我们描述了利用造血干细胞移植（HSCT）评估基因工程改造的造血细胞的恶性潜能。HSCT可用于评估多种恶性造血细胞 体内 以及生成大量患有骨髓增生异常综合征（MDS）或白血病的小鼠模型，用于评估新型疗法。
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摘要
摘要
骨髓增生异常综合征（MDS）是一组异质性的造血干细胞疾病，其特征为无效造血、外周血细胞减少、细胞发育异常以及向急性白血病转化的倾向。携带 NUP98-HOXD13（NHD13）转基因的小鼠在表现出外周血细胞减少、发育异常以及向急性白血病转化等方面，能够很好地模拟人类 MDS。我们先前已证明，通过移植 MDS 小鼠的骨髓有核细胞（BMNC），可将 MDS 从基因工程小鼠传递给野生型受体小鼠。为了更清晰地理解 MDS 的起源细胞，我们已建立了移植特定免疫表型定义的造血细胞亚群的方法。本文中，我们描述了分离和移植特定造血干细胞及祖细胞群体的操作流程。在移植后，我们还介绍了评估移植效率以及供体 MDS 细胞持续存在的相关方法。
引言
骨髓增生异常综合征（MDS）是一组异质性的克隆性血液系统疾病，其特征为无效造血、形态学上可见的发育异常，以及向急性髓系白血病（AML）转化的倾向性1,2,3,4。无效造血表现为骨髓中的成熟受阻，尽管骨髓呈高增生状态，但仍导致外周血细胞减少1,3。在美国，MDS的发病率估计为每年每10万人中2至12例，且发病率随年龄增长而上升，鉴于美国人口老龄化趋势，这一疾病的重要性日益凸显3,5。尽管大多数MDS病例的病因尚不明确，但部分病例被认为与已知的基因毒性物质暴露有关，包括苯等有机溶剂以及癌症化疗药物6。
MDS 患者体内的 MDS 细胞通常具有获得性突变7。尽管相对少见，但部分 MDS 患者获得了涉及 NUP98、EVI1、RUNX1 和 MLL 等基因的平衡染色体易位（http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman）。本实验室长期关注涉及 NUP98 基因的染色体易位8。由 Vav1 启动子和增强子元件调控表达 NUP98-HOXD13（NHD13）转基因的转基因小鼠表现出 MDS 的所有关键特征，包括外周血细胞减少、形态学上的发育异常证据以及向急性髓系白血病（AML）的转化9。
尽管骨髓增生异常综合征（MDS）已被认识超过60年10，且被认为是一种克隆性造血干细胞疾病，但将人类MDS细胞移植到免疫缺陷小鼠体内的尝试在很大程度上并不成功，原因是MDS细胞植入效率低下11,12,13,14，且小鼠无法发展出临床疾病。为了鉴定哪些造血细胞能够传递MDS，我们采用了NHD13模型，并证明了可以将MDS作为一种疾病实体成功移植，该模型表现出人类MDS的所有主要特征，包括外周血细胞减少、发育异常以及向急性髓系白血病（AML）的转化15。在本报告中，我们介绍了这些实验的技术细节，以及进一步分离造血干细胞和前体细胞（HSPC）的方法，旨在鉴定MDS起始细胞。
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方案
本文所述动物实验程序已获得贝塞斯达国家癌症研究所动物护理和使用委员会的批准，并符合《公共卫生服务实验室动物人道护理和使用政策》、《动物福利法》以及《实验室动物护理和使用指南》中的相关规定。
1. 细胞准备
- 获取骨髓有核细胞（BMNC）
- 仅使用无菌材料。可重复使用的器械通过高压蒸汽灭菌器进行灭菌。针头、注射器和塑料器皿应购买一次性无菌包装产品。所有动物操作和细胞处理均须在II级A2型生物安全柜中进行。
- 在含有3 mL HF2（Hank's平衡盐溶液添加2%胎牛血清）的14 mL圆底试管中制备BMNCs。
- 使用CO2麻醉舱处死C57Bl6供体小鼠（CD45等位基因CD45.2阳性），通常年龄为2–6个月。
- 用喷雾瓶将70%乙醇喷洒至小鼠尸体全身以进行表面消毒。从骨盆向下剥离腿部皮肤至脚踝处。
