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体外 支持性脂双层上自组织蛋白模式的重建

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DOI：

10.3791/58139

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2018年7月28日

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们提供一种实验方案 体外 在开放腔室中进行支撑脂双层上 MinD 和 MinE 的自组织实验。此外，我们还描述了如何将实验体系封闭于脂质包被的 PDMS 微区室中以模拟 体内 通过反应限域调控条件。

摘要

细胞基本时空组织的许多方面由反应-扩散型系统所调控。体外重建此类系统可对它们的内在机制进行详细研究，而这些研究在体内是难以实现的。本文提供了一种体外重建大肠杆菌（Escherichia coli）MinCDE系统的方法，该系统负责将细胞分裂隔膜定位在细胞中央。该实验设计仅提供自组织所必需的组分，即膜结构、MinD和MinE两种蛋白质以及以ATP形式提供的能量。因此，我们在盖玻片上构建一个开放式的反应腔室，并在其上形成支撑性脂双层。腔室的开放式设计有利于脂双层的充分制备，并可对体相溶液内容进行可控调控。随后将MinD和MinE两种蛋白质以及ATP加入膜上方的体相溶液中。由于该装置设计兼容共聚焦显微镜、宽场显微镜和全内反射荧光显微镜（TIRF），因此可采用多种光学显微技术进行成像观察。在本方案的一个变体中，脂双层形成于具有图案化结构的支撑基底上，即在细胞形状的PDMS微结构上，而非玻璃表面。将体相溶液液面降低至这些微区室的边缘，可使反应被限制在更小的空间内，并提供边界条件，从而模拟体内的振荡行为。综上所述，我们描述了在有或无空间限制条件下重建MinCDE系统的实验方案，使研究人员能够精确控制影响图案形成的各个方面，例如浓度范围以及其他因子或蛋白质的添加，并可在相对简单的实验装置中系统地逐步增加系统的复杂性。

引言

时空模式在自然界中至关重要，从形态发生到受控的细胞分裂，它们在多细胞和细胞层面调控着复杂的任务。1,2反应-扩散系统在形成这些模式中起着重要作用，但目前仍未被充分理解。一个典型的反应-扩散系统范例，也是迄今为止研究最为清楚的生物系统，是 大肠杆菌 MinCDE系统3,4,5,6,7MinCDE 系统在细胞极之间来回振荡 E. coli 以确定细胞中部作为未来的分裂位点。该系统基于ATP酶MinD， ATP酶激活蛋白MinE及膜作为空间反应基质8MinC 不参与模式形成机制，而是实际的功能因子：即主要分裂体蛋白 FtsZ 的抑制剂5,6MinC 与 MinD 结合并随之振荡，从而形成一种时间平均的蛋白质浓度梯度，该梯度在细胞两极处最高，在细胞中央处最低，仅允许 FtsZ 在细胞中部聚合。9,10MinCDE 系统属于 Walker A 型 ATP 酶这一更大的蛋白家族，该家族在细菌的时空组织调控中起关键作用2，用于蛋白质复合物的定位与转运11 和质粒12 以及调控细胞分裂13 和染色体分离14因此，MinCDE反应-扩散系统不仅代表了一种典型的反应-扩散系统，还因其在细菌时空组织中的重要作用而受到广泛关注。

MinCDE 系统的详细功能研究 体内 较为复杂，因为对蛋白质的操作和基因敲除通常会导致细胞分裂缺陷。此外，改变膜的组成或细胞质的性质 体内 极具挑战性15,16细胞内环境复杂，系统变化及影响因素难以解释，若细胞分裂这一基本功能受到干扰，则更难解析。因此，我们及其他研究者已转向一种 体外 重构方法，将系统简化为其核心组分：MinD、MinE、作为能源的ATP，以及作为反应基质的支持性脂双层6,17,18这种自下而上的方法能够在避免活细胞复杂性的前提下，深入探究自组织机制。这些蛋白质会形成在表面传播的行波。6 以及其他类型的图案17,19 在这些条件下，尽管其波长通常比 体内使用开放式反应室有助于精确控制影响图案形成的各个方面：蛋白质浓度6蛋白质性质20，膜组成10缓冲液组成和ATP浓度6，以及添加其他因素，如拥挤剂21 以及其他分裂体蛋白22相比之下， 体外 流动池中MinCDE系统的重建18,19,23 可用于探究流动的影响17,23，蛋白质限制条件19，膜组成19 以及完整的三维限制18 在蛋白质模式方面，但使得对蛋白质/组分浓度的精确控制以及组分的顺序添加变得复杂得多。

利用这种开放式腔室，我们还对平面脂双层的支撑结构进行了图案化，从而可以研究几何边界如何影响图案形成21，这一现象最近也通过将细菌塑造成微结构在体内（in vivo）进行了研究7。我们还利用该检测方法研究了MinE中特定突变如何影响系统的图案形成20。此外，相同的检测基本形式已被用于研究光如何控制图案形成，通过将偶氮苯交联的MinE肽引入检测体系，并采用全内反射荧光显微镜（TIRF）进行成像24。

