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方法文章

外周血和淋巴组织来源的人原代T细胞突触界面评估

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DOI：

10.3791/58143

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2018年7月30日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Thomas Jefferson University, 2Department of Microbiology and Institute for Immunology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Department of Medicine Huddinge, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital Huddinge, 4Departments of Microbiology and Immunology and Medical Oncology, Sidney Kimmel Cancer Center, Thomas Jefferson University

本文内容

摘要

本方案描述了一种利用平面脂质双层研究原代多克隆人T细胞形成突触界面能力的技术。我们采用该技术展示了来源于淋巴结和外周血的人原代T细胞在突触形成能力上的差异。

摘要

目前对T细胞突触界面的动力学和结构特征的理解在很大程度上依赖于玻璃支撑的平面双层膜技术的应用 体外衍生的T细胞克隆或细胞系1,2,3,4这些发现是否适用于从血液或淋巴组织中分离的原代人T细胞尚不清楚，部分原因是难以获得足够数量的细胞用于分析。5在此，我们通过开发一种利用多通道流动载片构建含激活分子和黏附分子的平面脂双层的技术来解决这一问题。流动载片的低高度可促进细胞快速沉降，从而同步细胞与脂双层的黏附过程，使研究人员能够研究突触界面形成的动态过程以及颗粒释放的动力学。我们应用该方法分析少至10个细胞的突触界面4 至 105 从淋巴结（LN）和外周血（PB）中分离的原代冷冻保存T细胞。结果表明，这种新型平面脂双层技术能够用于研究来源于血液和组织的原代人T细胞在健康与疾病状态下的生物物理特性。

引言

关于T细胞免疫突触的结构特征及其与T细胞功能活性之间关联的科学认知，主要来源于对源自外周血（PB）的细胞系和细胞克隆的研究。这些研究结果在多大程度上适用于从血液或人体淋巴组织中获取的原代T细胞，目前尚不明确，因为定居于淋巴组织及其他组织中的T细胞的突触界面迄今尚未得到分析。尤为重要的是，新兴数据表明，与外周血中的T细胞相比，组织驻留性T细胞及淋巴器官来源的T细胞在其表型和功能活性方面可能存在显著差异6,7。这进一步凸显了深入理解原代人T细胞突触界面特征的必要性。

为此，我们开发了一种新型的微型规模方法，利用构建于多通道流动载片中的脂双层，使我们能够对T细胞与脂双层界面进行成像，所需T细胞数量少于105 从人外周血（PB）和淋巴结（LN）中分离的原代T细胞。该新技术可用于研究原代人T细胞突触界面的生物物理特性，从而更准确地建模并深入理解 体内 细胞间相互作用

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方案

本研究遵循《赫尔辛基宣言》的规定进行。所有参与者均签署了书面知情同意书，并在宾夕法尼亚大学机构审查委员会（IRB#809316，IRB#815056）批准下采集血液和淋巴结样本。所有人类受试者均为成年人。脐带血样本由托马斯杰斐逊大学妇产科产科与分娩部门慷慨提供。所有样本均去标识化。

1. 用于图像分析的 CD4+ T 细胞分离

  1. 解冻含有10的1 mL等分试样7 冻存的外周血单个核细胞（PBMCs）或收集样本中的淋巴结单个核细胞（LNMCs）。在无菌操作台中，将解冻后的细胞加入9 mL RPMI培养基中，该培养基需添加青霉素/链霉素和谷氨酰胺。
    1. 离心细胞10分钟，300 x g g 在 4 °C，吸除上清液，将细胞重悬于5 mL含10% FBS的RPMI完全培养基中。将细胞在CO₂培养箱中过夜培养2 孵育箱于 37 °C.
  2. 第二天，纯化 CD4+ 使用商用试剂盒，按照生产商说明书通过负向免疫磁珠分选法分离T细胞。
  3. 为了测定新近纯化的 CD4+ T细胞，混合 5 µL 用等体积的台盼蓝溶液与细胞悬液混合。取细胞与台盼蓝的混合液滴加至血细胞计数板，计数其中5个区域内的活细胞数量。
  4. 取细胞数量的平均值，确定原始细胞悬液中的细胞数量：细胞数/1 mL = 平均细胞数 × 2 × 104如果分离得到的细胞总数过少，可直接使用细胞，无需计数。
  5. 将细胞在 300 x g 10 分钟，然后在检测缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.4，137 mM NaCl，2 mM Na2HPO4，5 mM D-葡萄糖，5 mM KCl，1 mM MgCl2，2 mM CaCl2，以及1%人血清白蛋白）在105 细胞50 µL 或更短时间，并保持细胞在 4 °C （放置1–2小时）直至实验时使用。
  6. 根据相关机构指南处理所有生物废弃物。
  7. 如需作为对照细胞群体，可从脐带血PBMC中制备活化的CD8 T细胞，放入107 在含有5 mL完全培养基的T25培养瓶中，加入抗CD3和抗CD28抗体混合物覆盖的细胞 10 µg/mL 和 1 µg/mL分别。
  8. 次日，从培养瓶中取出活化的脐带血细胞，用新鲜完全培养基洗涤1次，并在重组IL-2（100 U/mL）存在下扩增培养2周。
  9. 纯化脐带血 CD8+ 使用市售试剂盒，按照生产商说明书通过负向免疫磁珠分选法分离T细胞。计数细胞，并按照步骤1.3–1.6所述方法将细胞重悬于检测缓冲液中，用于淋巴结和外周血CD8⁺ T细胞+ T细胞

