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方法文章

一种用于研究细胞间旁分泌信号传导的近端共培养方法

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DOI:

10.3791/58144

2018年8月28日

本文内容

摘要

旁分泌和邻分泌细胞相互作用在多种生物过程中发挥重要作用,包括肿瘤进展、免疫应答、血管生成以及发育过程。本文采用一种邻近培养方法来研究旁分泌信号传导,该方法可在防止细胞直接接触的同时,维持分泌因子的局部浓度。

摘要

细胞间相互作用在许多生物学过程中发挥着重要作用,包括肿瘤进展、免疫反应、血管生成以及发育过程。这类相互作用主要通过旁分泌或邻分泌信号通路介导。目前最常用的区分这两种相互作用的方法是使用条件培养基和共培养实验。然而,条件培养基无法准确模拟旁分泌相互作用过程中微环境中分泌因子局部高浓度的效应,因此可能导致结论不准确。为解决这一问题,我们设计了一种邻近培养方法用于研究旁分泌信号传导。该方法将两种细胞分别培养在厚度为10 µm、孔径为0.4 µm的聚碳酸酯膜的两侧。膜上的微孔允许分泌因子交换,同时有效阻断邻分泌信号传导。实验终点时可分别收集并裂解细胞,以评估旁分泌信号的影响。除了能够模拟分泌因子的局部浓度梯度外,该方法还适用于需要长时间培养的实验,以及抑制剂的应用。尽管我们使用该方法研究卵巢癌细胞与其在转移部位所接触的间皮细胞之间的相互作用,但该技术可适用于任意两种贴壁细胞类型,供研究人员在肿瘤微环境、免疫学及发育生物学等多个领域研究旁分泌信号传导。

引言

癌细胞与肿瘤微环境之间产生有益的相互作用在肿瘤进展中的作用已得到充分证实,并已成为癌症生物学研究的主要焦点之一1。类似的双向信号交流在伤口愈合、免疫反应、血管生成、干细胞微环境以及发育过程中也至关重要2,3,4,5,6,7,8。这些生物学过程的一个共同特点是,细胞以多种方式响应来自其微环境的胞外信号,从而决定细胞命运、组织生理功能以及疾病进展。因此,研究重点已日益转向深入理解此类细胞间通讯所涉及的机制。大多数此类相互作用涉及细胞间的旁分泌或接触依赖性信号传导。旁分泌信号传导是指一个细胞分泌特定的信号因子,被邻近细胞上的相应受体感知,从而在该细胞中引发反应9,10;而接触依赖性信号传导则需要两个参与细胞的细胞组分之间直接接触11,12

此类信号传导在组织稳态以及肿瘤微环境中均起着关键作用。肿瘤细胞可受益于肿瘤间质中细胞分泌的旁分泌和邻分泌因子,这些细胞包括癌症相关成纤维细胞(CAFs)、免疫细胞和脂肪细胞。13,14,15,16旁分泌信号传导可由生长因子、细胞因子、趋化因子介导, 等等。,而旁分泌信号传导则涉及相邻的配体与受体,例如Notch信号通路,或整合素与其相应的细胞外基质蛋白之间的相互作用。我们已证实卵巢癌细胞与癌症相关成纤维细胞(CAFs)之间的双向相互作用在肿瘤进展和转移中的重要性14类似地,转移性卵巢癌细胞与覆盖转移部位的间皮细胞之间的相互作用可调控癌细胞中的关键微小RNA和转录因子,从而促进转移性定植17,18.