我们发现，为了复制观察到的MinDE模式形成 体内 在一个 体外 系统, 限制是关键。使用棒状微区室，并将其尺寸调整为适配MinDE的较长波长 体外 （10 × 30 µm），包被有支撑性脂双层，可实现 MinDE 极-极振荡及蛋白质梯度形成的重建10,25在此实验中，支撑脂双层沉积在一种图案化的PDMS基底上，该基底包含数百个棒状微区室结构，其顶部保持开放。通过这种方式，反应可在开放的腔室中建立，随后将缓冲液液面降低至微区室的边缘，从而将反应限制在微区室内。 至小体积。尽管这些区室一侧存在气-液界面，因此并未通过膜实现完全的三维限域，其蛋白质动力学仍能模拟 体内 振荡10,25与表现出非常相似结果的完全三维限制相比18开放微结构检测方法相对简单且易于操作，即使没有配备专业微流控设备和洁净室设施的实验室也可开展。

在此，我们介绍一种在支撑脂双层上重建 MinCDE 图案形成的实验方案 体外 使用一个开放式腔室，可控制所有组分，并便于进行光学显微镜观察；经过少量修改后，也可适用于表面探针技术26除了平面支撑脂双层外，我们还展示了如何利用杆状PDMS微结构上的简单图案化支撑脂双层来实现蛋白质的限域。这些实验方法虽然针对MinCDE系统进行了优化，但也可推广至其他以类似方式与膜相互作用的蛋白质系统，例如FtsZ。27 或极简的肌动蛋白皮层28.

方案

1. 蛋白质生产

  1. 蛋白质表达
    1. 转化 E. coli 表达 MinD 的相应质粒转化的 BL21 (DE3) pLysS6，EGFP-MinD29mRuby3-MinD24, MinE6 或 MinC30质粒图谱详见补充信息。
    2. 在含有相应抗生素的LB培养基中，用单菌落接种过夜培养例如，100 µg/mL 氨苄青霉素或 50 µg/mL 卡那霉素，37 °C 摇床培养 14–16 小时。
    3. 接种500 mL 在含有相应抗生素的TB培养基中加入过夜培养物（1:200稀释），于37 °C、180 rpm振荡培养。
    4. 当菌液在600 nm处的光密度达到0.5–0.7时，加入0.5 mM IPTG诱导蛋白表达。对于EGFP-MinD或mRuby3-MinD，将细胞转移至16 °C培养箱中继续培养14–16小时；对于MinC、MinD或MinE，则在诱导后于37 °C培养3–4小时。
      注意：诱导 MinC、MinD 或 MinE 表达对细胞具有毒性，因为过表达会导致细胞分裂缺陷；因此，37 °C 培养时间必须控制在 4 小时以内。若需要更多蛋白，可增加培养液体积，但不可延长培养时间。
    5. 在相应的孵育时间后，于4000 × g离心10分钟收集细胞，并将细胞沉淀于-80 °C保存，直至后续使用。
  2. 蛋白质纯化
    注意：蛋白质纯化可采用预装镍-氮川三乙酸（Ni-NTA）柱在自动蛋白纯化系统上进行，也可使用Ni-NTA微珠通过重力流法在实验台进行纯化。
    1. 使用预装Ni-NTA柱在自动化蛋白纯化系统中进行纯化时，采用缓冲液A1（50 mM 磷酸钠 pH 8.0，500 mM NaCl，10 mM 咪唑）、缓冲液B1（50 mM 磷酸钠 pH 8.0，500 mM NaCl，20 mM 咪唑）和缓冲液C1（50 mM 磷酸钠 pH 8.0，500 mM NaCl，250 mM 咪唑）。使用Ni-NTA磁珠进行重力流台式纯化时，采用缓冲液A2（50 mM Tris-HCl pH 8.0，300 mM NaCl，10 mM 咪唑）、缓冲液B2（50 mM Tris-HCl pH 8.0，300 mM NaCl，20 mM 咪唑）和缓冲液C2（50 mM Tris-HCl pH 8.0，300 mM NaCl，250 mM 咪唑）。所有缓冲液在使用前应立即加入10 mM ß-巯基乙醇或0.4 mM TCEP（三(2-羧乙基)膦）作为还原剂。
    2. 在添加无EDTA蛋白酶抑制剂、100 µg/mL溶菌酶、约250 U/mL DNase和0.2 mM Mg的缓冲液A1或A2中重悬细胞，体积为20–30 mL2+-ADP（Mg）2+- 仅在纯化 MinD 或 EGFP-MinD 时加入 ADP，使用 100 mM MgCl₂ 配制的 100 mM ADP 储液2 pH 调至 7.5。
    3. 使用尖端超声波破碎仪在冰浴中对含有细胞的离心管进行细胞裂解（30% 振幅，总时长 2.5 分钟，脉冲 30 秒，间歇 30 秒）。
    4. 通过在 25,000 x g 和 4 °C 条件下离心细胞裂解液 45 分钟，去除细胞碎片。
    5. 将上清液在Ni-NTA柱或Ni-NTA珠上孵育。
      1. 对于预装的Ni-NTA柱，使用自动蛋白纯化系统的样品泵将样品上样至柱中。
      2. 对于台式纯化，在50 mL反应管中将样品与Ni-NTA珠在4 °C下于旋转摇床上孵育1小时。后续步骤中，使用25 mL移液管将Ni-NTA珠转移至空柱中。
    6. 用至少5个柱体积的缓冲液A1或A2洗涤。
    7. 用至少5个柱体积的缓冲液B1或B2进行洗涤。
    8. 使用缓冲液 C1 或 C2 洗脱蛋白质。
    9. 通过SDS-PAGE评估蛋白质纯度。
    10. 可选：将蛋白上样至预平衡的凝胶过滤柱中进一步纯化，柱内平衡缓冲液为储存缓冲液（50 mM HEPES/KOH pH 7.2，150 mM KCl，10% 甘油，0.1 mM EDTA，0.4 mM TCEP，（0.2 mM Mg2+-ADP（MinD 情况下）
      注意：建议对 MinD 进行凝胶过滤，以去除聚集的蛋白质组分。
    11. 如果不采用凝胶过滤，可使用重力流脱盐柱将Ni-NTA洗脱缓冲液置换为储存缓冲液（50 mM HEPES/KOH pH 7.2，150 mM KCl，10%甘油，0.1 mM EDTA，0.4 mM TCEP，若为MinD则加入0.2 mM Mg-ADP）（见 材料表).
    12. 将蛋白质分装后在液氮中速冻，并于 -80 °C 保存至后续使用。
    13. 使用Bradford法测定蛋白质储备液浓度，并通过ATP酶活性检测确定蛋白质活性20.
      注意：不要通过280 nm处的吸光度测定蛋白浓度。MinD纯化过程中存在核苷酸，且MinE缺乏色氨酸，这些因素会干扰A₂₈₀的测定结果。280 浓度测定。请使用 Bradford 或 BCA 法测定蛋白质浓度。
  3. 蛋白质标记
    注意：将荧光蛋白与小蛋白MinE融合会显著改变其扩散特性和功能；因此，相较于荧光蛋白融合，更推荐对蛋白进行化学标记（位于第51位的半胱氨酸）。
    1. 将0.125 mg马来酰亚胺-染料偶联物溶解于5–10 µL DMSO（二甲基亚砜）中，在振荡条件下加入0.5 mL pH 7.2储存缓冲液中的MinE等分试样，该试样按上述步骤制备。
    2. 4 °C 条件下轻柔振荡或搅拌孵育 2 小时至过夜，或室温下孵育 2 小时。
    3. 使用重力流脱盐柱（以储存缓冲液（50 mM HEPES/KOH pH 7.2，150 mM KCl，10% 甘油，0.1 mM EDTA，0.4 mM TCEP）平衡）分离染料与蛋白质。
    4. 为进一步去除未结合的染料，将蛋白质置于过量的储存缓冲液中透析。
    5. 通过测量相应染料最大吸收波长处的吸光度来验证标记是否成功，并计算估计的标记效率。有关估算标记程度的详细方案，请参考染料生产商的说明书。使用SDS-PAGE进行分析，并通过质谱测定总分子量，以获得有关样品均一性和标记效果的进一步有用信息。

