人外周血和淋巴组织中原发性 T 细胞突触界面的评价

Summary

该协议描述了一种研究原发性多克隆人 T 细胞通过平面脂质双层形成突触界面的能力的技术。利用该技术显示了从淋巴结和外周血中提取的人原发性 T 细胞的差异突触形成能力。

Abstract

目前对 t 细胞突触界面的动力学和结构特征的理解, 主要是通过使用玻璃支持的平面双层和体外衍生的 t 细胞克隆或^1、2 线来确定的. ^,3,4。这些发现如何适用于从血液或淋巴组织中分离出来的主要人类 T 细胞是不知道的, 部分原因是在获得足够数量的细胞进行分析⁵方面存在重大困难。在这里, 我们通过开发一种利用多通道流幻灯片来构建含有活化和粘附分子的平面脂双层来解决这一问题。低高度的流动幻灯片促进快速细胞沉淀, 以同步细胞: 双层附着, 从而允许研究人员的动态的突触界面形成和动力学的颗粒释放。应用这种方法分析了 10⁴至 10⁵只从淋巴结 (LN) 和外周血 (PB) 中分离出的低温保存 T 细胞的突触界面。结果表明, 新的平面脂质双层技术能够研究健康和疾病背景下从血液和组织中提取的人 T 细胞的生物物理特性。

Introduction

对 t 细胞免疫突触的结构特征及其与 t 细胞功能活动的联系的科学知识, 主要来源于从 PB 中提取的细胞系和克隆的研究。这些发现与从血液或人类淋巴组织获得的初级 t 细胞的程度仍不清楚, 因为在淋巴和其他组织中的 t 细胞的突触界面迄今尚未分析。重要的是, 新出现的数据表明, 与 PB^6、7相比, 组织居民和淋巴器官衍生的 T 细胞在表型和功能活性上可能有显著差异。这进一步巩固了需要更好地了解 t 细胞突触界面的特点在原发性人类 T 细胞。

为此, 我们开发了一种新的小尺度方法, 利用多通道流幻灯片中的脂质双层, 使我们能够进行 t 细胞/双层界面的成像, 其分离出的人 PB 和 LN 不到 10⁵个初级 t 细胞。这项新技术允许研究人类 T 细胞突触界面的生物物理特性, 以便更好地模型和了解体内细胞间的相互作用。

Protocol

这项研究是按照《赫尔辛基宣言》进行的。从所有参与者获得书面知情同意, 在宾夕法尼亚大学的机构审查委员会 (IRB#809316, IRB 815056 号) 的批准下获得了血液和淋巴结样本。所有的人类臣民都是成年人。在托马斯杰斐逊大学产科 & 妇科的分娩和分娩中, 提供脐带血样本。所有样品均被取消鉴定。

1. 为图像分析分离 CD4⁺ T 细胞

1. 从采集的样品中解冻1毫升整除, 其中含有 10⁷冷冻外周血单个核细胞 (PBMCs) 或淋巴结单个核细胞 (LNMCs)。在无菌罩中, 加入解冻的细胞到9毫升的 RPMI 补充青霉素/链霉素和谷氨酰胺。
   1. Centrifugate 细胞为10分钟在 300 x g在4°c, 吸入上清, 并且并用重悬细胞在5毫升补充的 RPMI 包含10% 血清 (完全培养基)。在37摄氏度的 CO₂孵化器中, 在一夜之间孵化细胞。
2. 第二天, 根据制造商的指示, 使用一个商业上可用的工具包对 CD4⁺ T 细胞进行负磁分类纯化。
3. 要测量新鲜纯化的 CD4⁺ T 细胞的数量, 混合5µL 的细胞悬浮与相同体积的台盼蓝溶液。加载一个 hemocytometer 与细胞-台盼蓝混合物和计数的活细胞内的5个部分的 hemocytometer。
4. 取细胞数的平均值并确定原细胞悬浮液中的细胞数: cells/1 毫升的数量 = 平均计数 x 2 x 10⁴。如果孤立单元格的总数太小, 请按不计算的那样使用单元格。
5. 离心细胞在 300 x g 10 分钟, 并并用重悬他们在一个化验缓冲区 (20 毫米 HEPES, pH 值 7.4, 137 毫米氯化钠, 2 毫米 Na₂HPO₄, 5 毫米 d-葡萄糖, 5 毫米氯化钾, 1 毫米氯化镁₂, 2 毫米 CaCl₂, 1% 人血清白蛋白) 10^{5/c13> cells/50 µL 或更少, 并保持细胞在4°c (为 h), 直到准备使用的实验。}
6. 根据有关的机构指引处理所有生物废物。
7. 如果想要作为控制细胞人口, 准备激活 CD8 T 细胞从脐血 PBMC, 安置 10⁷个细胞在5毫升完全培养基在 T25 养殖瓶覆盖以 anti-CD3 和 anti-CD28 抗体混合物在10个µg/毫升和1个µg/毫升分别。
8. 第二天, 从烧瓶中取出活化脐带血细胞, 用新鲜完整培养基冲洗 1x, 并在重组 IL-2 (100 U/毫升) 的存在下, 将细胞扩大2周。
9. 根据制造商的指示, 使用商业上可用的工具包, 通过负磁分类纯化脐带血 CD8⁺ T 细胞。根据1.3–1.6 和 PB CD8⁺ T 细胞的步骤中所述, 计数单元格并将介质交换到检测缓冲区。