大多数关于旁分泌信号的研究采用从一种细胞类型收集的条件培养基来处理第二种细胞类型。尽管这种方法被广泛使用,但它无法有效模拟分泌因子在靶细胞微环境中的局部高浓度水平,也无法重现分泌因子由一个细胞持续产生并被邻近细胞接收的动力学过程。由于分泌因子仅在来源细胞附近达到所需浓度,随着距离增加会逐渐扩散并稀释,因此旁分泌信号仅在短距离内有效。这种局部高浓度的分泌因子对于激活受体细胞的响应至关重要。此外,靶细胞的响应还取决于新分泌因子与通过降解、结合、内化以及从来源细胞扩散导致的持续消耗之间的动态平衡。虽然可以通过浓缩条件培养基来模拟微环境中的较高局部浓度,但无法精确复制实际浓度,更无法模拟相关因子产生与消耗的自然动力学过程。为了更准确地模拟旁分泌信号并将其与邻近细胞信号机制区分开来,我们设计了一种新型的邻近共培养方法,该方法将两种细胞类型分别培养在多孔膜的两侧。膜上的孔径足够小,可防止发生邻近细胞相互作用,同时允许分泌因子以局部高浓度进行交换。通过这种方式,该系统保留了旁分泌因子产生与消耗的动力学特征。

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方案

该方案遵循印第安纳大学机构监管委员会的指导原则。

1. 细胞准备

  1. 人原代间皮细胞的分离与培养
    1. 按照先前所述方法17,18从人网膜组织中分离人原代间皮细胞(HPMCs),并在完全生长培养基[含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素、1%非必需氨基酸和1%维生素的杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)]中,于37 °C、5% CO2条件下培养。
      注:HPMCs通常培养至100%融合(图1A)。
  2. 卵巢癌细胞的培养条件
    1. 在完全生长培养基中,于37 °C、5% CO2条件下培养HeyA8卵巢癌细胞。
      注:使用培养至约80%融合的HeyA8细胞(图1B)。