2. 小单层囊泡（SUV）的制备

  1. 多层囊泡的制备
    1. 根据所需的脂质混合物及最终 SUV 体积，计算氯仿中所需脂质的量。脂质在 Min 缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM KCl，5 mM MgCl2）中的浓度应为 4 mg/mL。标准 Min 实验推荐使用 7:3 DOPC:DOPG（摩尔百分比）的混合物。若使用 E. coli 极性脂质提取物，则所有制备步骤均应使用 SLB 缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM KCl）。
      注意：初次使用者不建议使用 E. coli 极性脂质提取物，因为使用该混合物制备均一的支撑脂双层（SLB）更具挑战性。
    2. 使用带玻璃吸头的正向移液器，在 1.5 mL 玻璃小瓶中混合氯仿中的脂质。
      1. 在轻微氮气流下缓慢旋转小瓶，使脂质干燥。随后在较强氮气流下继续吹扫 10 至 20 分钟。将含有干燥脂膜的小瓶置于真空干燥器中，抽真空至少 1 小时。
    3. 在 Min 缓冲液中通过涡旋振荡在室温下重悬脂质，直至混合物呈现均匀的浑浊状态。
      注意：若需从多层囊泡制备小单层囊泡（SUV），可采用步骤 2.2 所述的挤出法，或步骤 2.3 所述的超声法。通常情况下，挤出法可获得更窄的粒径分布，有助于支撑脂双层的形成。
  2. 通过挤出法制备 SUV
    1. 通过冻融循环 7 至 10 次，破碎脂质聚集体和多层结构，并进一步溶解脂质。
      1. 在加热板上准备一个盛有 70 °C 至 99 °C 水的烧杯，以及一个装有液氮的容器。
      2. 用大镊子夹住小瓶浸入液氮中，直至液氮停止剧烈沸腾。然后将小瓶转移至热水中，直至溶液完全解冻。根据混合物情况重复上述步骤，直至脂质混合物肉眼观察呈透明状态。
    2. 组装脂质挤出装置，并用 Min 缓冲液预冲洗系统。将脂质混合物通过 50 nm 孔径的膜挤出 35 至 41 次。确保最终挤出次数为奇数，以避免未通过膜的聚集体残留。
  3. 通过超声法制备 SUV
    1. 为更好地将脂质溶解于缓冲液中，将装有溶液的玻璃小瓶置于 37 °C 的金属浴中，并每隔 20 分钟涡旋 1 分钟。总孵育时间约为 1 小时。
    2. 将小瓶底部浸入超声水浴（本实验中为 1.91 L，80 W）中，并通过铁架台将小瓶固定在适当高度。
    3. 调节超声水浴中的水位，使小瓶周围的溶液能充分受到超声脉冲扰动，并对脂质混合物超声约 20 分钟。通过观察脂质溶液的澄清度来判断超声是否成功。
  4. SUV 可在 4 °C 下保存最多一周，或分装成小份（约 20 µL）在 -20 °C 冻存数周。使用前在室温下解冻小瓶或离心管，并按照 2.2.3 或 5.3 所述方法再次超声，直至溶液澄清，方可用于支撑脂双层（SLB）的制备。请注意，通过挤出法获得的 SUV 狭窄粒径分布在冷冻、解冻及再次超声后将不再保持。

