鱼类垂体原代细胞培养的高质量制备

摘要

本文介绍了一种从青鳉（Oryzias latipes）中分离和培养垂体原代细胞的实验方案。该方案通过模拟鱼类的生理条件，优化了温度、渗透压和pH等关键参数，从而获得更具生理意义的实验结果。

摘要

原代细胞培养是一种强大的工具，科学家常用它在受控环境中研究分离细胞的细胞特性及作用机制。尽管哺乳动物与鱼类在生理学上存在巨大差异，鱼类的原代细胞培养方案通常仍基于哺乳动物的培养条件，往往仅作少量修改。环境差异不仅影响体温，还影响血清参数，如渗透压、pH值以及pH缓冲能力。由于细胞培养基及其他类似工作溶液旨在模拟细胞所适应的细胞外液和/或血清的特性，因此必须针对具体动物对这些参数进行相应调整。

本方案描述了日本青鳉（Oryzias latipes）原代培养的优化条件。该方案详细介绍了分离并维持健康分散垂体细胞超过一周的方法，包括以下步骤：1. 将渗透压调整至与日本青鳉血浆中所测数值一致；2. 将培养温度调整至日本青鳉正常体温（本实验中为水族设施内的温度）；3. 将pH值和碳酸氢盐缓冲系统调整至与其他生活在相似温度下的鱼类物种相当的水平。采用本方案所得结果可为日本青鳉提供具有生理学意义的实验数据，也可为从事其他非哺乳动物物种原代细胞培养的研究人员提供参考指南。

引言

细胞培养是分子生物学研究中使用的主要工具之一，为回答从正常细胞生理学到药物筛选及致癌作用等各种生物学问题提供了优良的模型系统¹。原代细胞通过酶法和/或机械法直接从动物组织中分离获得，通常被认为比细胞系更具生物学相关性，因为其生物学反应可能更接近体内（in vivo）的真实情况。为了模拟细胞所适应的环境特征并获得具有生理意义的结果，针对不同物种和目标细胞类型，应优化原代细胞培养的制备方案。

已有大量实验方案描述了哺乳动物细胞体系的培养条件，而关于鱼类细胞原代培养条件的类似方案则相对较少。细胞对温度、pH 和渗透压的快速变化十分敏感，尤其在解离过程中尤为脆弱。用于哺乳动物细胞培养的商用盐溶液和培养基并不完全适用于硬骨鱼类，特别是在 pH 缓冲系统和渗透压方面。因此，针对目标物种，将这些参数的溶液测量并调整至生理相关水平显得尤为重要。

已从多种硬骨鱼类物种中建立原代垂体细胞培养，包括鲤鱼（Cyprinus carpio）^2,3、草鱼（Ctenopharyngodon idella）⁴、金鱼（Carassius auratus）

方案

本研究中进行的动物实验已获得挪威生命科学大学批准，遵循科研动物护理与福利的相关指南。

1. 溶液的配制

1. 根据制造商的说明校准渗透压仪和pH计，以确保测量结果准确。
2. 配制500 mL不含Ca²⁺和Mg²⁺的Dulbecco磷酸盐缓冲液（dPBS），在无菌过滤前（步骤1.2.3）将pH值调节至7.75（步骤1.2.1），渗透压调节至290 mOsm/kg（步骤1.2.2）。
   1. 使用已校准的pH计，在轻轻搅拌溶液的同时，逐滴加入1 M NaOH溶液，将pH值精确调节至7.75。
   2. 使用已校准的渗透压仪测定溶液的渗透压，并计算为使渗透压达到290 mOsm/kg所需添加的甘露醇量。加入所需量的甘露醇后，再次测量溶液的渗透压，以确认调节正确。
      注意：所需甘露醇的量取决于实测渗透压，通常因不同批次而异。1分子甘露醇相当于1个渗透性粒子。
   3. 使用0.2 µm滤膜对dPBS溶液进行无菌过滤。
      注意：该溶液可在4 °C下保存至少3个月。
3. 配制500 mL不含L-谷氨酰胺和碳酸氢盐的Leibovitz（L-15）培养基，并补充10 mM NaHCO₃（步骤1.3.1）、4.5 mM葡萄糖（步骤1.3.2）以及2 m....

结果

本方案描述了从青鳉垂体组织制备原代细胞培养物的方法，可获得健康的细胞，并能在培养中维持至少一周。该方案基于青鳉生理相关的参数¹⁴，并进一步针对成年鱼类的垂体组织进行了优化，在从组织采集到细胞接种培养的整个过程中，均采用 pH 7.75 和渗透压 290 mOsm/kg 的条件（图1 和 图2）。

本方案所获原代细胞培养实验的代表性结果如图所示 图3, 图4，以及 图5为呈现本文结果，使用了一种转基因青鳉鱼品系，其促黄体生成素（Lh）-促性腺激素细胞表达绿色荧光蛋白（GFP）。^.......

