旁分泌和邻分泌细胞相互作用在多种生物过程中发挥重要作用，包括肿瘤进展、免疫应答、血管生成以及发育过程。本文采用一种邻近培养方法来研究旁分泌信号传导，该方法可在防止细胞直接接触的同时，维持分泌因子的局部浓度。
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摘要
摘要
细胞间相互作用在许多生物学过程中发挥着重要作用，包括肿瘤进展、免疫反应、血管生成以及发育过程。这类相互作用主要通过旁分泌或邻分泌信号通路介导。目前最常用的区分这两种相互作用的方法是使用条件培养基和共培养实验。然而，条件培养基无法准确模拟旁分泌相互作用过程中微环境中分泌因子局部高浓度的效应，因此可能导致结论不准确。为解决这一问题，我们设计了一种邻近培养方法用于研究旁分泌信号传导。该方法将两种细胞分别培养在厚度为10 µm、孔径为0.4 µm的聚碳酸酯膜的两侧。膜上的微孔允许分泌因子交换，同时有效阻断邻分泌信号传导。实验终点时可分别收集并裂解细胞，以评估旁分泌信号的影响。除了能够模拟分泌因子的局部浓度梯度外，该方法还适用于需要长时间培养的实验，以及抑制剂的应用。尽管我们使用该方法研究卵巢癌细胞与其在转移部位所接触的间皮细胞之间的相互作用，但该技术可适用于任意两种贴壁细胞类型，供研究人员在肿瘤微环境、免疫学及发育生物学等多个领域研究旁分泌信号传导。
引言
癌细胞与肿瘤微环境之间产生有益的相互作用在肿瘤进展中的作用已得到充分证实，并已成为癌症生物学研究的主要焦点之一1。类似的双向信号交流在伤口愈合、免疫反应、血管生成、干细胞微环境以及发育过程中也至关重要2,3,4,5,6,7,8。这些生物学过程的一个共同特点是，细胞以多种方式响应来自其微环境的胞外信号，从而决定细胞命运、组织生理功能以及疾病进展。因此，研究重点已日益转向深入理解此类细胞间通讯所涉及的机制。大多数此类相互作用涉及细胞间的旁分泌或接触依赖性信号传导。旁分泌信号传导是指一个细胞分泌特定的信号因子，被邻近细胞上的相应受体感知，从而在该细胞中引发反应9,10；而接触依赖性信号传导则需要两个参与细胞的细胞组分之间直接接触11,
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方案
该方案遵循印第安纳大学机构监管委员会的指导原则。
1. 细胞准备
- 人原代间皮细胞的分离与培养
- 按照先前所述方法17,18从人网膜组织中分离人原代间皮细胞（HPMCs），并在完全生长培养基[含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素、1%非必需氨基酸和1%维生素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）]中，于37 °C、5% CO2条件下培养。
注：HPMCs通常培养至100%融合（图1A）。
- 按照先前所述方法17,18从人网膜组织中分离人原代间皮细胞（HPMCs），并在完全生长培养基[含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素、1%非必需氨基酸和1%维生素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）]中，于37 °C、5% CO2条件下培养。
- 卵巢癌细胞的培养条件
- 在完全生长培养基中，于37 °C、5% CO2条件下培养HeyA8卵巢癌细胞。
注：使用培养至约80%融合的HeyA8细胞（图1B）。
- 在完全生长培养基中，于37 °C、5% CO2条件下培养HeyA8卵巢癌细胞。
2. 细胞培养
- 近端培养体系建立
- 使用适用于6孔板的Transwel....
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结果
转移性卵巢癌细胞在腹腔内转移部位会遇到间皮细胞19。与间皮细胞之间有效的旁分泌和邻近分泌相互作用有助于诱导卵巢癌细胞产生适应性反应，从而促进成功转移17,18,20,21。为了验证邻近共培养方法的有效性，我们检测了HeyA8卵巢癌细胞与HPMCs之间的旁分泌相互作用。已有研究报道，HeyA8细胞与HPMCs共培养可导致HPMCs中纤连蛋白表达水平升高21。这种纤连蛋白表达的上调是由HeyA8细胞分泌更多TGFβ所介导的21。因此，我们检测了HeyA8细胞与HPMCs进行邻近培养后，两种细胞中纤连蛋白和TGFβ的mRNA水平变化。与未在插入膜下表面附着HeyA8细胞的对照组相比，.......