2. 平面脂双层制备的组分

  1. 按照 elsewhere 中所述方法制备 3 种脂质体5：（a）0.4 mM DOPC（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱）脂质体，（b）含有33 mol% DOGS-NTA（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱）的0.4 mM DOPC脂质体sn-甘油-3-[(N-(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨二乙酸)琥珀酰]（铵盐）脂质，(c) 0.4 mM DOPC 脂质体，其中含有 4 mol% Biotinyl-Cap-PE (1,2-二油酰基-sn甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(帽状生物素)（钠盐）
  2. 按先前所述方法制备5%酪蛋白溶液5.
    1. 将5 g酪蛋白粉末溶解于100 mL超纯水中，并加入 350 µL 10 M 氢氧化钠。根据可用规模，在常温下使用普通磁力搅拌器低速搅拌 2 小时，随后过夜继续搅拌 4 °C调节pH至7.3，然后在100,000 × g条件下超速离心2 h 4 °C. 用滤器过滤上清液 0.22 µm 无菌滤过，分装后于 -80 °C.
      警告：氢氧化钠溶液可导致化学灼伤，接触眼睛可能引起永久性失明。操作该化学品或其溶液时，应佩戴橡胶手套、防护服和护目用具。
  3. 采用先前描述的方法，用生物素标记抗CD3抗体，以制备单生物素化抗体分子8.
    1. 配制0.1 mg/mL的Biotin-PEO4-NHS二甲基亚砜（DMSO）溶液。加入 3.7 µL 将Biotin-PEO4-NHS溶液加入1 mg抗体中，溶剂为0.5 mL含100 mM碳酸氢钠的磷酸盐缓冲液（PBS）。
    2. 在室温下孵育混合物 2 小时。用 DMSO 配制 10 mg/mL 的 Alexa Fluor 488 NHS 酯溶液。将 Alexa Fluor 488 NHS 酯溶液以 10 倍摩尔过量加入至由 Biotin-PEO4-NHS 标记的抗体中。
    3. 在室温下，将混合物置于常规磁力搅拌器上缓慢搅拌孵育1小时。通过尺寸排阻色谱法分离未结合的染料。
    4. 通过测量抗体溶液在 280 nm 处的光密度（A280）。在577 nm处测定标记抗体的光密度（A577).
    5. 使用以下公式确定染料-抗体比率：
      在577 nm处通过吸光度计算每摩尔蛋白质所结合染料摩尔数的方程式；公式图示。
      注：更多详细信息请参见试剂盒生产商的说明书。
  4. 表达一种重组可溶性 ICAM-1 蛋白 果蝇 表达系统如先前所述3,4,9,10.
    1. 克隆编码 ICAM-1 胞外域的 cDNA 果蝇 表达载体 pMT/V5-His，该载体含有可诱导的金属硫蛋白启动子，用于表达带有 His 标签的重组蛋白6 C末端标签
    2. 将含有 ICAM-1 的质粒与 G418 表达载体共同转染 S2 细胞。使用 Schneider's 培养基筛选稳定转染子 果蝇 添加10%胎牛血清（FCS）和0.5 mg/mL G418的培养基中培养3周。在无血清昆虫培养基中扩增细胞，并用0.5 mM CuSO₄诱导蛋白表达4 3天。
    3. 将培养上清浓缩10倍，并对磷酸盐缓冲液进行透析 通过 切向流浓缩器，如先前所述11.
    4. 将浓缩的培养上清液上样至含有共价偶联抗ICAM-1单克隆抗体的Sepharose柱，用50 mM甘氨酸缓冲液（pH 3.0）洗脱结合的ICAM-1。洗脱后的ICAM-1蛋白立即用2 M Tris缓冲液（pH 8.0）中和。
    5. 将洗脱物在 pH 8.0 的 PBS 中透析，然后将透析后的样品加入含 Ni-NTA 琼脂糖的层析柱中。用 200 mM 咪唑（pH 8.0）洗脱可溶性 ICAM-1。将洗脱物再次在 pH 8.0 的 PBS 缓冲液中透析。
    6. 根据制造商说明书，用 Cy5 NHS 酯标记纯化的 ICAM-1。
      注意：最佳的最终染料与蛋白质比例为1:1。
  5. 通过木瓜蛋白酶消化抗CD107a抗体以制备Fab片段，并按先前所述方法通过离子交换色谱纯化Fab片段3. 根据制造商说明书，用 Alexa Fluor 568 NHS 酯标记 Fab 片段。

