本文介绍了一种可重复、准确且高效的定量PCR（qPCR）方法，用于定量T7噬菌体。该方案详细描述了噬菌体基因组DNA的制备、PCR反应体系的配制、qPCR扩增条件以及qPCR数据分析方法。
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摘要
摘要
本方案描述了使用定量PCR（qPCR）对噬菌体筛选实验中的T7噬菌体进行定量计数的方法即， "生物淘选"）。qPCR 是一种基于荧光的 DNA 定量方法，此处被用于通过定量噬菌体基因组来间接定量噬菌体颗粒。本方案描述了一种简便的噬菌体 DNA 制备方法，该方法采用高温加热处理，无需额外的 DNA 纯化步骤。该方法仅需少量经加热处理的噬菌体样品以及少量 qPCR 反应体系。qPCR 具有高通量和快速的特点，可在 2–4 小时内完成 96 孔板反应的处理并获得数据。与其他噬菌体计数方法相比，qPCR 更为省时高效。本文中，qPCR 被用于计数通过生物淘选筛选出的 T7 噬菌体 体外 囊性纤维化样黏液模型。该qPCR方法可拓展用于定量其他实验中的T7噬菌体，包括其他类型的生物筛选例如., 体内固定化蛋白质结合 噬菌体筛选）及其他来源（例如， 水系统或体液）。总之，本方案可经修改用于定量任何包裹DNA的病毒。
引言
噬菌体展示技术由 George Smith 于 1985 年开发，在过去二十年中已成为一种强大且高通量的方法，可用于从细胞膜、疾病抗原、细胞器或特定器官与组织中筛选针对靶标或受体的肽或蛋白质配体1,2在此，多肽或单链抗体的随机文库被展示在噬菌体（通常为M13或T7）的衣壳蛋白上，通过针对固定化蛋白质进行淘选，可鉴定出特异性配体。 体外 或 体内 通过迭代筛选过程识别生物系统中的配体。随后，可将这些配体与成像剂或治疗剂偶联，用于疾病的诊断与治疗3,4在生物筛选的多个步骤中，准确计数噬菌体至关重要：（1）定量结合到基质上的噬菌体；（2）定量噬菌体以判断每轮筛选过程中是否存在富集（噬菌体富集表明经生物筛选获得的噬菌体对靶标的亲和性）。目前用于定量的金标准方法——双层琼脂斑测定法存在多项挑战：操作繁琐、耗时，且在处理大量样本时可能不够准确。因此，本研究团队开发了一种灵敏、可重复、准确且高效的定量聚合酶链式反应（qPCR）方法，用于计数生物筛选过程中获得的M13和T7噬菌体颗粒5.
qPCR 是一种准确量化 T7 和 M13 噬菌体的有吸引力且可行的方法。由于每个独立的噬菌体颗粒仅含有一个基因组 DNA 拷贝（双链 DNA 或单链 DNA），一个噬菌体基因组等同于一个噬菌体颗粒；通过量化噬菌体基因组的数量，即可实现对噬菌体数量的量化。在 qPCR 过程中，荧光报告染料在 PCR 扩增过程中非特异性或通过序列特异性引物特异性地结合噬菌体基因组 DNA，荧光信号随着每一轮扩增而增强。当荧光信号达到阈值时，该轮/周期的扩增被记为阈值循环数（Ct）。将已知浓度的标准噬菌体 DNA 与其对应的 Ct 值作图，建立标准曲线。利用该标准曲线及待测 DNA 样本的 Ct 值，可推算出噬菌体的浓度。
尽管已有多种策略被开发并广泛用于定量生物筛选中的噬菌体，但每种方法均存在特定的挑战。最常用且传统的技术是双层琼脂平板噬斑实验。该方法将宿主细菌与系列稀释的噬菌体混合后，接种于固体琼脂培养基表面，并覆盖一层琼脂；通过统计形成的噬斑数量来计数噬菌体（即， 噬菌斑形成单位（plaque forming units 或 pfu）在琼脂平板上进行计数。噬菌斑测定法虽然灵敏，但操作繁琐、耗时且准确性较差，尤其在处理大量样本或高浓度样品时更为明显。5此外，已对酶联免疫吸附测定法（ELISA）进行改进，用于计数M13和T7噬菌体颗粒6,7,8在此，不同稀释度的噬菌体被结合并捕获在固体基质上（即， 微孔板），用噬菌体特异性抗体进行探针杂交，并通过报告分子进行检测（例如， 酶敏感性生色底物、荧光团）以确定存在的噬菌体颗粒数量。检测信号（例如， 荧光、吸光度）可用于通过已知浓度的噬菌体标准品来定量未知浓度的样品。已开发出多种基于噬菌体的ELISA方法，但这些方法可能存在一定局限性。有研究团队开发了一种基于纸张的夹心ELISA，其定量范围跨越七个数量级（102-109 pfu/mL）；然而，该方法需要多步抗体包被操作，且检测过程耗时长达一整天8我们课题组还开发了一种ELISA方法用于定量M13噬菌体颗粒，但其检测灵敏度范围较低，为106 到 1011 pfu/mL5可切换的镧系荧光探针已用于M13的计数，可在20分钟内获得定量数据；然而，该检测方法的动态范围较窄，仅为109 至 1012 pfu/mL9一组研究人员采用原子力显微镜对溶液中的M13噬菌体颗粒进行计数，但该方法需要先进的电子显微技术，且仅在较窄的浓度范围内有效。10另一项研究利用单分散乳液捕获荧光标记的M13和T4报告噬菌体，并通过荧光液滴数量来计数噬菌体；然而，该方法的定量范围也较窄，仅为102 至 106 pfu/mL11虽然液滴数字PCR已被用于定量M13噬菌体，但该方法无法区分感染性与非感染性噬菌体颗粒的数量。12.