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讨论
理解细胞间旁分泌和邻分泌信号传导的机制，对于深入认识正常组织稳态及疾病状态至关重要7,8。目前大多数旁分泌信号研究通过收集一种细胞类型的条件培养基，并用其处理另一种细胞类型来开展。该方法具有操作简便的优点，但无法准确模拟分泌因子在细胞微环境中的局部浓度，也无法真实再现相关因子生成与消耗的动力学过程。尽管可通过浓缩条件培养基在一定程度上（尽管不精确）解决前一个问题，但要重现因子生成与消耗的动力学过程则极为困难。使用Transwell小室将细胞分别培养在插入膜上和孔板底部，可在一定程度上重现因子生成与消耗的动力学效应；然而，由于细胞之间被插入膜与孔底之间的距离所分隔，因而无法模拟旁分泌因子的局部高浓度环境。我们报道了一种简单的邻近共培养方法，可用于研究相互性的旁分泌信号传导，该方法既保留了分泌因子的局部高浓度特性，又维持了因子生成与消耗速率的动态变化。
在一项原理验证研究中，我们证明了近端共培养方法在重现卵巢癌细胞与腹膜间皮细胞（HPMCs）相互作用已知效应方面的有效性.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢患者参与本研究的组织样本采集工作。本研究得到了美国国防部卵巢癌研究计划学院奖（DoD OCRP Ovarian Cancer Academy Award，编号：W81XWH-15-0253）以及Colleen's Dream基金会向Anirban K. Mitra提供的试点项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24 mm Transwell 可穿透支持物，带 0.4 µm 孔径聚碳酸酯膜插入物 | Corning (Costar) | 3412 | • 10 µm 厚半透明聚碳酸酯膜 • 经处理以实现最佳细胞贴附 • 每板6个插入物包装于6孔板中，每箱4板 • 膜需染色以使细胞可见 • 经γ射线灭菌 |
| 6 孔板 | Corning (Falcon) | 353046 | 平底，TC处理，无菌，带盖 |
| 15 cm 培养皿 | Corning (Falcon) | 353025 | 无菌，TC处理细胞培养皿 |
| DMEM | Corning (Cellgro) | 10-013-CV | |
| 青霉素-链霉素 | Corning | 30-002-CI | |
| MEM 非必需氨基酸 | Corning (Cellgro) | 25-025-CI | |
| MEM 维生素 | Corning (Cellgro) | 25-020-CI | |
| 0.25% 胰蛋白酶，2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| 胎牛血清 | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| 移液管 | 任何品牌均可 | ||
| CO2 培养箱 | 任何品牌均可 | ||
| 生物安全二级柜 | 任何品牌均可 | ||
| FN1 TaqMan 基因表达检测 | ThermoFisher Scientific | Hs01549976_m1 | |
| TGFB1 TaqMan 基因表达检测 | ThermoFisher Scientific | Hs00998133_m1 | |
| CDH1 TaqMan 基因表达检测 | ThermoFisher Scientific | Hs01023895_m1 | |
| GAPDH TaqMan 基因表达检测 | ThermoFisher Scientific | Hs99999905_m1 | |
| miRNeasy mini RNA 提取试剂盒 | Qiagen | 217004 | |
| 高容量 cDNA 反转录试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 43-688-13 | |
| HeyA8 卵巢癌细胞 | 来自芝加哥大学 Ernst Lengyel 实验室 | ||
| TGFβ 中和抗体 | R&D Systems | MAB1835-100 |
参考文献
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Cupedo, T., Mebius, R. E. Cellular interactions in lymph node development. The Journal of Immunology.
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