2. 平面脂质双层的制备组件

1. 准备3种脂质体如另有说明⁵: (a) 0.4 毫米 DOPC (12-dioleoyl-锡-glycero-3-phosphocholine) 脂质体, (b) 0.4 毫米 DOPC 脂质体, 含 33 (摩尔) 狗-NTA (12-dioleoyl-锡-磷脂酰-3-[(N-(5-氨基-1-carboxypentyl) iminodiacetic 酸) 酰] (铵盐)) 脂质, (c) 0.4 毫米 DOPC 脂质体含有 4 (摩尔) Biotinyl 帽 PE (12-dioleoyl-锡-磷脂酰-3-乙醇胺 N (Cap Biotinyl) (钠盐))。
2. 准备5% 酪蛋白溶液, 如前所述⁵。
   1. 将5克酪蛋白粉溶于100毫升的超纯水中, 加入350µL 10 米氢氧化钠。根据可用的刻度, 在室温下2小时, 然后在4摄氏度一夜之间, 以慢速的速度在普通磁力搅拌器上搅拌一切。将 pH 值调整为 7.3, 并在4摄氏度的 10万 x g ultracentrifuge 2 小时的溶液。用0.22 µm 无菌过滤器过滤上清液, 并将溶液储存在整除数-80 摄氏度。
      注意: 氢氧化钠溶液可以引起化学烧伤, 并可能导致永久性失明后, 与眼睛接触。使用橡胶手套, 安全衣物和眼睛保护时, 处理此化学品或其解决方案。
3. 标签 anti-CD3 抗体与生物素, 以产生单 bionylated 抗体分子与先前描述的方法⁸。
   1. 在0.1 毫克/毫升的二甲基亚砜 (亚砜) 中制备 Biotin-PEO4-NHS 溶液。添加3.7 µL 的 Biotin-PEO4-NHS 溶液, 1 毫克的抗体0.5 毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 含有100毫米碳酸氢钠。
   2. 在室温下孵育2小时的混合物。在亚砜中, 用10毫克/毫升的方法制备出 488 NHS 酯的溶液。添加 Alexa 488 NHS 酯溶液的抗体标记的 Biotin-PEO4-NHS 在10倍摩尔过剩。
   3. 在室温下将混合料孵育1小时, 在常规磁力搅拌器上进行慢速搅拌。使用大小排除色谱法分离未绑定染料。
   4. 通过测量 280 nm (₂₈₀) 抗体溶液的光学密度来确定抗体浓度。测量 577 nm (₅₇₇) 标记抗体的光学密度。
   5. 使用以下公式确定染料与抗体的比值:
      
