本文介绍了一种从青鳉（Oryzias latipes）中分离和培养垂体原代细胞的实验方案。该方案通过模拟鱼类的生理条件，优化了温度、渗透压和pH等关键参数，从而获得更具生理意义的实验结果。
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摘要
摘要
原代细胞培养是一种强大的工具，科学家常用它在受控环境中研究分离细胞的细胞特性及作用机制。尽管哺乳动物与鱼类在生理学上存在巨大差异，鱼类的原代细胞培养方案通常仍基于哺乳动物的培养条件，往往仅作少量修改。环境差异不仅影响体温，还影响血清参数，如渗透压、pH值以及pH缓冲能力。由于细胞培养基及其他类似工作溶液旨在模拟细胞所适应的细胞外液和/或血清的特性，因此必须针对具体动物对这些参数进行相应调整。
本方案描述了日本青鳉（Oryzias latipes）原代培养的优化条件。该方案详细介绍了分离并维持健康分散垂体细胞超过一周的方法，包括以下步骤：1. 将渗透压调整至与日本青鳉血浆中所测数值一致；2. 将培养温度调整至日本青鳉正常体温（本实验中为水族设施内的温度）；3. 将pH值和碳酸氢盐缓冲系统调整至与其他生活在相似温度下的鱼类物种相当的水平。采用本方案所得结果可为日本青鳉提供具有生理学意义的实验数据，也可为从事其他非哺乳动物物种原代细胞培养的研究人员提供参考指南。
引言
细胞培养是分子生物学研究中使用的主要工具之一，为回答从正常细胞生理学到药物筛选及致癌作用等各种生物学问题提供了优良的模型系统1。原代细胞通过酶法和/或机械法直接从动物组织中分离获得，通常被认为比细胞系更具生物学相关性，因为其生物学反应可能更接近体内（in vivo）的真实情况。为了模拟细胞所适应的环境特征并获得具有生理意义的结果，针对不同物种和目标细胞类型，应优化原代细胞培养的制备方案。
已有大量实验方案描述了哺乳动物细胞体系的培养条件，而关于鱼类细胞原代培养条件的类似方案则相对较少。细胞对温度、pH 和渗透压的快速变化十分敏感，尤其在解离过程中尤为脆弱。用于哺乳动物细胞培养的商用盐溶液和培养基并不完全适用于硬骨鱼类，特别是在 pH 缓冲系统和渗透压方面。因此，针对目标物种，将这些参数的溶液测量并调整至生理相关水平显得尤为重要。
已从多种硬骨鱼类物种中建立原代垂体细胞培养，包括鲤鱼（Cyprinus carpio）2,3、草鱼（Ctenopharyngodon idella）4、金鱼（Carassius auratus）5、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）6、欧洲鳗（Anguilla anguilla）7、罗非鱼（Oreochromis mossambicus）8、斑马鱼（Danio rerio）9和大西洋鳕（Gadus morhua）10。除了将培养温度调整至目标物种的适宜范围外，其中一些实验方案在类似于哺乳动物的条件下进行细胞培养，这可能并非目标物种的最佳条件，例如在含3–5% CO2的湿润环境中维持pH值在7.2至7.5之间。此外，尚不清楚用于制备这些原代细胞培养物的多种溶液的渗透压是否经过调整，以及不同溶液之间的渗透压是否保持稳定。