3. 清洁玻璃盖玻片

注意：玻璃盖玻片的清洁与亲水化处理是获得均匀且流动性良好的支撑脂双层的重要因素。可使用piranha溶液清洁玻璃盖玻片，该溶液由7:2比例的浓硫酸与50%过氧化氢（3.1）混合而成，或使用等离子清洗仪中的氧气等离子体进行处理（3.2）。两种方法均可获得相似的效果。

  1. 盖玻片的皮拉尼亚清洗
    1. 加入皮拉尼亚溶液
      1. 将玻璃盖玻片分散放置于倒置的玻璃培养皿或其他惰性表面上。使用玻璃移液管，向每片盖玻片中心加入7滴浓硫酸（98%）。
        注意：硫酸具有强酸性和腐蚀性。仅可在通风橱内操作，并佩戴适当的防护装备。
      2. 在酸滴中央加入两滴50%过氧化氢。
        注意：过氧化氢对眼睛和皮肤具有腐蚀性。
      3. 覆盖反应体系，孵育至少45分钟。
        注：此处最长等待时间对实验结果无关键影响，可延长至数天。
    2. 清洗经皮拉尼亚处理的盖玻片。
      1. 使用镊子逐个夹取盖玻片，用超纯水冲洗去除酸液。将洗净的盖玻片放入防粘连的支架或其他类似转移装置中。
      2. 用超纯水充分冲洗每片盖玻片，并用加压气体（氮气，或无油压缩空气）吹干表面。用永久性记号笔标记已清洗的一侧。
  2. 盖玻片的等离子清洗
    1. 先用过量乙醇冲洗盖玻片，再用过量超纯水冲洗。用加压气体吹干盖玻片。按照第4步所述组装腔室。
    2. 按照第4步完成腔室组装后，将附有腔室的盖玻片放入等离子清洗仪中，以氧气为工艺气体进行清洗。采用等离子体对盖玻片进行清洗（本研究中使用30%功率、0.3 mbar氧气压强，处理1分钟）。应在进行第5步所述的SLB形成前立即进行等离子清洗，因为等离子清洗带来的亲水化效果会随时间减弱。
      注：应使用荧光标记的膜进行优化实验，确定等离子清洗的时间和功率，因为清洗不足或过度均可能导致膜无法流动或出现孔洞。

4. 腔室组装

  1. 使用锋利的剪刀剪下并丢弃0.5 mL离心管的管盖和锥形部分。用移液枪枪头将紫外固化胶均匀涂抹在管子的上边缘。
  2. 将管子倒置，粘附在先前已清洁好的盖玻片上。若使用了piranha溶液清洗，请确保将其粘在玻璃的已清洁面。将多个样品室置于360 nm紫外灯或LED灯下照射5至15分钟，使紫外固化胶完全固化。

5. 支持性脂质双层（SLB）的形成

  1. 将加热块预热至 37 °C，并在每个反应腔室中放入含 Min 或 SLB 缓冲液的 2 mL 反应管进行孵育，每腔室 1 管。
  2. 向组装并固化好的腔室中通入氮气，以去除在紫外固化和组装过程中可能沉降的任何灰尘或其他颗粒。如果未使用Piranha溶液（3.1）清洁盖玻片，请按照3.2节所述进行等离子清洗。将腔室置于加热块上。
  3. 将20 µL澄清的脂质（浓度为4 mg/mL）用130 µL Min缓冲液或SLB缓冲液稀释，若为 E. coli 极性脂质提取物，终浓度为 0.53 mg/mL。若脂质样品曾冷冻保存，加缓冲液前先将离心管置于水浴超声仪中进行超声处理，随后再加入缓冲液进行第二次超声。
  4. 向每个腔室中加入 75 µL 脂质混合物，并设置计时器为 3 分钟（适用于 DOPC/DOPG 混合物；其他脂质混合物可能需要更长的孵育时间）。若出现 E. coli 极性脂质提取物，用移液器加入 CaCl2 从100 mM储备液中加入试剂至样品室，终浓度为3 mM。在孵育期间，囊泡在亲水性玻璃表面破裂并融合，形成连续的支撑脂双层膜（SLB）。
  5. 60 秒后，向每个腔室中加入 150 µL Min 缓冲液。
  6. 清洗反应室：再经过120秒（总计3分钟）后，向每个反应室中加入200 µL Min缓冲液或SLB缓冲液，轻轻吹打混匀数次，吸出后再次加入200 µL缓冲液。
    1. 每个腔室清洗一次后，继续彻底清洗第一个腔室，直至用完2 mL缓冲液。SLB的清洗需要一定经验，以掌握腔室内的操作幅度并找到合适的清洗强度。
      注意：切勿将腔室中的液体完全移除，以免支撑脂双层（SLB）干燥。
      注意：除了清洗之外，膜的性质还会因多种其他因素而变化：脂质的类型及其在脂质混合物中的相对浓度、SUV的制备方法、支撑材料的表面处理及预先清洗情况。