      注意: 在制造商的协议中查找其他详细信息。
4. 在果蝇表达系统中表达重组可溶性 ICAM-1 蛋白, 如前所述^{3、4、9、10}。
   1. 克隆, 用 cDNA 编码, 胞外区 ICAM-1 成果蝇表达载体 pMT/V5-His 与诱导金属硫蛋白促进剂, 以产生重组蛋白追加了他的₆标签在 C 端端。
   2. 染 S2 细胞与所产生的 ICAM-1 含有质粒和 G418 表达载体。选择稳定的 transfectants 使用施耐德的果蝇媒体补充10% 胎小牛血清 (FCS) 和0.5 毫克/毫升的 G418 3 周。在无血清昆虫培养基中展开细胞, 并诱导0.5 毫米丘索₄的蛋白表达 3 d。
   3. 通过一个切向流选矿厂集中的文化上清10x 和透析对 PBS, 如前所述¹¹。
   4. 将浓缩培养上清液应用于含琼脂糖的一列, 其中含有共价键固定化 anti-ICAM-1 单克隆抗体, 洗脱 ICAM-1 与50毫米甘氨酸缓冲, pH 3.0。立即中和洗脱 ICAM-1 蛋白与2米的三个缓冲, pH 值8.0。
   5. 透析洗脱材料对抗 PBS, pH 值为 8.0, 并将透析材料添加到含有镍 NTA 琼脂糖的柱上。洗脱可溶性 ICAM-1 与200毫米咪唑, pH 8.0。透析洗脱材料对抗 PBS 缓冲器, pH 值为8.0。
   6. 根据制造商的指示, 用 Cy5 NHS 酯标记纯化的 ICAM-1。
      注: 最佳最终染料蛋白比为1:1。
5. 用木瓜蛋白酶消化 anti-CD107a 抗体, 用离子交换色谱法纯化晶圆碎片, 如前³所述。根据制造商的指示, 用 Alexa 的 568 NHS 酯标记该工厂的碎片。

3. 玻璃支持的平面脂质双层的形成

1. 通过混合140毫升浓硫酸和60毫升30% 过氧化氢, 制备出一种新的酸性食人鱼溶液。通过浸泡在酸性食人鱼溶液中30分钟, 将玻璃盖玻片为流片冲洗. 用聚丙烯剪刀式镊子握住玻璃盖玻片。
   注意: 食人鱼溶液是一种极强的氧化剂。在处理解决方案时, 切记在任何时候佩戴安全眼镜、护目镜或全脸防护罩和厚橡皮手套。只与食人鱼解决方案在通风罩下工作。避免在使用过程中的任何时间加热、运输或摇动, 因为它可能会爆炸。将食人鱼废料收集到带有含铅孔的玻璃瓶中。与机构安全委员会联系, 了解适当的废物利用情况。
2. 用超纯水冲洗洗净的盖玻片 7x, 将它们依次转换成含有淡水的烧杯。把湿盖玻片放在一边, 让剩余的水滚出干净的玻璃, 留下干燥的玻璃。
   1. 或者, 使用连接到真空泵的吸管尖端, 小心地从盖玻片中取出剩余的水滴。
3. 在无菌罩中, 进行各种脂质的稀释, 以产生脂质体混合, 使双层。首先, 结合37µL 的 DOPC 脂质体和3µL 的 Biotinyl 帽 PE 脂质体。第二, 混合14µL 的 DOPC 脂质体和15µL 的狗 NTA 脂质体。第三, 添加1µL 的第一个混合到29µL 的第二个组合, 以制造最终的脂质体混合物。
4. 在消毒罩, 设置一个工作区与干燥盖玻片附近。整除2µL 的最终脂质体混合物 (见步骤 3.3) 精确地在一个自粘性滑动通道的中心。立即和非常精确地对齐干净和干燥的盖玻片与幻灯片, 并轻轻地降低盖玻片在粘性一侧的幻灯片。
   1. 如果准备一张以上的幻灯片, 在一次幻灯片上工作, 因为脂质体混合物迅速蒸发。翻转幻灯片, 使用聚丙烯剪刀式钳外圈, 对盖玻片与滑块的外围接触施加温和压力, 确保滑块与滑轨紧密相连以防止泄漏。
      注意: 请勿按幻灯片的通道, 以免破坏或开裂盖玻片。
   2. 再次翻转幻灯片, 并标记形成的双层的位置, 这看起来像盖玻片和通道幻灯片之间的下降, 通过绘制4点, 并围绕在组件的外部幻灯片一侧的双层上的永久性标记。
5. 在第一次注入液体进入通道之前, 将通道的一个端口指定为入口端口, 另一个作为出口端口, 并在整个实验中保持这个指定。
6. 为避免形成气泡, 请将吸管尖端的末端直接插入通道的入口端口。用50µL (至少室温) 化验缓冲器慢慢填满幻灯片的通道 (请参阅步骤 1.5, 以了解缓冲成分)。
7. 准备0.5 米 (二) 氯化镍溶液。将酪蛋白溶液的2毫升整除在37摄氏度的水浴中解冻30分钟, 并在最终浓度为200µM 的情况下用氯化镍溶液补充。
8. 先将酪蛋白溶液的100µL 注入通道的入口端口, 然后立即将100µL 从幻灯片的出口端口上移除吹打, 以清洗双层。通过将酪蛋白溶液的100µL 注入每个通道的入口端, 并在室温下孵化出45分钟的滑块, 以相同的溶液阻断双层。
9. 解冻整除数的 Cy5-ICAM-1-His₆和链亲和素蛋白。将检测缓冲器中的蛋白质组合成2µg/毫升的最终浓度。离心解决方案为30分钟在 2万 x g 和4°c, 以消除任何骨料。
10. 通过吹打从幻灯片通道的退出端口删除其余的阻止解决方案。将包含 ICAM-1 和链亲和素的解决方案注入100µL 进入入口端口。
11. 在室温下孵化45分钟的滑梯。从出口口取出任何多余的蛋白质溶液。先将检测缓冲区的100µL 注入通道的入口端口, 然后立即将100µL 移出出口端口, 清洗双层2x。
12. 将 Alexa-Fluor-488-labelled anti-CD3 抗体稀释为最终浓度为2µg/毫升的检测缓冲器。将100µL 的抗体溶液注入幻灯片的入口口, 室温下孵化45分钟。从出口口取出任何多余的蛋白质溶液。清洗双层2x 与100µL 的化验缓冲区, 如在步骤3.11。