本方案基于先前对大西洋鳕鱼原代培养的研究10，并针对青鳉（O. latipes）的生理特性，对孵育温度、渗透压、pH值以及pH缓冲系统（包括二氧化碳分压，pCO2）进行了优化调整。青鳉是一种原产于东亚的小型淡水鱼，体长3–4 cm。目前，青鳉已被全球众多研究实验室用作模式物种，因其繁殖相对容易，且对多种常见鱼类疾病具有较强抗性11。使用青鳉作为模式生物具有多项优势，包括耐温范围广（4–40 °C）11、世代周期短、胚胎透明、具有性别决定基因12、已完成基因组测序13，以及丰富的其他可利用遗传资源。
本方案中的原代培养条件已优化，以匹配鱼类饲养设施中青鳉所处的26 °C温度环境。此外，渗透压从生活在海水中的大西洋鳕鱼的320 mOsm/kg降低至生活在淡水中的青鳉的290 mOsm/kg，这与青鳉血浆的正常渗透压一致14。相比之下，哺乳动物血浆的典型渗透压范围为275–295 mOsm15。鱼类生活在多种温度环境中，其鳃直接与水接触，导致鱼类血液和细胞外液的pH值及缓冲能力与哺乳动物不同。哺乳动物细胞培养基通常包含缓冲系统，在37 °C、含5% CO2的湿润空气中平衡后，使培养基pH值维持在约7.4。pH值具有温度依赖性，中性pH值（在水中）随温度降低而升高16。典型的硬骨鱼类血浆pH值范围为7.7至7.917。本方案的优化包括将CO2浓度从0.5%提高至1%，从而使在12 °C饲养的大西洋鳕鱼的pH值从7.85调整为在26 °C饲养的青鳉的pH值7.75。
此外，鱼类与哺乳动物的碳酸氢盐缓冲能力存在显著差异。在鱼类中，CO2 可通过鳃部高效交换，水中 pCO2 仅为肺部 pCO2 的一小部分18。温度或 pCO2 的改变均会影响培养基的 pH 值及其缓冲能力。因此，适用于哺乳动物细胞培养的 pH 值和 pCO2 条件对鱼类细胞并非最优，故应针对鱼类特别是目标物种的生理需求，优化培养基中的缓冲体系。本实验方案介绍了如何制备青鳉垂体的原代细胞培养，并包括对孵育温度、渗透压、pH 值及 pH 缓冲体系的调整，以及其他在制备非哺乳动物物种原代细胞培养时需考虑的重要参数。
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方案
本研究中进行的动物实验已获得挪威生命科学大学批准，遵循科研动物护理与福利的相关指南。
1. 溶液的配制
- 根据制造商的说明校准渗透压仪和pH计，以确保测量结果准确。
- 配制500 mL不含Ca2+和Mg2+的Dulbecco磷酸盐缓冲液（dPBS），在无菌过滤前（步骤1.2.3）将pH值调节至7.75（步骤1.2.1），渗透压调节至290 mOsm/kg（步骤1.2.2）。
- 使用已校准的pH计，在轻轻搅拌溶液的同时，逐滴加入1 M NaOH溶液，将pH值精确调节至7.75。
- 使用已校准的渗透压仪测定溶液的渗透压，并计算为使渗透压达到290 mOsm/kg所需添加的甘露醇量。加入所需量的甘露醇后，再次测量溶液的渗透压，以确认调节正确。
注意：所需甘露醇的量取决于实测渗透压，通常因不同批次而异。1分子甘露醇相当于1个渗透性粒子。 - 使用0.2 µm滤膜对dPBS溶液进行无菌过滤。
注意：该溶液可在4 °C下保存至少3个月。
- 配制500 mL不含L-谷氨酰胺和碳酸氢盐的Leibovitz（L-15）培养基，并补充10 mM NaHCO3（步骤1.3.1）、4.5 mM葡萄糖（步骤1.3.2）以及2 mM市售谷氨酰胺（步骤1.3.3）。将溶液渗透压调节至290 mOsm/kg（步骤1.3.4），进行无菌过滤（步骤1.3.5），然后加入2.5 mL青霉素-链霉素溶液（步骤1.3.6）。
