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方法文章

犬卵巢间充质干细胞的分离与分化

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DOI：

10.3791/58163

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2018年12月16日

 ,  ,  ,  , 
1The School of Agricultural and Veterinary Studies (FCAV), Jaboticabal, São Paulo State University (UNESP), 2CRRF, Université de Montréal, 3FZEA, University of São Paulo, 4FMVZ, University of São Paulo

本文内容

摘要

本文描述了一种从犬卵巢组织中分离、扩增和诱导间充质干细胞分化的实验方法。

摘要

过去十年中，由于间充质干细胞（MSCs）易于分离、扩增和培养，人们对这类细胞的兴趣日益增加。近期研究表明，这些细胞具有广泛的分化潜能。卵巢是细胞治疗的理想候选来源，因为它富含间充质干细胞，并且在卵巢切除术后常作为生物废弃物被丢弃。本文介绍了一种无需细胞分选技术即可从犬卵巢中分离、扩增和诱导间充质干细胞分化的实验方案。由于这些具有高度分化能力的细胞在临床试验和治疗应用中具有广泛的适用性，该方案为再生医学提供了一项重要工具。

引言

过去十年中，专注于干细胞的研究发表数量显著增加，这一研究热潮源于人们共同致力于发现强大的再生医学疗法。干细胞有两个主要的定义性特征：自我更新和分化能力。间充质干细胞负责正常的组织更新，与胚胎干细胞相比，其分化能力较为有限1。近年来，许多研究表明间充质干细胞具有广泛的分化潜能，目前一个正在讨论的话题是胚胎干细胞与成体干细胞之间是否存在真正差异2。

卵巢表面上皮是一层未定向分化的细胞层，相对未完全分化，同时表达上皮和间充质标志物3，并保留响应环境信号而分化为不同类型细胞的能力4。卵巢中干细胞的确切位置尚不明确；然而，已有研究提出，白膜中的双潜能前体细胞可分化为生殖细胞5。免疫学研究推测这些细胞可能起源于间质6，或位于卵巢表面或其邻近区域7。由于间充质干细胞表达多种在细胞黏附中起重要作用的受体8，因此设计了一项实验，以验证通过快速黏附特性筛选细胞群体可分离出具有明确间充质特性的细胞群体这一假设。近期，本课题组报道了基于细胞在培养最初3小时内黏附于培养皿塑料表面的能力，从卵巢组织中分离获得间充质干细胞的方法，旨在获取具有快速黏附特性的纯化细胞群体9。本文中，我们描述了从卵巢组织中分离间充质干细胞的建立方法。

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方案

本实验使用了四只雌性杂种犬的卵巢，这些犬只在犬类绝育计划的择期手术后被捐赠。本实验已获得UNESP-FCAV动物使用伦理委员会的批准（方案编号：026991/13）。

1. 实验准备

  1. 制备或购买 500 mL 无钙、无镁的无菌杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）。
  2. 通过将 40 µg 酶溶于 1 mL DPBS 中配制胶原酶 I 储存液。使用 0.2 µm 注射器滤器过滤，并将 2 mL 分装样品储存于 -20 °C。
  3. 使用低糖杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），添加 10% 胎牛血清和 1% 抗生素，配制培养基。
  4. 准备无菌器材：剪刀和镊子、组织培养瓶、培养皿、离心管，以及 10 mL 和 5 mL 移液器。
  5. 使用标准细胞培养实验设备：生物安全柜（BSC）、设定为 5% CO2 和 38 °C 的细胞培养孵育箱，以及离心机。
  6. 清洁生物安全柜：戴手套后，用 70% 乙醇擦拭，并开启紫外灯进行灭菌。

2. 从卵巢中分离间充质干细胞

  1. 手术后，将卵巢置于含有 PBS 的锥形管中并置于冰上，直至运送到实验室。
  2. 用 10 mL PBS 填充两个 100 mm 培养皿。
  3. 从管中取出卵巢，转移至第一个含 PBS 的培养皿中，通过轻轻晃动进行清洗。
  4. 小心取出卵巢并放入另一个培养皿中。使用无菌镊子和剪刀将组织剪切成约 1 mm 大小的细小碎片。
  5. 将卵巢组织转移至一个 35 mm 培养皿中，并加入 2 mL 胶原酶，进一步轻微剪切组织。
  6. 将培养皿置于 38 °C 培养箱中孵育 3 小时，每隔 20 分钟轻轻以环形动作摇动培养皿。
  7. 3 小时后，从培养箱中取出培养皿。
  8. 将培养皿中的内容物转移至 15 mL 离心管中，加入 5 mL 扩增培养基。
  9. 离心前轻轻颠倒混匀管内液体。在 2100 × g 条件下离心 7 分钟。弃去上清液，并用 3 mL 扩增培养基重悬沉淀。
  10. 将沉淀转移至 T25 培养瓶中。将培养瓶置于含 5% CO2、38 °C 的培养箱中孵育 3 小时。
    注意：该操作最关键的步骤是在孵育 3 小时后更换培养基。
  11. 从培养箱中取出培养瓶，移除含有残留组织的培养基，并向瓶中加入 3 mL 新鲜扩增培养基。
  12. 每 48 小时更换一次培养基，并观察培养瓶中细胞的融合情况。
    注意：该操作的主要步骤可参见 图 1。