6. 自组织实验

  1. 调整反应室中的缓冲液体积至200 µL Min缓冲液减去蛋白和ATP溶液的体积，然后加入MinD、标记的MinD、MinE，以及如需要的MinC。通过移液轻轻混匀各组分。示例浓度为1 µM MinD（掺入30% EGFP-MinD）、1 µM MinE（掺入10%化学标记MinE）和0.05 µM MinC，但在一定浓度范围内均可形成蛋白模式6,10,20,30。
  2. 加入2.5 mM ATP（来自100 mM MgCl2中的100 mM ATP储备液，pH 7.5）以启动MinDE系统的自组织过程。
    注意：组分添加顺序（MinD、MinE和ATP）可以调整，不会影响最终形成的模式4。
  3. 在荧光显微镜下观察MinDE的自组织过程（参见材料表）。也可使用全内反射荧光（TIRF）显微镜进行观察。成像eGFP-MinD时，使用488 nm氩离子激光器或类似的二极管激光器（例如，490 nm）。成像mRuby3-MinD时，建议使用561 nm二极管激光器。
    注意：应避免长时间高强度激发，因为本研究团队及其他研究者17已观察到MinDE系统中存在光毒性，可导致蛋白在膜上发生不可逆聚合。

7. PDMS 微结构

注意：聚二甲基硅氧烷（PDMS）是一种可用于制备微结构和微流控装置的聚合物。图案化的硅晶圆用作浇铸PDMS结构的模具。随后，PDMS结构可作为支持脂双层（SLB）形成及检测构建的载体。

  1. 可使用光刻技术自行制备带微区室的硅片（详见 Zieske 和 Schwille 提供的详细方案31，或 Gruenberger et al. 提供的视频方案32），也可向代工厂订购所需硅片。本文所用硅片的图案请参见补充信息。
  2. 从图案化硅片制备 PDMS 微结构。
    1. 使用塑料杯称取 10 g PDMS 基体和 1 g PDMS 交联剂。可使用混合装置混合并脱气 PDMS 混合物，或手动混合后在真空下脱气。
    2. 用移液枪头将少量 PDMS 直接滴加到硅片的结构上。
      注意：注意不要划伤硅片。
    3. 立即将一块 #1 盖玻片置于 PDMS 液滴上，并用洁净移液枪头的上端轻轻按压盖玻片，使其贴合硅片。PDMS 应在盖玻片与硅片之间均匀铺展成薄层。
    4. 将带有盖玻片的硅片放入烘箱，在 75 °C 下固化 3–4 小时或过夜。取出后让其冷却至室温。用剃刀刀片小心地将附着 PDMS 的盖玻片从硅片上剥离。
      注意：为防止硅片被污染或损坏，应始终用 PDMS 和盖玻片覆盖微结构。但 PDMS 会老化，导致微结构出现裂纹，因此不要使用存放超过两到三周的 PDMS 结构。

8. PDMS 微结构中的自组织

  1. 使用带有PDMS微结构的盖玻片，按照第4节所述方法连接腔室。
  2. 按照3.2.2节所述，在氧气等离子体清洗仪中清洗并使表面亲水化。切勿使用piranha溶液清洗PDMS基底。
  3. 按照第6节所述建立MinDE自组织实验体系。
  4. 实验体系建立后，在荧光显微镜下检查MinDE规律性图案的形成以及微结构是否正常成型。
  5. 当规律性MinDE图案形成后（10–30分钟），轻轻吹打混合两次，然后逐步用移液器吸除缓冲液。先使用100 µL移液器移除大部分缓冲液，再使用10 µL移液器小心移除剩余部分。
    注意：此步骤可能需要一定练习。若移除过多缓冲液或操作耗时过长，微结构将被干燥；若移除不足，则蛋白质无法被限制在微结构内，而会继续形成行进的表面波。
  6. 立即用盖子封闭腔室，以防止微结构中残留缓冲液干燥。
  7. 若需延长成像时间，可在腔室内放置一块湿润的海绵，然后盖上盖子。确保海绵不接触盖玻片表面。
  8. 在对微结构进行成像前，检查表面以确认缓冲液已降低至足够水平，使得微结构上方表面的MinDE图案形成已停止。对微结构内的MinDE振荡进行成像，并确认微结构未被干燥或在成像过程中逐渐干燥。
    注意：每次使用后应丢弃带有微区室的盖玻片，因为PDMS会产生裂纹。