注意：该溶液可在4 °C下保存至少4周。- 每500 mL培养基中加入420 mg NaHCO3，以获得10 mM的终浓度。
- 每500 mL培养基中加入405 mg葡萄糖，以获得4.5 mM的终浓度。
- 在500 mL培养基中加入5 mL 100倍浓缩的谷氨酰胺溶液，以获得2 mM的终浓度。搅拌至所有溶质完全溶解。
- 使用渗透压仪，通过添加甘露醇将溶液渗透压调节至290 mOsm/kg（操作同步骤1.2.2）。
- 使用0.2 µm滤膜对L-15培养基进行无菌过滤。
- 无菌过滤后，加入2.5 mL青霉素-链霉素溶液，使其终浓度为青霉素50 U/mL、链霉素50 µg/mL。
- 使用1 mg/mL（0.1%）II-S型胰蛋白酶溶于已配制的改良dPBS（步骤1.2制备）中，配制50 mL胰蛋白酶溶液。将溶液分装为每管2 mL，置于无菌塑料管中，-20 °C保存备用。
注意：2 mL分装液可在-20 °C下保存至少3个月。 - 使用1 mg/mL（0.1%）I-S型胰蛋白酶抑制剂溶于已配制的改良dPBS（步骤1.2制备）中，配制50 mL胰蛋白酶抑制剂溶液，并加入2 µg/mL DNase I。将溶液分装为每管2 mL，置于无菌塑料管中，-20 °C保存备用。
注意：2 mL分装液可在-20 °C下保存至少3个月。
2. 仪器设备的准备
- 通过火焰制备玻璃移液管 打磨用于细胞解离的移液尖端。通过调节移液管在火焰中的加热时间与距离，同时旋转移液管，制备两种不同口径大小的移液尖：中等开口（0.6–0.8 µm）和小开口（0.4–0.6 µm）。将玻璃移液管置于洁净的玻璃容器中，采用固体模式在105 °C下高压灭菌45分钟。
- 准备一个装有冰的聚苯乙烯盒。
- 在解剖过程中，准备一支含有1.5 mL改良dPBS（按步骤1.2配制）的塑料管，用于转移垂体，并将其置于冰上。
- 在15 mL离心管中加入10 mL改良dPBS（步骤1.2中配制），置于冰上保存，直至进行细胞解离。
- 准备新鲜的胰蛋白酶溶液和胰蛋白酶抑制剂溶液（按步骤1.4和1.5配制），或解冻分装样品，并置于冰上保存直至使用。
- 将水浴锅温度设置为 26 °C，以便在开始解剖前使水温达到垂体化学解离所需的温度。
- 在使用前后及使用过程中，用70%乙醇清洁所有解剖工具，包括用于解剖的精细镊子、细针以及用于固定鱼体的蜡板。整个操作过程中佩戴洁净手套（需频繁更换和清洁），以避免细胞可能受到污染。
3. 垂体解剖与细胞分离
- 将鱼浸入冰水混合物（0 °C）中实施安乐死。让鱼在冰水混合物中至少停留 1 分钟，以确保产生不可逆的低温休克。
注意：数秒后鱼将出现活动停止和平衡丧失。确保鱼完全浸没在冰水中，不要使其浮在冰块表面，否则可能导致窒息或皮肤冻伤，而非快速且人道的低温休克。 - 迅速将鱼用网转移至解剖显微镜下的蜡板上，并用针从颈部刺穿以破坏脊髓。
- 使用细针将鱼头固定在蜡板上，一根针插入头部前端（口部上方），另两根针分别插入头部两侧（脑后方），以在解剖前稳定头部。
- 在解剖显微镜下观察鱼体，使用带角度尖端的精细镊子轻轻刮除头部顶部的鳞片。
- 从头部侧面将精细镊子的带角度尖端小心插入皮肤下方，夹住颅骨顶盖，同时稳握镊子，缓慢向口部方向移动，以去除颅骨顶盖。