3. 玻璃支撑的平面脂双层的形成

  1. 通过将140 mL浓硫酸与60 mL 30%过氧化氢混合，制备新鲜的酸性piranha溶液。将用于流动池的玻璃盖玻片浸入piranha溶液中30分钟进行清洗。使用聚丙烯剪式镊子夹持玻璃盖玻片。
    警告：piranha溶液是一种极强的氧化剂。操作该溶液时，必须始终佩戴护目镜或面罩以及厚橡胶手套。仅可在通风橱内操作piranha溶液。使用过程中严禁加热、搬运或摇晃，以免发生爆炸。将piranha废液收集至带有铅衬里开口的玻璃瓶中。有关废液的正确处理方式，请联系机构安全委员会。
  2. 将清洗后的盖玻片依次转移至盛有新鲜超纯水的烧杯中，重复冲洗7次。将湿润的盖玻片放置一旁，使残留水分从洁净玻璃表面自然流下，留下干燥的玻璃表面。
    1. 也可使用连接至真空泵的移液枪头，小心吸除盖玻片上残留的水滴。
  3. 在无菌操作台中，对多种脂质进行稀释，以制备用于形成双层膜的脂质体混合物。首先，将37 µL DOPC脂质体与3 µL Biotinyl-Cap-PE脂质体混合；其次，将14 µL DOPC脂质体与15 µL DOGS-NTA脂质体混合；第三，将第一种混合物取1 µL加入29 µL第二种混合物中，制得最终的脂质体混合液。
  4. 在无菌操作台中，准备一个工作区，并将干燥的盖玻片置于附近。精确地将2 µL最终脂质体混合液（见步骤3.3）加至自粘式载玻片通道的中央。立即精确对齐洁净干燥的盖玻片与载玻片，并轻轻将盖玻片覆盖在载玻片的粘性面一侧。
    1. 若需制备多个载玻片，应逐个操作，因为脂质体混合液会迅速蒸发。将载玻片翻转，使用聚丙烯剪式镊子的外环对盖玻片与载玻片的边缘接触处施加轻微压力，确保盖玻片紧密贴合，防止泄漏。
      注意：切勿对载玻片的通道区域施压，以免盖玻片破裂或开裂。
    2. 再次将载玻片翻转，并用记号笔在组件外侧围绕双层膜位置标记四个点，以标示所形成的双层膜位置（双层膜在盖玻片与通道载玻片之间呈液滴状）。
  5. 在向通道首次注入液体前，指定通道的一个端口为进样口，另一个为出样口，并在整个实验过程中保持此设定。
  6. 为避免产生气泡，将移液枪头末端直接插入通道的进样口。使用50 µL温热（至少室温）的检测缓冲液（缓冲液组成见步骤1.5）缓慢填充载玻片的通道。
  7. 制备0.5 M氯化镍(II)溶液。将2 mL酪蛋白溶液在37 °C水浴中解冻30分钟，并加入氯化镍溶液，使其终浓度为200 µM。
  8. 首先通过进样口注入100 µL酪蛋白溶液，再立即从载玻片的出样口吸出100 µL，以清洗双层膜。随后通过向每个通道的进样口注入100 µL酪蛋白溶液封闭双层膜，并在室温下孵育45分钟。
  9. 解冻Cy5-ICAM-1-His6和链霉亲和素蛋白的分装样品。在检测缓冲液中将两种蛋白混合，使其终浓度均为2 µg/mL。在20,000 × g、4 °C条件下离心30分钟，以去除任何聚集体。
  10. 通过移液从载玻片通道的出样口移除剩余的封闭溶液。将100 µL含ICAM-1和链霉亲和素的溶液注入进样口。
  11. 在室温下孵育载玻片45分钟。从出样口移除多余的蛋白溶液。通过先向通道进样口注入100 µL检测缓冲液，再立即从出样口移除100 µL的方式，清洗双层膜2次。
  12. 用检测缓冲液稀释Alexa Fluor 488标记的抗CD3抗体，使其终浓度为2 µg/mL。将100 µL抗体溶液注入载玻片的进样口，并在室温下孵育45分钟。从出样口移除多余的蛋白溶液。按照步骤3.11的方法，用100 µL检测缓冲液清洗双层膜2次。