9. MinDE 图案形成的分析

  1. 在平面支撑脂双层上定量分析 MinDE 自组织的波长、波速和波形特征。使用 FIJI 及其标准插件包即可完成基本分析33。
  2. 通过生成明暗图（kymograph）和时间平均的蛋白质浓度分布，分析微区室中的两极振荡。在 FIJI 中沿选定直线对时间序列图像进行重新切片，即可获得基本的明暗图。

结果

按照本方案进行蛋白质纯化，应可获得纯度足够的 Min 蛋白。作为参考， 图1 提供 MinD、荧光标记的 MinD、MinE 和 MinC 的 SDS-PAGE 图像。在非图案化支撑脂双层上进行 MinDE 自组织实验的各个步骤描述如下： 图2使用该方案，可在整个腔室内观察到规律的 MinDE 行波在表面传播（图3）。腔室内的波长可能略有变化，但总体模式看起来相似。不应使用腔室边缘进行定量比较，因为在紫外胶上形成的膜似乎与玻璃表面的膜具有不同的性质（参见 图3C）。可通过沿传播方向绘制强度来分析行进的表面波（图3B）。MinD 荧光在波前缘处迅速达到平台期，随后在波后缘急剧下降；而 MinE 荧光则从 MinD 波起始处几乎呈线性上升，在 MinD 之后于波后缘达到峰值，并在此处显著下降。6.

除了蛋白质质量外，支撑性脂双层的质量对于MinCDE系统的正常自组织过程最为关键。一方面，如果对膜的清洗过于剧烈，或其下层表面被过度清洁从而带有过强电荷，膜上可能形成孔洞（图6A，顶部）；另一方面，如果膜清洗不充分，或下层表面未充分清洁/亲水化处理，囊泡会附着在膜上，或导致膜的流动性受损（图6A，底部）。尽管这些问题在通过标记脂质直接观察膜时不如后者明显，但仍可通过MinD的荧光信号检测到：表现为图案不规则，且荧光信号峰值区域的亮度不均一，出现“孔洞”或亮斑，如图6A中间图所示。

杆状PDMS微结构中MinDE自组织过程的实验流程如图4所示。多个实验步骤无需重复，因为蛋白质和脂质可重复使用。与未图案化基底上的操作类似，首先对基底进行清洗和亲水化处理（通过等离子清洗），在PDMS表面形成支撑脂双层，并在200 µL体积中建立自组织反应体系。为验证脂膜是否成功形成以及MinDE是否在膜上发生自组织，需对反应腔室进行成像观察。当脂膜正确形成时，MinDE会在各个微结构之间的PDMS表面形成规则的行波，并且由于波可在整个被膜覆盖的表面上自由传播，MinDE也会在微结构底部发生自组织（图5A）。缓冲液去除后，各微区之间的表面不应出现传播的MinDE模式（图5B），因为该区域应完全干燥。若仍观察到MinDE模式移动，则需进一步去除缓冲液。此时，蛋白质被限制在由脂膜包被的PDMS以及上界面的空气所形成的杆状微区中（图5C），并在其中发生自组织。在此条件下，两种蛋白质可表现出如图5D所示的极-极振荡行为。由于在缓冲液去除过程中，始终有一部分MinD和MinE与膜结合，因此缓冲液去除后的浓度无法与初始加入浓度直接比较。受此影响，同一盖玻片上不同微结构之间的蛋白浓度也会存在差异，因其取决于缓冲液去除前图案的位置。硅片制备或从硅片复制PDMS的过程中可能产生不完整的微结构，此类结构不可用于分析（图6B）。此外，由于缓冲液去除过程可能导致微结构在操作中干燥，因此也应将其排除在后续分析之外 （图6B）。因此，在一个腔室中仅有部分微结构可呈现理想的极-极振荡现象。为分析微结构中蛋白质的动力学行为，可通过沿整个结构绘制选区生成明暗图（kymograph）（图5E）。当MinCDE发生极-极振荡时，MinC和MinD将表现出时间平均浓度梯度，其浓度在微区两极达到最大 ，在微区中央最小 （图5F）。

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图1：SDS-PAGE 显示蛋白质纯化的最终产物。 依次显示 His-MinD（33.3 kDa）、His-eGFP-MinD（60.1 kDa）、His-mRuby3-MinD（59.9 kDa）、His-MinE（13.9 kDa）和 His-MinC（28.3 kDa）。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-2
图2：流程图，展示在无图案支撑脂双层上进行自组织的实验方案各步骤及时间安排（步骤1-6）。 虚线框表示可选用其中一种方法进行清洗。带圆圈的箭头表示可在该处暂停并后续继续实验流程。 请点击此处查看此图的放大版本。