- 使用带角度尖端的镊子将脊髓完全剪断。
注意：时间是关键因素，因此操作应高效且准确，以尽量缩短从垂体解剖到细胞接种至培养皿之间的时间。经过一定练习后，每条鱼的垂体解剖过程应耗时约 2–3 分钟，其中在脑组织暴露后仅需约 10 秒即可取出垂体。 - 小心将脑组织朝口部方向翻转，以暴露垂体，并使用尖端平直的洁净镊子进行垂体解剖。将垂体转移至含有 1.5 mL 改良 dPBS（详见步骤 2.3）并置于冰上的塑料管中。 在显微镜下检查镊子尖端，确保垂体已成功转移至管中，且无残留于镊子上。
注意：根据需同时准备的培养皿数量，解剖所需数量的垂体。一般而言，每培养皿至少需取自成年鱼的 10 个垂体，以获得适当的细胞密度（具体数量取决于后续应用）。 - 在台式离心机中于室温下离心 1–2 秒，使垂体沉淀。使用玻璃移液管小心吸除 dPBS，注意避免吸走任何垂体组织。
- 加入 1 mL 胰蛋白酶溶液（按步骤 1.4 配制）洗涤垂体，在台式离心机中离心 1–2 秒，用玻璃移液管吸除大部分液体后，再加入 1 mL 胰蛋白酶溶液。
- 将试管置于 26 °C 水浴中孵育 30 分钟，最好保持轻微振荡；或在孵育期间轻弹试管数次。
- 在台式离心机中于室温下离心 1–2 秒，确保所有垂体均位于管底。用玻璃移液管吸除大部分胰蛋白酶溶液，加入 1 mL 胰蛋白酶抑制剂溶液（按步骤 1.5 配制），以灭活胰蛋白酶并洗涤垂体。
- 在台式离心机中于室温下离心 1–2 秒，使垂体沉至管底。用玻璃移液管吸除大部分液体，再加入 1 mL 胰蛋白酶抑制剂溶液（按步骤 1.5 配制）。将试管置于 26 °C 水浴中孵育 20 分钟，最好保持轻微振荡；或在孵育期间轻弹试管数次，以彻底灭活胰蛋白酶。
- 准备一个直径 35 mm、中央带玻璃底的聚-D-赖氨酸包被细胞培养皿，加入 2 mL L-15 培养基，并在 26 °C 和 1% CO2 条件下孵育至少 10 分钟，使培养基达到适宜的温度和 pH 值后再接种细胞。
注意：也可使用塑料细胞培养皿。使用中央带玻璃底培养皿的主要优势在于细胞接种区域较小，因此每皿所需垂体细胞数量更少。某些下游应用也可能要求使用玻璃底（例如，某些成像技术）。 - 将用于 15 mL 管的冷却离心机预设为 4 °C，使其在开始机械解离前达到目标温度。
- 在台式离心机中于室温下离心 1–2 秒，使含有胰蛋白酶抑制剂溶液（来自步骤 3.11）的试管中垂体沉至管底，并确保所有垂体均位于管底后，小心用玻璃移液管吸除大部分胰蛋白酶抑制剂溶液。
注意：本方案后续所有步骤均应在经认证适用于细胞操作的层流洁净台（LAF）中进行，以避免细胞污染。 - 向垂体组织碎片中加入 1 mL 冰冷的改良 dPBS（按步骤 2.4 配制），使用火焰抛光的玻璃移液管（按步骤 2.1 配制）轻轻吹吸组织碎片 6–7 次。
注意：温度至关重要，所有溶液均应保持在 4 °C。自此步骤起，尽可能在冰上操作所有步骤。 - 在台式离心机中于室温下离心 1–2 秒，小心将含有解离细胞的上清液（近 1 mL）转移至置于冰上的新 15 mL 管中。避免将移液管插入管底残留组织碎片所在区域。
- 重复步骤 3.16–3.17，每次使用 1 mL 冰冷 dPBS 解离细胞，直至用完全部 10 mL dPBS。解离初期使用中等口径的玻璃移液管，后期（最后 3–4 mL dPBS）改用口径更小的移液管。若解离末期仍可见组织碎片，可在最后两步 dPBS 解离时将吹吸次数增至约 10 次，最终将残余组织碎片弃去。轻柔重悬细胞，避免产生气泡，以防细胞附着于气泡表面而受损。