4. T细胞与平面双层膜相互作用的成像

  1. 将共聚焦显微镜或全内反射荧光（TIRF）显微镜的载物台和物镜预热，直至温度在 37 °C 下达到平衡。将含有双层膜的载玻片置于加热载物台上，根据墨水标记移动载物台至合适位置，并利用 Cy 标记的 ICAM-1 分子的荧光对双层膜进行调焦。
    1. 使用共聚焦显微镜的 61X 物镜，或 TIRF 显微镜的 100X 物镜，并设置适当的滤光片参数。
  2. 为通过 TIRF 显微镜成像颗粒释放，在将细胞注入进样口前，向细胞悬液中加入 Alexa-Fluor-568 标记的抗 CD107a 抗体 Fab 片段，终浓度为 4 µg/mL。
    1. 重悬从淋巴结（LN）、外周血（PB）或脐血中分离得到的已制备 CD4+ T 细胞，并将 50 µL 细胞悬液注入含有双层膜的载玻片通道进样口。
  3. 选择所需的视野数量，并在加样后每 2 分钟对每个视野进行一次图像采集，持续记录 30 分钟。
  4. 利用共聚焦显微镜的明场、反射光及荧光通道（Alexa 488 和 Cy5）采集图像。在 TIRF 显微镜上，对 Alexa-Fluor-488 和 Alexa-Fluor-568 荧光采用 TIRF 模式，对 Cy5 荧光及明场成像则采用宽场模式。

5. 图像分析

  1. 使用适当的软件分析所获得的图像。在透射光图像中观察细胞形态，并将成簇的、明显受损或凋亡的细胞从分析中排除。仅将与双层膜表面发生有效相互作用的细胞纳入分析即在界面处积聚Alexa-Fluor-488荧光（抗CD3抗体）的细胞。
  2. 在细胞-双层膜相互作用开始后20分钟，测定细胞黏附面积的大小。
    注意：黏附区域是指在干涉反射显微镜（IRM）图像上细胞-双层膜界面处形成的暗区。
  3. 观察Cy5-ICAM-1荧光在细胞-双层膜界面处的聚集情况，以及分离的Cy5-ICAM-1分子是否形成环状连接结构。若在至少连续两幅图像中均可见聚集的ICAM-1分子形成黏附环状连接结构，则将此类细胞归类为正在形成外周超分子激活簇（pSMAC）的细胞。12.
  4. 通过测量T细胞-双层膜界面处Alexa Fluor 568的荧光强度，并与细胞接触区域附近背景荧光进行比较，评估颗粒释放情况。将Alexa Fluor 568信号与背景荧光比值不低于1.3的细胞定义为脱颗粒细胞。

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结果

首先，我们比较了经活化的脐带血来源的CD8+ T细胞在两种不同系统中与脂质双层相互作用所形成的突触界面结构：一种是传统的大型流动池系统（详见材料表）1,2,3,4，另一种是多通道流动载片系统。这些脂质双层中分别含有50 分子/µm2的荧光标记抗CD3抗体和300 分子/µm2的ICAM-1。来源于人脐带血的CD8+ T细胞通过固定在板上的抗CD3和抗CD28抗体刺激而被激活13,14。在流动池或多通道流动载片中构建的脂质双层上，CD8+ T细胞均能形成典型的免疫...