2. 细胞培养

  1. 近端培养体系建立
    1. 使用适用于6孔板的Transwell小室,其包含经组织培养处理的10 μm厚聚碳酸酯膜,膜孔径为0.4 μm(108 孔/cm2)和一个4.67 cm2 生长区域。如有需要,可根据生长表面积按比例调整接种细胞数量,以优化不同插入片段大小的培养条件。使用前将完全培养基、胰蛋白酶和磷酸盐缓冲液(PBS)预热至 37 °C。
  2. 准备插入片段
    1. 使用无菌镊子将插入物从包装中取出,倒置放入无菌的15 cm培养皿中,以在插入物膜的下表面接种HeyA8细胞。
    2. 使用15 cm培养皿,因其深度足以容纳倒置的插入式培养小室,也可替换为其他合适的无菌容器。根据实验需要,将所需数量的插入式培养小室放入15 cm培养皿中。
    3. 用记号笔在插入物的边缘相应地标记三个对照组和三个实验组。
  3. 准备癌细胞
    1. 将生长至80%汇合度的HeyA8细胞进行胰蛋白酶消化处理2 烧瓶(约 2 x 106 细胞),加入1 mL胰蛋白酶(0.25%)消化40–60秒,随后加入6 mL完全培养基中和胰蛋白酶。
    2. 以 500 x g 离心细胞 g 室温(RT)孵育3分钟,弃去上清液,将细胞沉淀重悬于5 mL完全培养基中。使用台盼蓝染色排除法计数活细胞。
  4. 接种癌细胞
    1. 将活的HeyA8细胞用完全培养基重悬至浓度为100,000个细胞/mL。轻轻将800 μL含80,000个HeyA8细胞的完全培养基接种至插入式培养小室底部(此时底部朝上,因小室已倒置)。
    2. 将细胞接种成穹顶状,以确保细胞保留在小室中(图1C从膜的中心开始,一边缓慢移液,一边以同心圆方式向外移动。避免距离边缘超过3 mm,以防培养基溢出。
      注意:接种的细胞数量取决于细胞的生长速率和实验持续时间。本项邻近共培养实验中接种的HeyA8细胞数量已优化,至第3天结束时细胞融合度将达到80–90%。
  5. 癌细胞黏附
    1. 盖上15 cm培养皿,小心地将含有插入物的培养皿转移至CO₂培养箱2 培养箱中。此步骤中切勿扰动插入物上的培养基液滴及细胞。将细胞置于37 °C孵育4 h,以使癌细胞贴附于插入物上。
  6. 制备间皮细胞
    1. 大约 4 小时后,将 75 cm² 培养瓶中生长至 100% 汇合度的 HPMC 进行胰酶消化2 烧瓶(约 4 x 106 用2 mL胰蛋白酶(0.25%)消化细胞1–2分钟,然后加入12 mL完全培养基中和胰蛋白酶。
    2. 以 500 x g 离心细胞 g 室温孵育3分钟,将细胞沉淀重悬于10 mL完全培养基中,使用台盼蓝染色排除法计数活细胞。
  7. 接种间皮细胞
    1. 将活的HPMC细胞以300,000个细胞/mL的浓度悬浮于完全培养基中。向6孔板的每孔加入2.5 mL新鲜完全培养基。小心将含有小室的15 cm培养皿移至生物安全柜中。使用无菌镊子将小室翻转,轻轻放入6孔板的孔中,使其保持直立状态,使附着于下表面的HeyA8细胞浸入完全培养基中(图1C).
    2. 将450,000个HPMCs悬浮于1.5 mL生长培养基中,接种至嵌套插件内,使HeyA8细胞附着于面向孔底部的表面(图1C)或不含任何HeyA8细胞的插入膜,用于HPMC对照。向HeyA8对照组中加入1.5 mL不含细胞的生长培养基。
  8. 扩增近端培养物
    1. 让近端培养物在CO₂培养箱中继续生长2 37 °C、5% CO₂ 培养箱2 72小时。如有需要,可按如下方法补充培养基。
      1. 对于插入物内部,移除750 µL培养基,并加入750 µL新鲜的完全生长培养基。
      2. 对于插入物的外侧(6孔板),移除1 mL培养基并加入1 mL新鲜的完全生长培养基。选择1 mL是为了方便一步完成换液。如有需要,也可移除并替换1.25 mL。
  9. 收集细胞
    1. 在近端培养72小时后收集细胞。此步骤需特别注意防止HeyA8细胞与HPMCs之间的交叉污染。将细胞进行胰酶消化,离心后收集细胞沉淀,直接裂解细胞沉淀,而非在膜上裂解细胞,以避免交叉污染。
  10. 消化细胞
    1. 用 1× PBS 冲洗插入物的两侧。
    2. 将小室转移至新孔,并加入胰蛋白酶。向小室内侧加入0.5 mL胰蛋白酶,向6孔板中加入2 mL胰蛋白酶,以消化贴附在小室底部表面的癌细胞。将培养板于37 °C孵育2 min。
  11. 中和胰蛋白酶
    1. 向插入物内加入1 mL完全培养基以中和胰蛋白酶,用移液器吹打混匀,然后收集细胞并转移至已标记的收集管中。再加入额外的2 mL完全培养基以确保完全中和。移液时应小心避免刺穿膜,以防细胞交叉污染。
    2. 为收集插入物底部的细胞,用移液器将步骤12.2中加入的2 mL胰蛋白酶反复吹打底部表面2–3次,使细胞脱落并落入6孔板底部。用6 mL培养基中和孔板底部的胰蛋白酶,然后将孔板中的内容物转移至已标记的收集管中。
  12. 收集并裂解细胞
    1. 以 500 x g 离心细胞 g 孵育3分钟,吸除培养基。用0.7 mL基于苯酚和硫氰酸胍的裂解试剂重悬并裂解细胞沉淀,用于RNA提取。使用任何合适的试剂盒分离RNA。

3. 定量实时聚合酶链式反应

注意:以下步骤描述了通过定量实时聚合酶链式反应(qPCR)来研究近端共培养引起的基因表达变化。

  1. 使用合适的逆转录酶及其相应的缓冲液和随机引物,从RNA样品中制备cDNA,以确保所有mRNA的逆转录(参见材料表)。
  2. 采用GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作为内参,通过qPCR检测纤连蛋白(FN1)、E-钙黏蛋白(CDH1)和转化生长因子β1(TGFβ1)的mRNA表达水平变化。可使用标准化的商业化基因表达检测试剂盒(参见材料表),或自行设计引物。
  3. 将与HPMCs共培养的HeyA8细胞与HeyA8对照组进行比较,同时将与HeyA8细胞共培养的HPMCs与HPMC对照组进行比较。