注意：此为本方案的关键步骤，需经过一定训练才能获得良好结果。 - 将试管在已预冷至 4 °C 的离心机中配平，于 4 °C 下以 200 xg 离心 10 分钟。务必标记试管中细胞沉淀所在的一侧。
- 小心从离心机中取出试管，在离心结束后立即用玻璃移液管将上清液转移至空的 15 mL 塑料管中。应尽量去除上清液，但注意避免丢失微小（常不可见）的细胞沉淀。
- 小心用 50–100 µL L-15 培养基重悬细胞沉淀。
注意：此步骤可进行细胞计数和/或活力检测（如使用血细胞计数板在台盼蓝存在下进行细胞计数），但需注意，若取部分细胞悬液用于检测，将降低最终细胞得率。避免使用过大的重悬体积，以防细胞扩散至培养皿中心区域之外。 - 将解离后的细胞小心滴加至含有 2 mL L-15 培养基（按步骤 3.13 配制）的细胞培养皿中央。让细胞在转移至培养箱前静置约 5 分钟，使其沉降至皿底，避免细胞扩散至玻璃底凹陷区域之外。
- 在 26 °C 和 1% CO2 条件下孵育培养皿，使所有细胞充分沉降并贴附于皿底。
- 30 分钟后，在显微镜下观察细胞，确认其已贴附于培养皿表面。
- 继续在 26 °C 和 1% CO2 条件下孵育细胞。
- 每 3–4 天小心更换大部分（但非全部）培养基。
注意：避免更频繁更换培养基，以免干扰细胞并导致其从玻璃底脱落。细胞接种后一周内用于实验为宜。
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结果
本方案描述了从青鳉垂体组织制备原代细胞培养物的方法，可获得健康的细胞，并能在培养中维持至少一周。该方案基于青鳉生理相关的参数14，并进一步针对成年鱼类的垂体组织进行了优化，在从组织采集到细胞接种培养的整个过程中，均采用 pH 7.75 和渗透压 290 mOsm/kg 的条件（图1 和 图2）。
本方案所获原代细胞培养实验的代表性结果如图所示 图3, 图4，以及 图5为呈现本文结果，使用了一种转基因青鳉鱼品系，其促黄体生成素（Lh）-促性腺激素细胞表达绿色荧光蛋白（GFP）。...
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讨论
体外细胞培养系统若使用得当，可为研究人员提供强大的工具，以解答多种多样的生物学问题1。需要牢记的是，那些已脱离与邻近细胞连接的离散细胞，其功能特性可能已与在体内时的原始状态有所不同。为避免误读体外实验结果，重要的是应根据目标物种和细胞类型对原代细胞培养流程进行相应调整。即使是对手标准培养流程和所用溶液进行适度调整，也常常足以显著改变特定细胞类型的培养条件。
本方案描述了制备和维持成年青鳉垂体原代细胞培养的优化条件，可通过调节温度、渗透压、pH 和 pCO₂ 等参数实现2 所用溶液的pH值具有温度依赖性，因此也需根据不同温度下生活的硬骨鱼类物种的生理条件进行调整17细胞解离和培养过程中所用所有溶液的渗透压也应进行调整，以改善细胞的生长状态。尤其在分离操作中，若不同溶液之间的渗透压存在差异，可能对培养质量产生严重影响，导致细胞活力下降（作者未发表的结果）。高渗溶液将引起细胞皱缩（ 反之亦然），从而干...