figure-results-3
图3：通过共聚焦显微镜成像MinDE反应体系。 A) 典型的Min蛋白螺旋结构，可从中获取波传播速度、强度分布图及速度测量结果。所用浓度：0.6 µM MinD（30% eGFP-MinD），1.8 µM His-MinE（30% His-MinE-Alexa647）。B) A图中标记区域的归一化强度分布示例图。 C) 整个检测腔室的概览图（比例尺：1 mm，蛋白质浓度同上）。可观察到顺时针或逆时针旋转的螺旋结构以及靶心样图案。放大区域显示了在紫外胶（UV-glue）上波纹图案的差异。请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：流程图，显示本实验方案的各个步骤及所需时间 杆状微结构中的自组织（步骤1-5、7、8）。 灰色方框表示可从非图案化支撑脂双层实验方案中重复使用产物的步骤。带圆圈的箭头表示可暂停并稍后继续的步骤。 请点击此处以查看此图的放大版本。

figure-results-5
图5：杆状PDMS微区室中MinDE模式形成的代表性结果。A) MinDE在PDMS表面自组织形成行进的表面波（1 µM MinD（30% EGFP-MinD）、2 µM MinE 和 2.5 mM ATP）。 B) 当缓冲液降至微结构高度时，微区室之间平面表面的蛋白质自组织停止。 C) 一个杆状微区室的示意图。 D) 去除缓冲液后MinDE从一极到另一极振荡的代表性图像。 E) 沿D图中高亮线所示位置的振荡动力学图（kymograph）。 F) D图所示时间序列的平均荧光强度图像及强度分布曲线，清晰显示蛋白质浓度梯度在微区室两极最高，中间区域最低。请点击此处查看该图的放大版本。

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图6：阴性实验结果的示例。 A) 过度清洗的膜会出现孔洞，而制备不佳的囊泡及不理想的脂质组成会导致囊泡粘连。中间两幅图展示了这两种问题的组合情况，以及在观察Min蛋白振荡时这些问题如何显现。膜使用0.05% Atto655-DOPE进行标记。（比例尺：50 µm） B) 上图：微区室干燥可能是由于缓冲液去除过多或随时间推移缓冲液蒸发所致。下图：在晶圆制备或PDMS molding过程中可能形成不完整的区室。（比例尺：30 µm） 请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件 1： His-MinD 质粒图谱。 请点击此处下载该文件。

补充文件 2： His-EGFP-MinD 质粒图谱。 请点击此处下载该文件。

补充文件 3： His-mRuby3-MinD 质粒图谱。 请点击此处下载该文件。

补充文件 4： His-MinE 质粒图谱。 请点击此处下载该文件。

补充文件 5： His-MinC 质粒图谱。 请点击此处下载该文件。

补充文件 6： 杆状微区室硅片的 CAD 文件。 请点击此处下载该文件。

讨论

我们已描述了一种实验方案 体外 在平面支撑脂双层及脂双层包被的三维结构（以棒状PDMS微结构为例）上重建MinCDE自组织体系。为了从这些实验中获得有价值的数据，最关键的控制因素是蛋白质和膜的质量。

为确保蛋白质质量，应使用SDS-PAGE和质谱法确认蛋白质分子量。此外，应通过分析型凝胶过滤或动态光散射技术验证蛋白质是否可溶且未发生聚集。凝胶过滤可用于去除蛋白质中的聚集组分。精确调节pH值以及所添加核苷酸的质量至关重要，因为向蛋白质储备液或自组织实验体系中加入未调节pH或部分降解的核苷酸足以导致蛋白质活性丧失，从而破坏自组织过程。

除了蛋白质质量外，膜的质量最为关键，而膜结构形成不当往往是导致自组装缺陷以及伪表面结构产生的主要原因。

首次进行该实验方案时，可通过在脂质双层中加入低摩尔百分比（0.05%）的标记脂质（如 Atto-655-DOPE 或 DiI）对支撑脂质双层进行标记，从而直接判断膜的性质与质量。利用荧光漂白恢复技术（FRAP）可评估膜的流动性。此外，还可直接评估支撑脂质双层（SLB）的洗涤质量：若洗涤过度，膜可能被完全洗脱；若洗涤不充分，则会残留过多囊泡，或无法形成流动性的膜。开放式腔室法可对膜进行充分洗涤，从而有效去除附着在 SLB 表面的囊泡。获得流动性良好且均一的支撑脂质双层最关键的两个因素是支撑表面的清洁程度与亲水性，以及 SU 的正确尺寸与均一性。与 使用动态光散射检测SUV的尺寸及尺寸分布可能会有所帮助。对于尺寸分布较窄的样品，我们建议采用挤出法而非超声处理脂质体。其他清洁盖玻片的方法， 例如， 使用强碱、碱性去污剂处理，或用水冲洗后直接使用盖玻片，可能获得良好效果，具体取决于应用目的和脂质混合物的组成。

本文所述方案的前半部分是在开放腔室中的平面支撑脂双层上进行体外重建，其优势在于使表面可被光学显微镜技术（如全内反射荧光显微镜30、荧光漂白恢复分析6、单颗粒追踪技术34）以及表面探针技术（如原子力显微镜26）所检测。大面积的均一区域有利于在特定浓度下获得更可靠的统计结果。此外，开放腔室的方法可精确控制蛋白质浓度，并能快速简便地添加其他组分，从而实现在单个腔室内对蛋白质浓度进行滴定20。该检测还可通过添加其他细菌分裂体组分进行扩展，例如 FtsZ22,35、ZipA22 或嵌合蛋白 FtsZ-YFP-MTS10,35。