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结果

转移性卵巢癌细胞在腹腔内转移部位会遇到间皮细胞19。与间皮细胞之间有效的旁分泌和邻近分泌相互作用有助于诱导卵巢癌细胞产生适应性反应,从而促进成功转移17,18,20,21。为了验证邻近共培养方法的有效性,我们检测了HeyA8卵巢癌细胞与HPMCs之间的旁分泌相互作用。已有研究报道,HeyA8细胞与HPMCs共培养可导致HPMCs中纤连蛋白表达水平升高21。这种纤连蛋白表达的上调是由HeyA8细胞分泌更多TGFβ所介导的21。因此,我们检测了HeyA8细胞与HPMCs进行邻近培养后,两种细胞中纤连蛋白和TGFβ的mRNA水平变化。与未在插入膜下表面附着HeyA8细胞的对照组相比,...

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讨论

理解细胞间旁分泌和邻分泌信号传导的机制,对于深入认识正常组织稳态及疾病状态至关重要7,8。目前大多数旁分泌信号研究通过收集一种细胞类型的条件培养基,并用其处理另一种细胞类型来开展。该方法具有操作简便的优点,但无法准确模拟分泌因子在细胞微环境中的局部浓度,也无法真实再现相关因子生成与消耗的动力学过程。尽管可通过浓缩条件培养基在一定程度上(尽管不精确)解决前一个问题,但要重现因子生成与消耗的动力学过程则极为困难。使用Transwell小室将细胞分别培养在插入膜上和孔板底部,可在一定程度上重现因子生成与消耗的动力学效应;然而,由于细胞之间被插入膜与孔底之间的距离所分隔,因而无法模拟旁分泌因子的局部高浓度环境。我们报道了一种简单的邻近共培养方法,可用于研究相互性的旁分泌信号传导,该方法既保留了分泌因子的局部高浓度特性,又维持了因子生成与消耗速率的动态变化。

在一项原理验证研究中,我们证明了近端共培养方法在重现卵巢癌细胞与腹膜间皮细胞(HPMCs)相互作用已知效应方面的有效性...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢患者参与本研究的组织样本采集工作。本研究得到了美国国防部卵巢癌研究计划学院奖(DoD OCRP Ovarian Cancer Academy Award,编号:W81XWH-15-0253)以及Colleen's Dream基金会向Anirban K. Mitra提供的试点项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
24 mm Transwell 可穿透支持物,带 0.4 µm 孔径聚碳酸酯膜插入物Corning (Costar)3412• 10 µm 厚半透明聚碳酸酯膜
• 经处理以实现最佳细胞贴附
• 每板6个插入物包装于6孔板中,每箱4板
• 膜需染色以使细胞可见
• 经γ射线灭菌
6 孔板Corning (Falcon)353046平底,TC处理,无菌,带盖
15 cm 培养皿Corning (Falcon)353025无菌,TC处理细胞培养皿
DMEMCorning (Cellgro)10-013-CV
青霉素-链霉素Corning30-002-CI
MEM 非必需氨基酸Corning (Cellgro)25-025-CI
MEM 维生素Corning (Cellgro)25-020-CI
0.25% 胰蛋白酶,2.21 mM EDTACorning25-053-CI
胎牛血清Atlanta BiologicalsS11150
移液管任何品牌均可
CO2 培养箱任何品牌均可
生物安全二级柜任何品牌均可
FN1 TaqMan 基因表达检测ThermoFisher ScientificHs01549976_m1
TGFB1 TaqMan 基因表达检测ThermoFisher ScientificHs00998133_m1
CDH1 TaqMan 基因表达检测ThermoFisher ScientificHs01023895_m1
GAPDH TaqMan 基因表达检测ThermoFisher ScientificHs99999905_m1
miRNeasy mini RNA 提取试剂盒Qiagen217004
高容量 cDNA 反转录试剂盒ThermoFisher Scientific43-688-13
HeyA8 卵巢癌细胞来自芝加哥大学 Ernst Lengyel 实验室
TGFβ 中和抗体R&D SystemsMAB1835-100

参考文献

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重印与许可

标签

TGF 1 E