人外周血和淋巴组织中原发性 T 细胞突触界面的评价

对 t 细胞免疫突触的结构特征及其与 t 细胞功能活动的联系的科学知识, 主要来源于从 PB 中提取的细胞系和克隆的研究。这些发现与从血液或人类淋巴组织获得的初级 t 细胞的程度仍不清楚, 因为在淋巴和其他组织中的 t 细胞的突触界面迄今尚未分析。重要的是, 新出现的数据表明, 与 PB^6、7相比, 组织居民和淋巴器官衍生的 T 细胞在表型和功能活性上可能有显著差异。这进一步巩固了需要更好地了解 t 细胞突触界面的特点在原发性人类 T 细胞。

为此, 我们开发了一种新的小尺度方法, 利用多通道流幻灯片中的脂质双层, 使我们能够进行 t 细胞/双层界面的成像, 其分离出的人 PB 和 LN 不到 10⁵个初级 t 细胞。这项新技术允许研究人类 T 细胞突触界面的生物物理特性, 以便更好地模型和了解体内细胞间的相互作用。

这项研究是按照《赫尔辛基宣言》进行的。从所有参与者获得书面知情同意, 在宾夕法尼亚大学的机构审查委员会 (IRB#809316, IRB 815056 号) 的批准下获得了血液和淋巴结样本。所有的人类臣民都是成年人。在托马斯杰斐逊大学产科 & 妇科的分娩和分娩中, 提供脐带血样本。所有样品均被取消鉴定。

1. 为图像分析分离 CD4⁺ T 细胞

1. 从采集的样品中解冻1毫升整除, 其中含有 10⁷冷冻外周血单个核细胞 (PBMCs) 或淋巴结单个核细胞 (LNMCs)。在无菌罩中, 加入解冻的细胞到9毫升的 RPMI 补充青霉素/链霉素和谷氨酰胺。
   1. Centrifugate 细胞为10分钟在 300 x g在4°c, 吸入上清, 并且并用重悬细胞在5毫升补充的 RPMI 包含10% 血清 (完全培养基)。在37摄氏度的 CO₂孵化器中, 在一夜之间孵化细胞。
2. 第二天, 根据制造商的指示, 使用一个商业上可用的工具包对 CD4⁺ T 细胞进行负磁分类纯化。
3. 要测量新鲜纯化的 CD4⁺ T 细胞的数量, 混合5µL 的细胞悬浮与相同体积的台盼蓝溶液。加载一个 hemocytometer 与细胞-台盼蓝混合物和计数的活细胞内的5个部分的 hemocytometer。
4. 取细胞数的平均值并确定原细胞悬浮液中的细胞数: cells/1 毫升的数量 = 平均计数 x 2 x 10⁴。如果孤立单元格的总数太小, 请按不计算的那样使用单元格。
5. 离心细胞在 300 x g 10 分钟, 并并用重悬他们在一个化验缓冲区 (20 毫米 HEPES, pH 值 7.4, 137 毫米氯化钠, 2 毫米 Na₂HPO₄, 5 毫米 d-葡萄糖, 5 毫米氯化钾, 1 毫米氯化镁₂, 2 毫米 CaCl₂, 1% 人血清白蛋白) 10^{5/c13> cells/50 µL 或更少, 并保持细胞在4°c (为 h), 直到准备使用的实验。}
6. 根据有关的机构指引处理所有生物废物。
7. 如果想要作为控制细胞人口, 准备激活 CD8 T 细胞从脐血 PBMC, 安置 10⁷个细胞在5毫升完全培养基在 T25 养殖瓶覆盖以 anti-CD3 和 anti-CD28 抗体混合物在10个µg/毫升和1个µg/毫升分别。
8. 第二天, 从烧瓶中取出活化脐带血细胞, 用新鲜完整培养基冲洗 1x, 并在重组 IL-2 (100 U/毫升) 的存在下, 将细胞扩大2周。
9. 根据制造商的指示, 使用商业上可用的工具包, 通过负磁分类纯化脐带血 CD8⁺ T 细胞。根据1.3–1.6 和 PB CD8⁺ T 细胞的步骤中所述, 计数单元格并将介质交换到检测缓冲区。