- 使用无菌剪刀（直型，尖端锐利/锐利，11.5 cm）和镊子（Graefe，带齿，尖端宽度0.8 mm）从小鼠尸体上取下股骨和胫骨。彻底清除附着的肌肉组织。
- 用剪刀剪除胫骨的近端和远端。用镊子夹住胫骨，将装有2.5 mL HF2的27号3 mL注射器插入胫骨远端（脚踝端）骨髓腔内，轻柔施压，将骨髓细胞冲洗至14 mL圆底试管中。
- 对另一侧胫骨重复此操作。
- 用剪刀剪除股骨的近端和远端。将连接有装满2.5 mL HF2的3 mL注射器的20号针头插入股骨远端骨髓腔，轻柔推注以冲洗骨髓。
- 对另一侧股骨重复此操作，将两侧胫骨和股骨的全部骨髓收集至同一支14 mL圆底试管中。
- 使用连接在同一3 mL注射器上的20号针头，反复吹打数次以充分分散骨髓组织团块。
- BMNC的抗体染色
- 计数BMNC。取步骤1.1.8制备的BMNC悬液20 µL，加入20 µL 3%醋酸溶液，随后使用血细胞计数板和倒置显微镜进行细胞计数。
- 在4 °C条件下以450 × g离心5分钟，使BMNC沉淀。按每107个细胞加入90 µL HF2重悬细胞沉淀，并向细胞悬液中加入10 µL生物素标记的谱系抗体混合物（anti-lineage antibody cocktail）。
- 在4 °C孵育20分钟后，用3 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤染色后的细胞。
- 按每107个细胞加入100 µL HF2重悬BMNC，向细胞悬液中加入2 µL藻红蛋白别藻青蛋白（APC）偶联的抗生物素抗体，随后在4 °C孵育20分钟。
- 用3 mL PBS洗涤染色后的BMNC，并用含0.2 µg/mL碘化丙啶（PI）的HF2重悬细胞，用于流式细胞术分选。
- BMNC的流式细胞术分选
- 校准流式细胞分选仪。使用未染色细胞优化所有光电倍增管（PMT）、散射光及荧光参数，并将各检测器设置在其线性检测范围内。
- 平行制备来自步骤1.2的未染色、PI染色以及APC标记谱系抗体混合物染色的细胞样本，用于光谱补偿分析。
- 通过依次设置FSC-H vs. SSC-H、640-SSC-A vs. 640-SSC-H、640-SSC-S vs. 640-SSC-W的门控策略排除双联体细胞（doublet cells）。
- 使用561 nm激发PI，并通过614/20带通滤光片收集发射光以排除非活细胞。使用640 nm激发谱系标记的APC荧光，并通过671/30带通滤光片收集发射光。
- 以电压高度记录荧光信号，以列表模式至少采集100,000个事件的数据，用于可视化待分选的细胞群体。
- 采集以下三组各10,000个细胞的样本后，计算光谱补偿：未标记细胞、PI标记细胞、APC偶联的抗谱系抗体混合物标记细胞。
- 设置三个分选区域，分别将谱系阴性（LN）、弱荧光强度的谱系阳性（LP1）以及强荧光强度的谱系阳性（LP2）细胞分选至含有0.5 mL 10% FBS培养基的5 mL试管中。
- 采用“单滴包裹”模式（one drop envelop）并启用纯化中止（purify abort）模式进行细胞分选。
- 对每份分选后的样本进行分选后分析，总计检测1,000个细胞，以确认分选细胞的纯度和活性。
- 在4 °C条件下以450 × g离心5分钟收集分选细胞，弃上清后用0.5 mL HF2重悬细胞沉淀。
- 使用血细胞计数板和台盼蓝染色确认分选细胞数量，并用HF2调整细胞浓度以用于移植。
注：通过在上述步骤1.2.2中使用其他荧光染料偶联抗体的组合，可分离多种不同表型的BMNC群体用于移植。
2. 受体小鼠准备与造血干细胞移植（HSCT）
- 移植受体的准备
- 在特定病原体阴性（SPF）级动物实验设施中，对同源背景受体小鼠（B6-LY5.1/Cr，CD45.1）进行兽医监护与饲养管理。
- 为进行胃肠道的预防性去污，在致死剂量（9 Gy）照射前7天开始，向受体提供含100 mg/L环丙沙星的无菌水，并在照射后继续维持14天。