3. 卵巢来源间充质干细胞的扩增

  1. 细胞传代
    1. 当细胞达到汇合状态时，移除培养瓶中的培养基。
    2. 用 3 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）清洗培养瓶，然后吸除 PBS。
    3. 加入 1.5 mL 胰蛋白酶，将培养瓶置于 38 °C 培养箱中孵育 3 分钟。轻轻敲击培养瓶以帮助细胞脱落。
      注意：细胞通常在初次接种后约 5 - 7 天达到汇合状态。
    4. 加入 3 mL 扩增培养基，将内容物转移至锥形管中。
    5. 在 2100 × g 条件下离心 7 分钟。弃去上清液，加入 1 mL 扩增培养基。
    6. 轻轻混匀管内液体。
    7. 取 10 µL 样品进行细胞计数，并将含有细胞的管重新放回培养箱中。
    8. 将 10 µL 混合液加入血细胞计数板中。
  2. 细胞计数
    1. 使用显微镜的 10X 物镜，对焦于血细胞计数板的网格线。
    2. 计数五个小方格内的细胞数（图 2）。
    3. 将计得的细胞数乘以 50,000，以估算每毫升中的细胞数量。

4. 卵巢来源间充质干细胞的分化

注意：分化实验按照 Hill et al.9 建立的指南进行。

  1. 使用4孔培养板，每孔接种1.0 × 104个细胞，设三个重复孔。
  2. 每孔加入1 mL扩增培养基。
  3. 轻轻以环形运动晃动培养板。
  4. 24小时后，将培养基更换为所需的诱导分化培养基。
  5. 进行成骨、成脂和成软骨分化时，使用诱导培养基培养细胞30天，每3天更换一次培养基。每种分化实验均使用特定的分化试剂盒。
  6. 进行神经系分化时，在诱导培养基中培养细胞10天，每3天更换一次培养基。所用培养基包含低糖DMEM、2 mM丙戊酸、1 µM氢化可的松、10 µM佛司可林、5 mM氯化钾、5 µg/mL胰岛素和200 µM丁基化羟基茴香醚。
  7. 进行内胚层前体细胞分化时，根据试剂生产商的说明，使用内胚层培养基培养5天。
  8. 进行原始生殖细胞系分化时，在诱导培养基中培养细胞14天，每3天更换一次培养基。所用培养基包含DMEM、10% FBS、1 mM丙酮酸钠、10 ng/mL白血病抑制因子（LIF）、1 mM非必需氨基酸、2 mM L-谷氨酰胺、5 µg/mL胰岛素、0.1 mM β-巯基乙醇、60 µM腐胺、20 µg/mL转铁蛋白、10 ng/mL小鼠表皮生长因子、1 ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子、40 ng/mL人胶质细胞系源性神经营养因子以及15 mg/L青霉素。

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结果

从犬卵巢中分离间充质干细胞：

卵巢MSC的分离流程总结见 图1。手术后，经过组织剪碎、胶原酶消化以及培养开始3小时后的培养基更换，成功地从犬卵巢组织中分离出一群具有快速贴壁特性的拟似MSC细胞群。收获的细胞迅速贴附于培养皿的塑料表面，并生长成为形态均一的单层细胞，具有典型的MSC样形态特征（图3）。

卵巢间充质干细胞的表征 体外

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讨论

本文提供了证据，表明间充质干细胞（MSCs）可以从犬卵巢组织中分离获得，而卵巢组织在卵巢切除术后通常被视为生物废弃物。由于卵巢中存在多种细胞类型，我们提出了一种基于细胞快速贴附于塑料表面的间充质干细胞筛选方案，该方法成功筛选出呈单层生长且具有成纤维细胞样形态的细胞。

首次报道从骨髓中分离间充质干细胞（MSCs）是基于MSCs在培养最初48小时内具有贴壁生长的特性11；然而，已有研究指出，该方法至少在骨髓来源的细胞中可能分离出表型和功能上均具有异质性的细胞群体12。本研究所提出的培养方法同样利用细胞的贴壁特性进行筛选，无需预先分选目标细胞，即可从含有多种细胞类型的组织中分离出间充质细胞。由于间充质干细胞表达多种在细胞黏附过程中起重要作用的受体8，因此推测，若选择具有快速贴壁能力的细胞群体，可在第一代获得表型更为均一、且具备稳定MSC特征的细胞群体。代表性实验结果表明，通过缩短贴壁时间的贴壁分离法，可在第一代即获得形态学上均一的MSC群体，无需...

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披露

作者无任何披露信息。

致谢

作者感谢圣保罗州立大学兽医与动物科学学院（UNESP-FCAV）的犬类绝育项目慷慨提供卵巢组织。本研究得到了圣保罗研究基金会（FAPESP，项目编号：2013/14293-0）和巴西高等教育人员改善协调机构（CAPES）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DPBS Thermo Fisher14190144
胶原酶 IThermo Fisher17100017
组织培养瓶CorningCLS3056
DMEM 低糖培养基Thermo Fisher11054020
胎牛血清Thermo Fisher12484-010
TrypLE expressThermo Fisher12604021
StemPro 脂肪生成分化试剂盒Thermo FisherA1007001
StemPro 软骨生成分化试剂盒Thermo FisherA1007101
StemPro 成骨生成分化试剂盒Thermo FisherA1007201
STEMdiff 确定性内胚层诱导试剂盒StemCell5110
青霉素-链霉素Thermo Fisher15070063
CD45AbD SerotecMCA 2035S
CD34AbD SerotecMCA 2411GA
CD90AbD SerotecMCA 1036G
CD44AbD SerotecMCA 1041
NestinMiliporeMAB353
β-微管蛋白 MiliporeMAB1637
DDX4InvitrogenPA5 -23378
IgG-FITCAbD SerotecSTAR80F
IgG-FITCAbD SerotecSTAR120F

参考文献

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