2. 平面脂质双层的制备组件

1. 准备3种脂质体如另有说明⁵: (a) 0.4 毫米 DOPC (12-dioleoyl-锡-glycero-3-phosphocholine) 脂质体, (b) 0.4 毫米 DOPC 脂质体, 含 33 (摩尔) 狗-NTA (12-dioleoyl-锡-磷脂酰-3-[(N-(5-氨基-1-carboxypentyl) iminodiacetic 酸) 酰] (铵盐)) 脂质, (c) 0.4 毫米 DOPC 脂质体含有 4 (摩尔) Biotinyl 帽 PE (12-dioleoyl-锡-磷脂酰-3-乙醇胺 N (Cap Biotinyl) (钠盐))。
2. 准备5% 酪蛋白溶液, 如前所述⁵。
   1. 将5克酪蛋白粉溶于100毫升的超纯水中, 加入350µL 10 米氢氧化钠。根据可用的刻度, 在室温下2小时, 然后在4摄氏度一夜之间, 以慢速的速度在普通磁力搅拌器上搅拌一切。将 pH 值调整为 7.3, 并在4摄氏度的 10万 x g ultracentrifuge 2 小时的溶液。用0.22 µm 无菌过滤器过滤上清液, 并将溶液储存在整除数-80 摄氏度。
      注意: 氢氧化钠溶液可以引起化学烧伤, 并可能导致永久性失明后, 与眼睛接触。使用橡胶手套, 安全衣物和眼睛保护时, 处理此化学品或其解决方案。
3. 标签 anti-CD3 抗体与生物素, 以产生单 bionylated 抗体分子与先前描述的方法⁸。
   1. 在0.1 毫克/毫升的二甲基亚砜 (亚砜) 中制备 Biotin-PEO4-NHS 溶液。添加3.7 µL 的 Biotin-PEO4-NHS 溶液, 1 毫克的抗体0.5 毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 含有100毫米碳酸氢钠。
   2. 在室温下孵育2小时的混合物。在亚砜中, 用10毫克/毫升的方法制备出 488 NHS 酯的溶液。添加 Alexa 488 NHS 酯溶液的抗体标记的 Biotin-PEO4-NHS 在10倍摩尔过剩。
   3. 在室温下将混合料孵育1小时, 在常规磁力搅拌器上进行慢速搅拌。使用大小排除色谱法分离未绑定染料。
   4. 通过测量 280 nm (₂₈₀) 抗体溶液的光学密度来确定抗体浓度。测量 577 nm (₅₇₇) 标记抗体的光学密度。
   5. 使用以下公式确定染料与抗体的比值:
      
      注意: 在制造商的协议中查找其他详细信息。
4. 在果蝇表达系统中表达重组可溶性 ICAM-1 蛋白, 如前所述^{3、4、9、10}。
   1. 克隆, 用 cDNA 编码, 胞外区 ICAM-1 成果蝇表达载体 pMT/V5-His 与诱导金属硫蛋白促进剂, 以产生重组蛋白追加了他的₆标签在 C 端端。
   2. 染 S2 细胞与所产生的 ICAM-1 含有质粒和 G418 表达载体。选择稳定的 transfectants 使用施耐德的果蝇媒体补充10% 胎小牛血清 (FCS) 和0.5 毫克/毫升的 G418 3 周。在无血清昆虫培养基中展开细胞, 并诱导0.5 毫米丘索₄的蛋白表达 3 d。
   3. 通过一个切向流选矿厂集中的文化上清10x 和透析对 PBS, 如前所述¹¹。
   4. 将浓缩培养上清液应用于含琼脂糖的一列, 其中含有共价键固定化 anti-ICAM-1 单克隆抗体, 洗脱 ICAM-1 与50毫米甘氨酸缓冲, pH 3.0。立即中和洗脱 ICAM-1 蛋白与2米的三个缓冲, pH 值8.0。
   5. 透析洗脱材料对抗 PBS, pH 值为 8.0, 并将透析材料添加到含有镍 NTA 琼脂糖的柱上。洗脱可溶性 ICAM-1 与200毫米咪唑, pH 8.0。透析洗脱材料对抗 PBS 缓冲器, pH 值为8.0。
   6. 根据制造商的指示, 用 Cy5 NHS 酯标记纯化的 ICAM-1。
      注: 最佳最终染料蛋白比为1:1。
5. 用木瓜蛋白酶消化 anti-CD107a 抗体, 用离子交换色谱法纯化晶圆碎片, 如前³所述。根据制造商的指示, 用 Alexa 的 568 NHS 酯标记该工厂的碎片。