- 从铯（Cs）源提供致死剂量（9 Gy）的照射，操作步骤如下：由经过培训并获得认证的铯（Cs）源操作人员进行操作。将铯（Cs）源仪器设置为以70 cGy/min的剂量率进行全身γ射线照射。将10只小鼠放入定制的固定装置中，并将该装置插入照射室。进行总计9 Gy、持续13分钟的全身照射，随后将小鼠放回笼中。
- 造血干细胞移植
- 将野生型（WT）BMNC从同源受体小鼠（B6-LY5.1/Cr，CD45.1）按2 × 10⁶细胞剂量混合5 每只小鼠 2 至 5 × 10 个细胞4 使用1.3节所述流式细胞术分选制备的纯化试验骨髓单个核细胞（BMNC）。将细胞混合于同一注射器中。
注意：野生型骨髓单个核细胞（WT BMNC）可为受体小鼠提供辐射保护效应，从而确保当受试细胞无法支持造血功能时，受体小鼠仍能存活。本类实验中所用的野生型BMNC表达CD45.1等位基因，因此可通过特异性区分CD45.1与CD45.2的抗体将其与受试细胞区分开来。该野生型BM细胞被称为 "辅助细胞", "辐射敏感性较低的细胞"，或 "竞争细胞". - 使用无菌 HF2 将细胞混合物体积调整至每受体 200 µL，以方便注射。
- 将细胞混合物移植到致死剂量照射的受体小鼠中 通过 使用1 mL注射器和28号针头进行尾静脉注射，于24小时内完成 照射剂量。将小鼠尾巴置于加热灯下，因为热量可引起尾静脉扩张。
注意：在研究结束时，对所有受体小鼠实施安乐死，并通过尸体解剖、组织学和流式细胞术评估疾病进展。
- 将野生型（WT）BMNC从同源受体小鼠（B6-LY5.1/Cr，CD45.1）按2 × 10⁶细胞剂量混合5 每只小鼠 2 至 5 × 10 个细胞4 使用1.3节所述流式细胞术分选制备的纯化试验骨髓单个核细胞（BMNC）。将细胞混合于同一注射器中。
3. 使用流式细胞术进行移植检测
- 为评估供体细胞植入情况，分别在移植后第6周、第12周和第16周采集受体小鼠的外周血（PB）。
- 将受体小鼠置于带有加热灯的笼子中预热约1分钟，然后将小鼠放入固定器中。
- 使用手术刀（10号刀片，#3刀柄）切开尾静脉，用含EDTA作为抗凝剂的毛细管从每只受体小鼠采集100 µL外周血。
- 将采集的外周血均分为两份，每份50 µL，分别置于无菌微量离心管中。其中一份用于自动化全血细胞计数（CBC）（由NCI组织病理学核心实验室完成），另一份用于抗体染色和流式细胞术分析。
- 为通过流式细胞术检测供体细胞植入情况，向50 µL采集的外周血中加入1 mL低渗红细胞裂解缓冲液（8.29 g/L NH4Cl，1 g/L KHCO3，0.037 g/L Na2EDTA，pH 7.2）以裂解红细胞。涡旋混匀样品，并在室温下孵育10分钟。
- 将裂解后的外周血在4,600 × g离心1.5分钟。小心吸除上清液并弃去。
- 通过轻弹或"弹击"管底部分破坏细胞沉淀。向管中沉淀加入1.3 mL PBS，于4,600 × g离心1.5分钟。小心吸除并弃去上清液。
- 通过轻弹或弹击破坏细胞沉淀，向沉淀中加入200 µL含5%大鼠血清的HF2缓冲液。
- 向细胞悬液中加入与别藻蓝蛋白（APC）偶联的抗CD45.2抗体（1 µL）。在4 °C孵育至少30分钟，并短暂涡旋混匀。
- 染色完成后，按上述方法洗涤细胞两次，然后用400 µL含1 µg/mL碘化丙啶（PI）的HF2缓冲液重悬细胞。
- 使用四色流式细胞仪检测细胞植入情况。可通过添加额外抗体以检测特定细胞类型（如B或T淋巴细胞），从而获得外周血中更多细胞类型的详细信息。
- 使用电子表格记录连续时间点的植入数据，以便进行后续数据分析。
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结果
我们展示了多个实验结果的代表性图像。 图1 显示了一次具有代表性的流式细胞术分选实验。在正常的造血分化过程中，当细胞定向分化为特定的造血谱系时，会获得该谱系特异性的细胞表面标志物，并失去自我更新潜能。因此，在野生型小鼠中，干细胞的自我更新能力仅限于谱系阴性骨髓单个核细胞（BMNC）。在本实验中，我们将NHD13小鼠骨髓中的BMNC分选为谱系阴性、谱系低表达阳性以及谱系高表达阳性细胞，随后将这些分选后的细胞移植至野生型（WT）受体小鼠体内，以评估其自我更新能力。
