犬卵巢间充质干细胞的分离与分化

摘要

本文描述了一种从犬卵巢组织中分离、扩增和诱导间充质干细胞分化的实验方法。

摘要

过去十年中，由于间充质干细胞（MSCs）易于分离、扩增和培养，人们对这类细胞的兴趣日益增加。近期研究表明，这些细胞具有广泛的分化潜能。卵巢是细胞治疗的理想候选来源，因为它富含间充质干细胞，并且在卵巢切除术后常作为生物废弃物被丢弃。本文介绍了一种无需细胞分选技术即可从犬卵巢中分离、扩增和诱导间充质干细胞分化的实验方案。由于这些具有高度分化能力的细胞在临床试验和治疗应用中具有广泛的适用性，该方案为再生医学提供了一项重要工具。

引言

过去十年中，专注于干细胞的研究发表数量显著增加，这一研究热潮源于人们共同致力于发现强大的再生医学疗法。干细胞有两个主要的定义性特征：自我更新和分化能力。间充质干细胞负责正常的组织更新，与胚胎干细胞相比，其分化能力较为有限¹。近年来，许多研究表明间充质干细胞具有广泛的分化潜能，目前一个正在讨论的话题是胚胎干细胞与成体干细胞之间是否存在真正差异²。

卵巢表面上皮是一层未定向分化的细胞层，相对未完全分化，同时表达上皮和间充质标志物³，并保留响应环境信号而分化为不同类型细胞的能力⁴。卵巢中干细胞的确切位置尚不明确；然而，已有研究提出，白膜中的双潜能前体细胞可分化为生殖细胞⁵。免疫学研究推测这些细胞可能起源于间质⁶，或位于卵巢表面或其邻近区域⁷。由于间充质干细胞表达多种在细胞黏附中起重要作用的受体⁸，因此设计了一项实验，以验证通过快速黏附特性筛选细胞群体可分离出具有明确间充质特性的细胞群体这一假设。近期，本课题组报道了基于细胞在培养最初3小时内黏附于培养皿塑料表面的能力，从卵巢组织中分离获得间充质干细胞的方法....

方案

本实验使用了四只雌性杂种犬的卵巢，这些犬只在犬类绝育计划的择期手术后被捐赠。本实验已获得UNESP-FCAV动物使用伦理委员会的批准（方案编号：026991/13）。

1. 实验准备

1. 制备或购买 500 mL 无钙、无镁的无菌杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）。
2. 通过将 40 µg 酶溶于 1 mL DPBS 中配制胶原酶 I 储存液。使用 0.2 µm 注射器滤器过滤，并将 2 mL 分装样品储存于 -20 °C。
3. 使用低糖杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），添加 10% 胎牛血清和 1% 抗生素，配制培养基。
4. 准备无菌器材：剪刀和镊子、组织培养瓶、培养皿、离心管，以及 10 mL 和 5 mL 移液器。
5. 使用标准细胞培养实验设备：生物安全柜（BSC）、设定为 5% CO₂ 和 38 °C 的细胞培养孵育箱，以及离心机。
6. 清洁生物安全柜：戴手套后，用 70% 乙醇擦拭，并开启紫外灯进行灭菌。

2. 从卵巢中分离间充质干细胞

1. 手术后，将卵巢置于含有 PBS 的锥形管中并置于冰上，直至运送到实验室。
2. 用 10 mL PBS 填充两个 100 mm 培养皿。
3. 从管中取出卵巢，转移至第一个含 PBS 的培养皿中，通....

结果

从犬卵巢中分离间充质干细胞：

卵巢MSC的分离流程总结见 图1。手术后，经过组织剪碎、胶原酶消化以及培养开始3小时后的培养基更换，成功地从犬卵巢组织中分离出一群具有快速贴壁特性的拟似MSC细胞群。收获的细胞迅速贴附于培养皿的塑料表面，并生长成为形态均一的单层细胞，具有典型的MSC样形态特征（图3）。

卵巢间充质干细胞的表征 体外

讨论

本文提供了证据，表明间充质干细胞（MSCs）可以从犬卵巢组织中分离获得，而卵巢组织在卵巢切除术后通常被视为生物废弃物。由于卵巢中存在多种细胞类型，我们提出了一种基于细胞快速贴附于塑料表面的间充质干细胞筛选方案，该方法成功筛选出呈单层生长且具有成纤维细胞样形态的细胞。

首次报道从骨髓中分离间充质干细胞（MSCs）是基于MSCs在培养最初48小时内具有贴壁生长的特性¹¹；然而，已有研究指出，该方法至少在骨髓来源的细胞中可能分离出表型和功能上均具有异质性的细胞群体¹²。本研究所提出的培养方法同样利用细胞的贴壁特性进行筛选，无需预先分选目标细胞，即可从含有多种细胞类型的组织中分离出间充质细胞。由于间充质干细胞表达多种在细胞黏附过程中起重要作用的受体⁸，因此推测，若选择具有快速贴壁能力的细胞群体，可在第一代获得表型更为均一、且具备稳定MSC特征的细胞群体。代表性实验结果表明，通过缩短贴壁时间的贴壁分离法，可在第一代即获得形态学上均一的MSC群体，无需.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DPBS	Thermo Fisher	14190144
胶原酶 I	Thermo Fisher	17100017
组织培养瓶	Corning	CLS3056
DMEM 低糖培养基	Thermo Fisher	11054020
胎牛血清	Thermo Fisher	12484-010
TrypLE express	Thermo Fisher	12604021
StemPro 脂肪生成分化试剂盒	Thermo Fisher	A1007001
StemPro 软骨生成分化试剂盒	Thermo Fisher	A1007101
StemPro 成骨生成分化试剂盒	Thermo Fisher	A1007201
STEMdiff 确定性内胚层诱导试剂盒	StemCell	5110
青霉素-链霉素	Thermo Fisher	15070063
CD45	AbD Serotec	MCA 2035S
CD34	AbD Serotec	MCA 2411GA
CD90	AbD Serotec	MCA 1036G
CD44	AbD Serotec	MCA 1041
Nestin	Milipore	MAB353
β-微管蛋白	Milipore	MAB1637
DDX4	Invitrogen	PA5 -23378
IgG-FITC	AbD Serotec	STAR80F
IgG-FITC	AbD Serotec	STAR120F