3. 玻璃支持的平面脂质双层的形成

1. 通过混合140毫升浓硫酸和60毫升30% 过氧化氢, 制备出一种新的酸性食人鱼溶液。通过浸泡在酸性食人鱼溶液中30分钟, 将玻璃盖玻片为流片冲洗. 用聚丙烯剪刀式镊子握住玻璃盖玻片。
   注意: 食人鱼溶液是一种极强的氧化剂。在处理解决方案时, 切记在任何时候佩戴安全眼镜、护目镜或全脸防护罩和厚橡皮手套。只与食人鱼解决方案在通风罩下工作。避免在使用过程中的任何时间加热、运输或摇动, 因为它可能会爆炸。将食人鱼废料收集到带有含铅孔的玻璃瓶中。与机构安全委员会联系, 了解适当的废物利用情况。
2. 用超纯水冲洗洗净的盖玻片 7x, 将它们依次转换成含有淡水的烧杯。把湿盖玻片放在一边, 让剩余的水滚出干净的玻璃, 留下干燥的玻璃。
   1. 或者, 使用连接到真空泵的吸管尖端, 小心地从盖玻片中取出剩余的水滴。
3. 在无菌罩中, 进行各种脂质的稀释, 以产生脂质体混合, 使双层。首先, 结合37µL 的 DOPC 脂质体和3µL 的 Biotinyl 帽 PE 脂质体。第二, 混合14µL 的 DOPC 脂质体和15µL 的狗 NTA 脂质体。第三, 添加1µL 的第一个混合到29µL 的第二个组合, 以制造最终的脂质体混合物。
4. 在消毒罩, 设置一个工作区与干燥盖玻片附近。整除2µL 的最终脂质体混合物 (见步骤 3.3) 精确地在一个自粘性滑动通道的中心。立即和非常精确地对齐干净和干燥的盖玻片与幻灯片, 并轻轻地降低盖玻片在粘性一侧的幻灯片。
   1. 如果准备一张以上的幻灯片, 在一次幻灯片上工作, 因为脂质体混合物迅速蒸发。翻转幻灯片, 使用聚丙烯剪刀式钳外圈, 对盖玻片与滑块的外围接触施加温和压力, 确保滑块与滑轨紧密相连以防止泄漏。
      注意: 请勿按幻灯片的通道, 以免破坏或开裂盖玻片。
   2. 再次翻转幻灯片, 并标记形成的双层的位置, 这看起来像盖玻片和通道幻灯片之间的下降, 通过绘制4点, 并围绕在组件的外部幻灯片一侧的双层上的永久性标记。
5. 在第一次注入液体进入通道之前, 将通道的一个端口指定为入口端口, 另一个作为出口端口, 并在整个实验中保持这个指定。
6. 为避免形成气泡, 请将吸管尖端的末端直接插入通道的入口端口。用50µL (至少室温) 化验缓冲器慢慢填满幻灯片的通道 (请参阅步骤 1.5, 以了解缓冲成分)。
7. 准备0.5 米 (二) 氯化镍溶液。将酪蛋白溶液的2毫升整除在37摄氏度的水浴中解冻30分钟, 并在最终浓度为200µM 的情况下用氯化镍溶液补充。
8. 先将酪蛋白溶液的100µL 注入通道的入口端口, 然后立即将100µL 从幻灯片的出口端口上移除吹打, 以清洗双层。通过将酪蛋白溶液的100µL 注入每个通道的入口端, 并在室温下孵化出45分钟的滑块, 以相同的溶液阻断双层。
9. 解冻整除数的 Cy5-ICAM-1-His₆和链亲和素蛋白。将检测缓冲器中的蛋白质组合成2µg/毫升的最终浓度。离心解决方案为30分钟在 2万 x g 和4°c, 以消除任何骨料。
10. 通过吹打从幻灯片通道的退出端口删除其余的阻止解决方案。将包含 ICAM-1 和链亲和素的解决方案注入100µL 进入入口端口。
11. 在室温下孵化45分钟的滑梯。从出口口取出任何多余的蛋白质溶液。先将检测缓冲区的100µL 注入通道的入口端口, 然后立即将100µL 移出出口端口, 清洗双层2x。
12. 将 Alexa-Fluor-488-labelled anti-CD3 抗体稀释为最终浓度为2µg/毫升的检测缓冲器。将100µL 的抗体溶液注入幻灯片的入口口, 室温下孵化45分钟。从出口口取出任何多余的蛋白质溶液。清洗双层2x 与100µL 的化验缓冲区, 如在步骤3.11。