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讨论

本文所述的新技术利用了与传统流动池中构建平面双层膜所需的相似试剂5，并可成功用于成像人原代T细胞与双层膜之间的界面3,4,15。该技术显著减少了荧光分子的使用量，且所需T细胞数量比流动池系统少10–20倍5，从而为分析来自血液及其他组织的人原代T细胞提供了可能。

本研究中注射的细胞数量使得我们能够使用60倍物镜在每个成像视野中观察约50个细胞。细胞浓度过高会导致细胞聚集，从而减少可用于分析的细胞数量。我们还可进一步将注射的细胞数量减少10–50倍，但细胞数量的下限取决于细胞异质性、成像视野的数量以及实验设计。此前一些研究人员曾使用在带有玻璃底的开放式腔室中构建的双层膜系统，该系统进行分析时所需的细胞数量与本研究相似16。然而，本文所述的封闭系统通道高度为0...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为R01AI118694，授予Michael R. Betts，其中包括授予Yuri Sykulev的子课题资助566950。我们感谢Sidney Kimmel癌症中心生物成像共享资源平台提供的出色支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
人CD4 T细胞分离试剂盒Miltenyl Biotec130-096-533
人CD8 T细胞分离试剂盒Miltenyl Biotec130-096-495
DOPCAvanti Polar Lipids850375C
DOGS NTAAvanti Polar Lipids790528C
生物素化帽PEAvanti Polar Lipids870273C
人血清白蛋白Octapharma USANDC 68982-643-01
sticky-Slide VI 0.4ibidi80608
sticky-Slide专用盖玻片ibidi10812
Bioptech FCS2腔室Bioptech060319-2-03
抗CD3抗体Thermo Fisher Scientific16-0037-81OKT3克隆，杂交瘤细胞可从ATCC获得
抗CD28抗体GenetexGTX146649.3克隆
酪蛋白SigmaC5890
生物素-PEO4-NHSThermo Fisher Scientific21329
DMSOSigmaD2650-5
Alexa Fluor 488蛋白标记试剂盒（含用于标记蛋白纯化的层析柱）Thermo Fisher ScientificA10235
Alexa Fluor 568蛋白标记试剂盒（含用于标记蛋白纯化的层析柱）Thermo Fisher ScientificA10238
Amersham Cy5 NHS酯GE Life SciencePA15101
pMT/V5-His A、B、C 果蝇表达载体Thermo Fisher ScientificV412020
pcopneo，用于阳性筛选的G418果蝇表达载体ATCC37409
无血清果蝇培养基Insect-XPRESSLonza12-730Q
杂交瘤YN1/1.7.4ATCCCRL1878该杂交瘤分泌抗ICAM-1抗体。
溴化氰活化的Sepharose 4BSigma-AldrichC9142用于制备共价结合抗ICAM抗体的Sepharose。
MasterFlex切向流浓缩仪Cole-Parmer77601-60 7592-40用于含ICAM-1上清液的浓缩及含ICAM-1上清液的透析
Centramate Lab切向流系统Pall LaboratoryFS002K10 OS010T12 FS005K10用于含ICAM-1上清液的浓缩及含ICAM-1上清液的透析
Ni-NTA琼脂糖QIAGEN30210
透析袋Spectra/Por131384
木瓜蛋白酶（来自木瓜乳胶）SigmaP3125
小鼠抗人CD107a抗体BD Biosciences555798克隆H4A3
Ansell Natural Blue手套Fisher Scientific19-014-539
Nalgene聚丙烯剪式镊子Thermo Fisher Scientific6320-0010
链霉亲和素ProZymeSA10
共聚焦显微镜Nikon配备PFS以实现长期成像稳定性控制的Nikon TiE倒置显微镜，60倍油镜，4个激光器，激发波长分别为405、458、488、514、561和640 nm，2个GaAsP探测器和2个高灵敏度PMT，DIC透射光，可编程X、Y、Z载物台用于多点成像和大范围图像拼接，延时成像功能，Tokai-Hit温控及CO2控制活细胞成像腔室，以及防震隔离台
TIRF显微镜AndorAndor Revolution XD系统，配备Nikon TIRF-E照明器，激光波长为405、488、561和640 nm，DIC透射光，Yokogawa CSU-X1转盘共聚焦头，100/1.49 NA物镜，Andor iXon X3 EM-CCD相机，物镜加热器，以及带Perfect Focus System (PFS)的压电马达化载物台
MetaMorph Premier图像分析软件Molecular Devices

参考文献

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T细胞突触界面平面脂质双层多通道流动载片全内反射荧光显微镜颗粒释放成像外周血T细胞淋巴结T细胞ICAM-1链霉亲和素Fluoro-4抗CD3
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