图2展示了另一项实验的结果，该实验将来自患有MDS的NHD13供体的谱系阴性细胞或未分选细胞移植到致死剂量照射的野生型（WT）受体小鼠中。NHD13供体细胞表达CD45.2细胞表面标志物，而野生型竞争细胞（见上文2.2.1节）则表达CD45.1细胞表面标志物。
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讨论
尽管骨髓增生异常综合征（MDS）是一种克隆性造血干细胞疾病，但MDS的"干细胞"或起始细胞尚未被明确鉴定。我们先前已证明，通过造血干细胞移植（HSCT），使用NHD13小鼠的骨髓可将MDS移植至野生型（WT）小鼠，其特征表现为大细胞性贫血、白细胞减少、中性粒细胞减少以及形态学上的发育异常证据15。此外，竞争性重群体实验发现，NHD13 MDS骨髓细胞具有生长优势。综合这些发现表明，MDS干细胞或起始细胞可能存在。目前正在进行更多实验，旨在结合本方案中描述的谱系标记染色方法，利用更明确的干细胞和祖细胞标记物（CD150、CD48、c-Kit和Sca-1）16，进一步明确MDS起始细胞的免疫表型特征15。
利用NHD13小鼠鉴定MDS起始细胞涉及复杂的流式细胞术分选过程。ex vivo对原代骨髓单个核细胞（BMNCs）的操作会对细胞造成压力，可能导致细胞死亡或功能丧失。因此，应尽量缩短ex vivo
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
本工作由美国国家癌症研究所、美国国立卫生研究院的院内研究计划资助（资助编号 ZIA SC 010378 和 BC 010983）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 14 mL 圆底管 | Falcon | 352057 | |
| Hank's 平衡盐溶液 | Lonza | 10-527F | |
| 抗 CD45.2 抗体 | Southern Biotech | 1800-15 | LOT# A077-T044O |
| 3 mL 注射器 | Monoject | 8881513934 | |
| 27-G 针头 | BD | 305109 | |
| 20-G 针头 | BD | 305176 | |
| 谱系抗体混合物（Lineage Cocktail） | Miltenyi | 130-090-858 | LOT# 5170418221 |
| 抗生物素抗体（Anti-Biotin antibodies） | Miltenyi | 130-113-288 | LOT# 5171109046 |
| 1 mL 注射器 | Excelint | 26027 | 胰岛素注射器 |
| 加热灯 | Thermo Fisher Scientific | E70001901 | |
| FACS 仪器 | Cytec | FACScan | 2 个激光器，5 色检测器 |
| FACS 分选仪 | Beckman Coulter | MOFLO ASTRIOS | 5 个激光器，23 个参数，可同时分选 6 个细胞群 |
| 碘化丙啶（Propidium Iodide） | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| γ 射线照射仪 | Best Theratronics | Gammacell 40 | |
| 血液采集管 | RAM scientific | 76011 | |
| 受体小鼠 | Charles River | B6-LY5.1/Cr, CD45.1 | |
| NUP98-HOXD13 小鼠 | n/a | C57Bl/6, CD45.2 | 种群维持于美国国立卫生研究院（NIH） |
| 5 mL 圆底管 | Falcon | 352058 |
参考文献
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