4. T 细胞与平面双层的相互作用的成像

1. 预热的阶段和目标的共焦或全内反射荧光 (TIRF) 显微镜, 直到温度平衡在37摄氏度。在加热的舞台上用双层 (s) 设置幻灯片。根据油墨的标记将舞台移动到合适的位置, 并将焦点放在使用 ICAM-1 分子的荧光的双层上。
   1. 使用61X 目标为共焦显微镜, 或100X 目标 TIRF 显微镜, 与适当的过滤器设置。
2. 对于 TIRF 显微镜下的颗粒释放成像, 在将细胞注入进入端口之前, 在最终浓度为4µg/毫升的细胞悬浮液中加入 Alexa-Fluor-568-labeled anti-CD107a 抗体。
   1. 并用重悬从 LN 或铅或脐血中分离出的 CD4⁺ T 细胞, 并将50µL 的细胞悬浮液注入包含双层的滑动通道的入口口。
3. 选择所需的字段数, 并在注入后每2分钟为30分钟记录每个字段的图像。
4. 利用共焦显微镜的亮场、反射光和荧光通道 (Alexa 488 和 Cy5) 获取图像。使用 TIRF 模式 Alexa-Fluor-488 和 Alexa-Fluor-568 荧光和 widefield Cy5 荧光, 以及光明场成像, 在 TIRF 显微镜。

5. 图像分析

1. 使用适当的软件分析获取的图像。观察透射光图像中的细胞形态学, 从分析中排除聚集和明显受损或凋亡细胞。仅在分析中包括那些卓有成效地与双层表面相互作用的细胞 (即在界面上积聚 Alexa-Fluor-488 荧光 (anti-CD3 抗体) 的细胞)。
2. 在细胞双层相互作用启动后, 确定细胞黏附面积的大小为20分钟。
   注: 粘附区域是在干涉反射显微镜 (IRM) 图像的细胞双层界面上开发的暗区。
3. 观察 Cy5-ICAM-1 荧光的任何积累和环状结的形成, 在细胞双层界面上分离 Cy-ICAM-1 分子。如果积累的 ICAM-1 分子在至少两个连续的图像上形成了粘接环结, 则指定这样的细胞作为细胞开发外周超分子活化簇 (pSMAC)¹²。
4. 通过在靠近细胞的接触区域外的背景荧光测量 T 细胞双层界面上的 Alexa-Fluor-568 荧光强度来评估颗粒释放。指定具有 Alexa-Fluor-568 信号与背景的比率至少为 degranulating 细胞1.3 的细胞。

首先, 我们比较了在传统的大型流动细胞系统中建立的由活化脐带-血源 CD8+ T 细胞形成的双层的突触界面结构 (见材料表详细资料)1 、2、3、4或多通道流幻灯片。双层含有荧光标记的 anti-CD3 和 ICAM-1, 分别为50分子/µm2和300分子/µm2。从人脐血中提取的 CD8+ T 细胞由 anti-CD3 和 anti-CD28 抗体13、14的刺激激活。CD8 和 T 细胞之间没有区别, 形成了典型的免疫突触在脂双层建立在流动细胞或多通道流幻灯片 (图 1)。所有其它实验均采用多通道流片中的脂双层进行。