4. T 细胞与平面双层的相互作用的成像

1. 预热的阶段和目标的共焦或全内反射荧光 (TIRF) 显微镜, 直到温度平衡在37摄氏度。在加热的舞台上用双层 (s) 设置幻灯片。根据油墨的标记将舞台移动到合适的位置, 并将焦点放在使用 ICAM-1 分子的荧光的双层上。
   1. 使用61X 目标为共焦显微镜, 或100X 目标 TIRF 显微镜, 与适当的过滤器设置。
2. 对于 TIRF 显微镜下的颗粒释放成像, 在将细胞注入进入端口之前, 在最终浓度为4µg/毫升的细胞悬浮液中加入 Alexa-Fluor-568-labeled anti-CD107a 抗体。
   1. 并用重悬从 LN 或铅或脐血中分离出的 CD4⁺ T 细胞, 并将50µL 的细胞悬浮液注入包含双层的滑动通道的入口口。
3. 选择所需的字段数, 并在注入后每2分钟为30分钟记录每个字段的图像。
4. 利用共焦显微镜的亮场、反射光和荧光通道 (Alexa 488 和 Cy5) 获取图像。使用 TIRF 模式 Alexa-Fluor-488 和 Alexa-Fluor-568 荧光和 widefield Cy5 荧光, 以及光明场成像, 在 TIRF 显微镜。

5. 图像分析

1. 使用适当的软件分析获取的图像。观察透射光图像中的细胞形态学, 从分析中排除聚集和明显受损或凋亡细胞。仅在分析中包括那些卓有成效地与双层表面相互作用的细胞 (即在界面上积聚 Alexa-Fluor-488 荧光 (anti-CD3 抗体) 的细胞)。
2. 在细胞双层相互作用启动后, 确定细胞黏附面积的大小为20分钟。
   注: 粘附区域是在干涉反射显微镜 (IRM) 图像的细胞双层界面上开发的暗区。
3. 观察 Cy5-ICAM-1 荧光的任何积累和环状结的形成, 在细胞双层界面上分离 Cy-ICAM-1 分子。如果积累的 ICAM-1 分子在至少两个连续的图像上形成了粘接环结, 则指定这样的细胞作为细胞开发外周超分子活化簇 (pSMAC)¹²。
4. 通过在靠近细胞的接触区域外的背景荧光测量 T 细胞双层界面上的 Alexa-Fluor-568 荧光强度来评估颗粒释放。指定具有 Alexa-Fluor-568 信号与背景的比率至少为 degranulating 细胞1.3 的细胞。

Results

首先, 我们比较了在传统的大型流动细胞系统中建立的由活化脐带-血源 CD8⁺ T 细胞形成的双层的突触界面结构 (见材料表详细资料)^{1 、2、3、4}或多通道流幻灯片。双层含有荧光标记的 anti-CD3 和 ICAM-1, 分别为50分子/µm²和300分子/µm²。从人脐血中提取的 CD8⁺ T 细胞由 anti-CD3 和 anti-CD28 抗体^13、14的刺激激活。CD8 和 T 细胞之间没有区别, 形成了典型的免疫突触在脂双层建立在流动细胞或多通道流幻...

