociates | ENV-018MD | 内部尺寸：22"（宽）× 22"（高）× 16"（深） |
| 中央通道调制穿梭箱腔室 | MedAssociates | ENV-010MC | |
| 大鼠用不锈钢栅格地板 | MedAssociates | ENV-010MB-GF | |
| 自动闸门 | MedAssociates | ENV-010B-S | |
| 大鼠用快速断开穿梭栅格地板连接装置 | MedAssociates | ENV-010MB-QD | |
| 刺激光源，1" 白色透镜，安装于模块化面板 | MedAssociates | ENV-221M | |
| 带音量控制的大鼠腔室蜂鸣器模块 | MedAssociates | ENV-223AM | |
| SmartCtrl 8 输入/16 输出套件 | MedAssociates | DIG-716P2 | |
| 用于穿梭箱的 8 通道红外控制 | MedAssociates | ENV-253C | |
| 红外光源与探测器阵列条 | MedAssociates | ENV-256 | |
| 台式接口机柜，120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080C | |
| 双范围恒流厌恶刺激模块 | MedAssociates | ENV-410B | |
| 固态栅格地板扰频模块 | MedAssociates | ENV-412 | |
| 双 A/B 电击控制模块 | MedAssociates | ENV-415 | |
| 2 英尺 3 针迷你莫列克斯延长线 | MedAssociates | SG-216A-2 | |
| 10 英尺电击输出电缆，DB-9 公母接头 | MedAssociates | SG-219G-10 | |
| 15 英尺穿梭电击控制电缆，6 芯 | MedAssociates | SG-219SA | |
| 小型台式机柜及电源，120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080D | |
| PCI 接口套件 | MedAssociates | DIG-700P2-R2 | |
| 穿梭箱回避实用程序套件 | MedAssociates | SOF-700RA-7 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 睡眠-觉醒监测设备 | |||
| Ponehmah 软件 | Data Sciences International (DSI) | PNP-P3P-610 | |
| MX2 8 源采集接口 | Data Sciences International (DSI) | PNM-P3P-MX204 | |
| Dell 计算机，Optiplex 7020，Windows 7，64 位 | Data Sciences International (DSI) | 271-0112-013 | |
| Dell 19" 计算机显示器 | Data Sciences International (DSI) | 271-0113-001 | |
| 塑料笼接收器，8 个 | Data Sciences International (DSI) | 272-6001-001 | |
| Cisco RV130 VPN 路由器 | Data Sciences International (DSI) | RV130 | |
| Matrix 2.0 | Data Sciences International (DSI) | 271-0119-001 | |
| 网络交换机 | Data Sciences International (DSI) | SG200-08P | |
| Neuroscore 软件 | Data Sciences International (DSI) | 271-0171-CFG | |
| 双生物电位通道发射器，型号 TL11M2-F40-EET | Data Sciences International (DSI) | 270-0134-001 |
参考文献
- Leklem, J. E. Quantitative aspects of tryptophan metabolism in humans and other species: a review. The American Journal of Clinical Nutrition. 24 (6), 659-672 (1971).
- Pocivavsek, A., Notarangelo, F. M., Wu, H. Q., Bruno, J. P., Schwarcz, R. Astrocytes as Pharmacological Targets in the Treatment of Schizophrenia: Focus on Kynurenic Acid.
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重印与许可