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披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
本项目由挪威生命科学大学和挪威研究理事会资助，资助编号为243811和244461（水产养殖项目）。我们感谢挪威生命科学大学的Lourdes Carreon Tan对鱼类养殖设施的维护工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 杜尔贝科’不含氯化钙和氯化镁的磷酸盐缓冲液（dPBS） | Sigma（默克，达姆施塔特，德国） | D8537 | 用1 M NaOH将溶液pH值调至7.75，并用甘露醇调节渗透压至290 mOsm。 |
| L-15 培养基（Leibovitz），不含 L-谷氨酰胺 | Sigma（默克，达姆施塔特，德国） | L5520 | 在500 ml培养基中添加NaHCO₃至终浓度为10 mM3，4.5 mM 葡萄糖，2 mM Glutamax。用甘露醇调节溶液至290 mOsm，并通过0.2 μm滤膜过滤溶液 µm PES 无菌滤器，然后加入 2.5 mL 青霉素-链霉素溶液（详见下文）。 |
| NaOH | Sigma（默克，达姆施塔特，德国） | S5881 | 加入1 M溶液数滴，将dPBS和培养基的pH调至7.75。 |
| NaHCO₃3 | Sigma（默克，德国达姆施塔特） | S5761 | 10 mM NaHCO₃3 等于每500 mL培养基含420 mg。 |
| D-甘露醇 | Sigma（默克，达姆施塔特，德国） | 63565 | 用于提高 dPBS 和培养基的渗透压。计算所需正确用量，使渗透压达到 290 mOsm。 |
| D-葡萄糖 | Sigma（默克，德国达姆施塔特） | G5400 | 4.5 mM D-葡萄糖为每500 mL培养基含405 mg。 |
| GlutaMAX 补充剂 | Gibco（Life Technologies，Paisley，UK） | 35050-061 | L-谷氨酰胺的替代物，具有更高的稳定性。2 mM GlutaMAX 相当于在 500 mL 培养基中加入 5 mL 100 倍浓缩液。 |
| 青霉素-链霉素 | Sigma（默克，达姆施塔特，德国） | P0781 | 储存液：每毫升含10,000单位青霉素和10毫克链霉素。在500 mL L-15培养基中加入2.5 mL该储存液（相当于终浓度为50 U/mL青霉素和50 µg/mL 链霉素 |
| 胰蛋白酶 II-S 型 | Sigma（默克，德国达姆施塔特） | T7409 | 在 dPBS 溶液中配制 1 mg/mL 的溶液。 |
| 胰蛋白酶抑制剂 I-S 型 | Sigma（默克，达姆施塔特，德国） | T6522 | 配制1 mg/mL的dPBS溶液，并补充2 µg/ml DNase I（详见下文）。 |
| Dnase I | Sigma（默克，达姆施塔特，德国） | D5025 | 使用胰蛋白酶抑制剂溶液（见上文）。 |
| 0.2 µm 聚醚砜（PES）无菌过滤系统 | 康宁公司（美国纽约州康宁市） | 431097 | 用于调整后的dPBS和L-15培养基的无菌过滤。 |
| 35 mm 玻璃底细胞培养皿，聚-D-赖氨酸包被 | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-10-C | 也可根据下游应用替换为塑料培养皿。 |
| Dumont #5 精细镊子 | Fine Science Tools（加利福尼亚州） | 11254-20 | 直头 |
| Dumont #5/45 精细镊子 | Fine Science Tools（加利福尼亚州） | 11253-25 | 45度角° 尖端 |
| 立体显微镜 SZ61 | 奥林巴斯公司（日本东京） | 用于垂体解剖。 | |
| Alegra X-22R 离心机 | Beckman Coulter Inc. (Brea, CA) | 带冷却选项（类似于当前型号 XR-30）。 | |
| 水浴锅 | 特克内（英国斯塔福德郡） | 任何可调节温度的水浴装置均可使用。 | |
| 巴斯德玻璃移液管 | VWR (NY) | 612-1701 | 外径 1.6 mm，使用前进行火焰抛光并高压灭菌。 |
| Galaxy MiniStar 台式离心机 | VWR（纽约） | 521-2844 | 任何小型台式离心机均可。 |
| 细针/昆虫针 | Fine Science Tools（加利福尼亚州） | 26001-40 | 直径0.03 mm。也可使用其他细针替代。 |
| 石蜡板 | 通过在大型培养皿中加入熔化的石蜡蜡定制制备。 |
参考文献
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