Discussion

此处描述的新技术利用了在常规流单元⁵中构建平面双层所需的类似试剂, 并可成功地应用于 cell–bilayer^、4 的初级人类 T 型接口的成像. ^,15。该技术提供了显着减少荧光分子的使用, 并要求10–20x 较少的 T 细胞相比, 流细胞系统⁵, 创造机会, 以分析主要人类 T 细胞从血液和其他组织。

在这项研究中使用的注射细胞数量使我们能够以60X 的目标对每个成像场中的50个细胞进行成像。更大的浓度导致细胞聚集, 减少了适合分析的细胞数量。我们可以进一步减少注射细胞的数量 10–50x, 但细胞数量的下限取决于细胞的异质性、成像场数和实验设计。一些调查人员以前使用了双层在开放的房间里建立了一个玻璃底部, 需要相同数量的细胞进行分析¹⁶。然而, 这...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD4 T 细胞分离试剂盒，人	Miltenyl Biotec	130-096-533
CD8 T 细胞分离试剂盒，人	Miltenyl Biotec	130-096-495
DOPC	Avanti 极性脂质	850375C
DOGS NTA	Avanti 极性脂质	790528C
生物素帽 PE	Avanti 极性脂质	870273C
人血清白蛋白	Octapharma USA	NDC 68982-643-01
粘性载玻片 VI 0.4	同上	80608
粘性载玻片盖玻片	同上	10812
Bioptech FCS2 腔室	Bioptech	060319-2-03
抗 CD3 抗体	Thermo Fisher Scientific	16-0037-81	OKT3 克隆，杂交瘤细胞可从 ATCC 获得
抗 CD28 抗体	Genetex	GTX14664	9.3 克隆
酪蛋白	Sigma	C5890
生物素-PEO4-NHS	Thermo Fisher Scientific	21329
DMSO	Sigma	D2650-5
Alexa Fluor 488 蛋白标记试剂盒，带标记蛋白纯化柱	Thermo Fisher Scientific	A10235
Alexa Fluor 568 蛋白标记试剂盒，带柱，用于标记蛋白纯化	Thermo Fisher Scientific	A10238
Amersham Cy5 NHS 酯	GE 生命科学	PA15101
pMT/V5-His A、B、C 果蝇表达载体	Thermo Fisher Scientific	V412020
pcopneo、G418 果蝇表达载体，用于阳性选择	ATCC	37409
无血清 果蔻培养基 Insect-XPRESS	Lonza	12-730Q
杂交瘤 YN1/1.7.4	ATCC	CRL1878	杂交瘤分泌抗 ICAM-1 的抗体。
溴化氰活化的琼脂糖凝胶 4B	Sigma-Aldrich	C9142	用于制备具有紧密结合的抗 ICAM 抗体的琼脂糖凝胶。
MasterFlex 切向流浓缩器	Cole-Parmer	77601-60 7592-40	用于含上清液的 ICAM-1 浓缩和含上清液的 ICAM-1 透析
Centramate 实验室切向流系统	Pall 实验室	FS002K10 OS010T12 FS005K10	用于含上清液浓缩的 ICAM-1 和含上清
Ni-NTA 琼脂糖的	QIAGEN	30210
透析管	Spectra/Por	131384
瓜蛋白酶，来自木瓜乳胶	Sigma	P3125
小鼠抗 CD107a	抗体 BD Bioscences	555798	克隆 H4A3
Ansell 自然蓝手套	Fisher Scientific	19-014-539
Nalgene 聚丙烯剪刀式镊子	Thermo Fisher Scientific	6320-0010
链霉亲和素	ProZyme	SA10
共聚焦显微镜	尼康		尼康 TiE 倒置显微镜，配备 PFS，用于长期图像稳定性控制，60 倍油物镜，4 个激光器，在 405、458、488、514、561 和 640 nm 处带激发线，2 个 GaAsP 检测器和 2 个高灵敏度 PMT，DIC 透射光，可编程 X、Y、Z 载物台，用于多个位置和大面积拼接， 延时功能，用于实时成像的Tokai-Hit温度和CO2控制室，以及防振隔离台
TIRF显微镜	Andor		Andor Revolution XD系统，配备尼康TIRF-E照明器，激光器405,488,561和640线，DIC透射光，用于共聚焦成像的横河电机CSU-X1旋转盘头，100/1.49 NA物镜，Andor iXon X3 EM-CCD相机， 物镜加热器和带有完美聚焦系统 （PFS） 的压电电动载物台MetaMorph
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