利用造血干细胞移植评估骨髓增生异常综合征的起源

摘要

我们描述了利用造血干细胞移植（HSCT）评估基因工程改造的造血细胞的恶性潜能。HSCT可用于评估多种恶性造血细胞 体内 以及生成大量患有骨髓增生异常综合征（MDS）或白血病的小鼠模型，用于评估新型疗法。

摘要

骨髓增生异常综合征（MDS）是一组异质性的造血干细胞疾病，其特征为无效造血、外周血细胞减少、细胞发育异常以及向急性白血病转化的倾向。携带 NUP98-HOXD13（NHD13）转基因的小鼠在表现出外周血细胞减少、发育异常以及向急性白血病转化等方面，能够很好地模拟人类 MDS。我们先前已证明，通过移植 MDS 小鼠的骨髓有核细胞（BMNC），可将 MDS 从基因工程小鼠传递给野生型受体小鼠。为了更清晰地理解 MDS 的起源细胞，我们已建立了移植特定免疫表型定义的造血细胞亚群的方法。本文中，我们描述了分离和移植特定造血干细胞及祖细胞群体的操作流程。在移植后，我们还介绍了评估移植效率以及供体 MDS 细胞持续存在的相关方法。

引言

骨髓增生异常综合征（MDS）是一组异质性的克隆性血液系统疾病，其特征为无效造血、形态学上可见的发育异常，以及向急性髓系白血病（AML）转化的倾向性^1,2,3,4。无效造血表现为骨髓中的成熟受阻，尽管骨髓呈高增生状态，但仍导致外周血细胞减少^1,3。在美国，MDS的发病率估计为每年每10万人中2至12例，且发病率随年龄增长而上升，鉴于美国人口老龄化趋势，这一疾病的重要性日益凸显^3,5。尽管大多数MDS病例的病因尚不明确，但部分病例被认为与已知的基因毒性物质暴露有关，包括苯等有机溶剂以及癌症化疗药物⁶。

MDS 患者体内的 MDS 细胞通常具有获得性突变⁷。尽管相对少见，但部分 MDS 患者获得了涉及 NUP98、EVI1、RUNX1 和 MLL 等基因的平衡染色体易位（http://cgap.nci.....

方案

本文所述动物实验程序已获得贝塞斯达国家癌症研究所动物护理和使用委员会的批准，并符合《公共卫生服务实验室动物人道护理和使用政策》、《动物福利法》以及《实验室动物护理和使用指南》中的相关规定。

1. 细胞准备

1. 获取骨髓有核细胞（BMNC）
   1. 仅使用无菌材料。可重复使用的器械通过高压蒸汽灭菌器进行灭菌。针头、注射器和塑料器皿应购买一次性无菌包装产品。所有动物操作和细胞处理均须在II级A2型生物安全柜中进行。
   2. 在含有3 mL HF2（Hank's平衡盐溶液添加2%胎牛血清）的14 mL圆底试管中制备BMNCs。
   3. 使用CO₂麻醉舱处死C57Bl6供体小鼠（CD45等位基因CD45.2阳性），通常年龄为2–6个月。
   4. 用喷雾瓶将70%乙醇喷洒至小鼠尸体全身以进行表面消毒。从骨盆向下剥离腿部皮肤至脚踝处。
   5. 使用无菌剪刀（直型，尖端锐利/锐利，11.5 cm）和镊子（Graefe，带齿，尖端宽度0.8 mm）从小鼠尸体上取下股骨和胫骨。彻底清除附着的肌肉组织。
   6. 用剪刀剪除胫骨的近端和远端。用镊子夹住胫骨，将装有2.5 mL HF2的27号3 mL注射器插入胫骨远端（脚踝端）骨髓腔内，轻柔施压，将骨髓细胞冲洗至14 mL圆底试管中。
      1. 对另一侧胫骨重复此操作。

结果

我们展示了多个实验结果的代表性图像。 图1 显示了一次具有代表性的流式细胞术分选实验。在正常的造血分化过程中，当细胞定向分化为特定的造血谱系时，会获得该谱系特异性的细胞表面标志物，并失去自我更新潜能。因此，在野生型小鼠中，干细胞的自我更新能力仅限于谱系阴性骨髓单个核细胞（BMNC）。在本实验中，我们将NHD13小鼠骨髓中的BMNC分选为谱系阴性、谱系低表达阳性以及谱系高表达阳性细胞，随后将这些分选后的细胞移植至野生型（WT）受体小鼠体内，以评估其自我更新能力。

图2展示了另一项实验的结果，该实验将来自患有MDS的NHD13供体的谱系阴性细胞或未分选细胞移植到致死剂量照射的野生型（WT）受体小鼠中。NHD13供体细胞表达CD45.2细胞表面标志物，而野生型竞争细胞（见上文2.2.1节）则表达CD45.1细胞表面标志物。

讨论

尽管骨髓增生异常综合征（MDS）是一种克隆性造血干细胞疾病，但MDS的"干细胞"或起始细胞尚未被明确鉴定。我们先前已证明，通过造血干细胞移植（HSCT），使用NHD13小鼠的骨髓可将MDS移植至野生型（WT）小鼠，其特征表现为大细胞性贫血、白细胞减少、中性粒细胞减少以及形态学上的发育异常证据¹⁵。此外，竞争性重群体实验发现，NHD13 MDS骨髓细胞具有生长优势。综合这些发现表明，MDS干细胞或起始细胞可能存在。目前正在进行更多实验，旨在结合本方案中描述的谱系标记染色方法，利用更明确的干细胞和祖细胞标记物（CD150、CD48、c-Kit和Sca-1）¹⁶，进一步明确MDS起始细胞的免疫表型特征¹⁵。

利用NHD13小鼠鉴定MDS起始细胞涉及复杂的流式细胞术分选过程。ex vivo对原代骨髓单个核细胞（BMNCs）的操作会对细胞造成压力，可能导致细胞死亡或功能丧失。因此，应尽量缩短ex vivo

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
14 mL 圆底管	Falcon	352057
Hank's 平衡盐溶液	Lonza	10-527F
抗 CD45.2 抗体	Southern Biotech	1800-15	LOT# A077-T044O
3 mL 注射器	Monoject	8881513934
27-G 针头	BD	305109
20-G 针头	BD	305176
谱系抗体混合物（Lineage Cocktail）	Miltenyi	130-090-858	LOT# 5170418221
抗生物素抗体（Anti-Biotin antibodies）	Miltenyi	130-113-288	LOT# 5171109046
1 mL 注射器	Excelint	26027	胰岛素注射器
加热灯	Thermo Fisher Scientific	E70001901
FACS 仪器	Cytec	FACScan	2 个激光器，5 色检测器
FACS 分选仪	Beckman Coulter	MOFLO ASTRIOS	5 个激光器，23 个参数，可同时分选 6 个细胞群
碘化丙啶（Propidium Iodide）	Thermo Fisher Scientific	P3566
γ 射线照射仪	Best Theratronics	Gammacell 40
血液采集管	RAM scientific	76011
受体小鼠	Charles River	B6-LY5.1/Cr, CD45.1
NUP98-HOXD13 小鼠	n/a	C57Bl/6, CD45.2	种群维持于美国国立卫生研究院（NIH）
5 mL 圆底管	Falcon	352058