其次, 我们研究了铅和 LN 的人 CD4+ T 细胞与平面脂质双层和释放颗粒形成突触界面的能力。我们利用 TIRF 显微镜, 最大限度地提高 T 细胞双层界面的垂直分辨率, 以可视化 degranulating 细胞, 并评估颗粒释放的动力学。我们观察到4组细胞的 PBMC 和 CD4+ T 细胞: 一些 t 细胞建立了成熟的免疫突触, 但要么做或没有释放颗粒, 其他 t 细胞释放的颗粒没有成熟的突触形成, 仍然其他 T 细胞既不形成突触也不释放颗粒 (图 2)7。当对颗粒释放的动力学进行评价时, PBMC CD4+ T 细胞的差异变得明显。PBMC 衍生的 CD4+ T 细胞能够开始释放颗粒几乎两倍的速度与 LN CD4+细胞 (图 3)7。总的来说, 数据表明, 尽管 PBMC 和 CD4 细胞的异质性, 但后者含有一小部分能够快速脱粒的 t 细胞。

图 1: 流滑系统与常规流腔的比较.(A) 此面板显示多通道流幻灯片, 允许组装6玻璃支持的平面脂双层。每个双层连接到交货和出口端口。不足 1 x 105细胞足以进行分析。(B) 本小组展示了传统的流动室系统, 允许组装1玻璃支持的平面脂质双层。分析需要 2 x 106细胞。其他面板显示 (C和D) 代表 TIRF 显微术和 (E和F) 共聚焦与干涉反射显微镜 (IRM) 图像的接口开发由活化脐带-血液衍生 CD8 T 细胞。细胞暴露在含有 ICAM-1 的脂双层 (300 分子/µm2) 和 anti-CD3 抗体 (50 分子/µm2) 中获得 (C和E) 在流动的幻灯片或 (D和F) 在常规在类似条件下的流量系统。采用100X 和60X 放大目标分别对 TIRF 显微术和 IRM 图像进行共焦。在流滑或常规流腔内形成成熟突触的 T 细胞的百分比是非常相似的, 但实验从75% 到90% 之间是不同的。在所有图像中, Cy-5-labelled ICAM-1 分子以蓝色显示;Alexa-Fluor-488-labeled anti-CD3 抗体呈绿色显示;Alexa-Fluor-568-labeled anti-CD107a 抗体绑定到 CD107a 的红色显示;IRM 图像以青色显示;刻度条长度为10µm。请单击此处查看此图的较大版本.

图 2: t cell–bilayer 界面的结构和脱粒的形态, 由淋巴结和外周血单个核 CD4+ T 细胞组成。LNMC 或 PBMC 的细胞被归类为分离的 CD4+ T 细胞, 暴露于双层含有50分子/µm2的 anti-CD3 抗体和300分子/µm2的 ICAM-1 蛋白。细胞与双层之间的界面由 TIRF 显微镜成像。刻度条为5µm. (a) t 细胞双层界面的这些代表性图像展示了 t cell–bilayer 界面和脱粒模式的结构。(B) 这些图显示了 LNMC 和 PBMC 衍生的 CD4+ T 细胞具有不同的突触界面结构和颗粒释放模式的表达。请单击此处查看此图的较大版本.

图 3: T cell–bilayer 界面结构的动态变化和脱粒淋巴结和外周血单个核 CD4+ T 细胞的动力学.(A) 本小组显示 T cell–bilayer 界面的时间依赖性变化和释放颗粒的外观。刻度条为5µm. (B) 本小组显示了由 CD4+ t 细胞 (闭合圆) 和 PBMC 衍生的 CD4+ t 细胞 (开阔圆圈) 的颗粒释放动力学的定量。每个单独的圈子表明第一次出现可检测的微粒释放由各自的细胞。为所有散点图显示中值和 IQR (四分位范围)。曼-惠特尼测试进行比较的差异, 表明组的 T 细胞。* p < 0.05, ** p < 0.01。请单击此处查看此图的较大版本.

作者没有什么可透露的。