讨论

体外细胞培养系统若使用得当，可为研究人员提供强大的工具，以解答多种多样的生物学问题¹。需要牢记的是，那些已脱离与邻近细胞连接的离散细胞，其功能特性可能已与在体内时的原始状态有所不同。为避免误读体外实验结果，重要的是应根据目标物种和细胞类型对原代细胞培养流程进行相应调整。即使是对手标准培养流程和所用溶液进行适度调整，也常常足以显著改变特定细胞类型的培养条件。

本方案描述了制备和维持成年青鳉垂体原代细胞培养的优化条件，可通过调节温度、渗透压、pH 和 pCO₂ 等参数实现₂ 所用溶液的pH值具有温度依赖性，因此也需根据不同温度下生活的硬骨鱼类物种的生理条件进行调整¹⁷细胞解离和培养过程中所用所有溶液的渗透压也应进行调整，以改善细胞的生长状态。尤其在分离操作中，若不同溶液之间的渗透压存在差异，可能对培养质量产生严重影响，导致细胞活力下降（作者未发表的结果）。高渗溶液将引起细胞皱缩（ 反之亦然），从而干.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科’不含氯化钙和氯化镁的磷酸盐缓冲液（dPBS）	Sigma（默克，达姆施塔特，德国）	D8537	用1 M NaOH将溶液pH值调至7.75，并用甘露醇调节渗透压至290 mOsm。
L-15 培养基（Leibovitz），不含 L-谷氨酰胺	Sigma（默克，达姆施塔特，德国）	L5520	在500 ml培养基中添加NaHCO₃至终浓度为10 mM3，4.5 mM 葡萄糖，2 mM Glutamax。用甘露醇调节溶液至290 mOsm，并通过0.2 μm滤膜过滤溶液 µm PES 无菌滤器，然后加入 2.5 mL 青霉素-链霉素溶液（详见下文）。
NaOH	Sigma（默克，达姆施塔特，德国）	S5881	加入1 M溶液数滴，将dPBS和培养基的pH调至7.75。
NaHCO₃3	Sigma（默克，德国达姆施塔特）	S5761	10 mM NaHCO₃3 等于每500 mL培养基含420 mg。
D-甘露醇	Sigma（默克，达姆施塔特，德国）	63565	用于提高 dPBS 和培养基的渗透压。计算所需正确用量，使渗透压达到 290 mOsm。
D-葡萄糖	Sigma（默克，德国达姆施塔特）	G5400	4.5 mM  D-葡萄糖为每500 mL培养基含405 mg。
GlutaMAX 补充剂	Gibco（Life Technologies，Paisley，UK）	35050-061	L-谷氨酰胺的替代物，具有更高的稳定性。2 mM GlutaMAX 相当于在 500 mL 培养基中加入 5 mL 100 倍浓缩液。
青霉素-链霉素	Sigma（默克，达姆施塔特，德国）	P0781	储存液：每毫升含10,000单位青霉素和10毫克链霉素。在500 mL L-15培养基中加入2.5 mL该储存液（相当于终浓度为50 U/mL青霉素和50 µg/mL 链霉素
胰蛋白酶 II-S 型	Sigma（默克，德国达姆施塔特）	T7409	在 dPBS 溶液中配制 1 mg/mL 的溶液。
胰蛋白酶抑制剂 I-S 型	Sigma（默克，达姆施塔特，德国）	T6522	配制1 mg/mL的dPBS溶液，并补充2 µg/ml DNase I（详见下文）。
Dnase I	Sigma（默克，达姆施塔特，德国）	D5025	使用胰蛋白酶抑制剂溶液（见上文）。
0.2 µm 聚醚砜（PES）无菌过滤系统	康宁公司（美国纽约州康宁市）	431097	用于调整后的dPBS和L-15培养基的无菌过滤。
35 mm 玻璃底细胞培养皿，聚-D-赖氨酸包被	MatTek Corporation (Ashland, MA)	P35GC-1.5-10-C	也可根据下游应用替换为塑料培养皿。
Dumont #5 精细镊子	Fine Science Tools（加利福尼亚州）	11254-20	直头
Dumont #5/45 精细镊子	Fine Science Tools（加利福尼亚州）	11253-25	45度角° 尖端
立体显微镜 SZ61	奥林巴斯公司（日本东京）		用于垂体解剖。
Alegra X-22R 离心机	Beckman Coulter Inc. (Brea, CA)		带冷却选项（类似于当前型号 XR-30）。
水浴锅	特克内（英国斯塔福德郡）		任何可调节温度的水浴装置均可使用。
巴斯德玻璃移液管	VWR (NY)	612-1701	外径 1.6 mm，使用前进行火焰抛光并高压灭菌。
Galaxy MiniStar 台式离心机	VWR（纽约）	521-2844	任何小型台式离心机均可。
细针/昆虫针	Fine Science Tools（加利福尼亚州）	26001-40	直径0.03 mm。也可使用其他细针替代。
石蜡板			通过在大型培养皿中加入熔化的石蜡蜡定制制备。