其他研究团队也采用了类似的方法来重建Min系统 体外，但使用流动池代替开放腔室17,18,19. 流动池具有某些优势，尤其是在需要完全封闭的三维环境时18，流动的影响17,19,23 或膜组成23 研究MinCDE模式，或在蛋白质限制条件下观察蛋白质模式19然而，对分子浓度的局部控制更为困难。蛋白质组分（尤其是 MinD）会强烈结合到其首先接触的膜上。18,19根据我们的经验，蛋白质经常会对管路、入口、注射器及其他微流控部件产生非特异性结合，因此局部蛋白质浓度与输入浓度存在差异。18 并且在流路池的长度方向上也存在变化，导致在入口与出口之间的膜上出现多种不同的蛋白质分布模式，这一点已被其他研究者观察到19.

本方案的第二部分，即 体外 在覆盖有脂双层的图案化支撑体上，采用开放式腔室法对棒状微结构进行再构，可实现一种简单的模拟 体内 尽管由于缓冲液的去除导致无法精确控制蛋白质浓度，但仍可观察到蛋白质的行为。需要注意的是，由于MinDE的波长约为一个数量级更大 体外 比 体内 杆状微区室的尺寸也比杆状结构大约一个数量级（10 × 30 µm）。 E. coli 细胞

总体而言，该方案可精确控制所有条件，包括蛋白质浓度、缓冲液组成和膜的性质。使用三维结构支架可在空间受限条件下研究反应过程，从而模拟 体内 无需复杂的微流控设备即可观察行为。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Michael Heymann 和 Frank Siedler 提供硅晶圆，MPI-B 核心设施在蛋白质纯化方面的协助，以及 Simon Kretschmer 和 Leon Harrington 对手稿的评论。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>试剂
DOPCAvanti Polar Lipids850375
DOPGAvanti Polar Lipids840475
大肠杆菌极性脂质提取物Avanti Polar Lipids100600
腺苷5′′三磷酸二钠盐三水合物罗氏
腺苷5′′二磷酸一钾二水合物SigmaA5285-1G
氯化钠VWR27810.295
氯化钾Roth6781.1
Tris碱Sigma AldrichT1503-1kg
盐酸Roth9277.1
TCEP-HCl赛默飞世尔科技20491
乙二胺四乙酸默克密理博1.08418.1000
硫酸 98%Applichem173163.1611
过氧化氢 50%Applichem147064.1211
HEPES生物分子05288.1
二甲基亚砜（DMSO）默克102950Uvasol
甘油 86%Roth4043.1
TB培养基
异丙基 β异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）Roth2316.x
Atto-655-DOPEAtto TecAD 655-161
Ni-NTA 琼脂糖Qiagen30210
PDMS 基底道康宁公司SYLGARD 184
PDMS 交联剂道康宁公司
<强>材料
紫外胶Norland 产品6801#68 和 #63 均表现良好
盖玻片 #1.5 24×24 mmMenzel Glä血清
盖玻片 #1，24×24 mmMenzel Glä血清仅用于PDMS微结构
0.5 ml 离心管Eppendorf 0030123301
2L 培养瓶康宁例如：734-1905
His-Trap HPGE Healthcare Life Sciences
凝胶过滤柱：HiLoad Superdex 75 PG 或 200 PGGE Healthcare Life Sciences
Econo-Pac 10DG 脱盐柱预装柱伯乐（Bio-Rad）7322010
透析装置：Slide-A-Lyzer 透析盒，3.5K 截留分子量（MWCO），0.1–0.5 mL 或 0.5–3 mL赛默飞世尔科技66333 或 66330
剃须刀片
<强>仪器
超纯水：Milli-Q Type 1 超纯水系统默克
自动化蛋白质纯化系统 Äkta PureGE Healthcare Life Sciences
超声波清洗机布拉森例如：Model 1510
ARE-250 混匀仪Thinky Corporation
等离子清洗机 ZeptoDiener electronic使用氧气作为工艺气体
正向置换移液器品牌带有玻璃尖端的移液器型号
LSM780 共聚焦激光扫描显微镜Zeiss配备蔡司 C-Apochromat 40X/1.20 水浸物镜
<强>质粒
pET28a-His-MinD_MinE生物化学研究所细胞与分子生物物理学系，施维尔教授编码 His-MinD 和无标签 MinE 的质粒，以提高产量
pET28a-His-MinE马克斯·普朗克生物化学研究所细胞与分子生物物理学系，Schwille 教授表达 His-MinE 的质粒
pET28a-His-EGFP-MinD细胞与分子生物物理学系，马克斯·普朗克生物化学研究所，Prof. Schwille表达 His-EGFP-MinD 的质粒
pET28a-His-mRuby3-MinD生物化学研究所细胞与分子生物物理学系，施维尔教授表达 His-mRuby3-MinD 的质粒
pET28a-His-MinC细胞与分子生物物理学系，马克斯·普朗克生物化学研究所，Prof. Schwille表达 His-MinC 的质粒

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MinCDE PDMS

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