我们课题组近期开发了qPCR方法，利用两种不同的荧光报告染料，对通过针对血脑屏障细胞模型进行生物淘选所获得的T7和M13噬菌体进行定量检测。5与前述定量方法相比，我们开发的qPCR方法具有高通量、省时的优点，可快速定量大量样品，并通过DNase I预处理样品有效区分感染性与非感染性噬菌体。尤为重要的是，该方法能够对生物筛选样品中的M13和T7噬菌体进行可重复且准确的定量。为指导噬菌体qPCR领域的新手研究人员，本文详细描述了一种用于计数针对半胱氨酸约束文库（CX7C）筛选所得T7噬菌体颗粒的qPCR方法 体外 囊性纤维化（CF）黏液屏障。基于本研究，qPCR 方法可进一步扩展用于定量其他类型生物筛选以及其他来源（包括水、土壤和体液）中的噬菌体颗粒。
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方案
1. T7噬菌体基因组DNA的引物设计与分析
- 设计用于扩增 T7 噬菌体基因组 DNA 的引物。
注意：F（正向）和 R（反向）引物（见材料表）用于扩增位于文库可变区上游的 T7 DNA 序列（图 1）。 - 选择合适的引物分析工具，评估引物的各项参数，包括熔解温度（Tm）、GC 含量百分比（GC%）、引物二聚体、发夹结构形成以及 PCR 适用性（图 1）。
- 订购引物寡核苷酸（oligos），收到后用无 DNase 和 RNase 的超纯水重悬冻干的寡核苷酸，配制成 100 µM 的储存液，置于 1.5 mL 离心管中，于 -20 °C 保存数月。
- 将 100 µM 的引物储存液分装成多份（每份约 50 µL，置于 1.5 mL 管中）。
注意：此步骤旨在避免频繁冻融。
2. 准备T7噬菌体基因组DNA定量用标准品
- 使用超纯 H2O 在 0.2 mL PCR 管中将 0.1 µg/µL（1.0 × 108 fg/µL）的参考 T7 噬菌体 DNA（购自供应商，已知浓度为 0.1 µg/µL，参见材料部分）进行 10 倍系列稀释，稀释范围从 1.0 × 106 至 1.0 × 100 fg/µL。每种浓度配制总体积为 20 µL（图 2）。
- 涡旋混匀 PCR 管，确保每步稀释充分混合。在将 DNA 样品加入下一稀释管时，需更换吸头。
注意：建议每次 qPCR 实验批次均重新配制 DNA 标准品溶液，用于构建标准曲线。 - 使用下方公式 1 将 T7 噬菌体参考 DNA 浓度从 fg/µL 转换为基因组拷贝数（gc）/µL（图 2）。
- T7 噬菌体 DNA 浓度（gc/µL）=
(1)
注意：bp：碱基对；参考 T7 基因组 DNA 为 37314 bp。
3. qPCR 反应制备前噬菌体样品的预处理
- （选项1）移液 20 µL 一次针对生物淘选获得的T7克隆（噬菌体）的 体外 囊性纤维化（CF）样黏液模型加入1.5 mL离心管中。加入1.25单位的DNase I（0.5 µL) 至每个 20 µL 样本
注意：以涂覆在24孔膜插件上的囊性纤维化样黏液为靶标，对T7噬菌体半胱氨酸约束七肽文库（CX7C）进行生物淘选（参见 材料清单) 15分钟。更多细节见结果部分。从洗脱液中选择一个T7克隆用于qPCR样本制备。- 选项2：移液 200 µL 将T7克隆加入1.5 mL离心管中，并加入5单位的DNase I
(2 µL) 加入每个样品中。
注意：此步骤所选噬菌体样品的体积取决于生物淘选所收集的体积。虽然本方案的重点是生物淘选后噬菌体的qPCR检测，但生物淘选的具体步骤详见T7噬菌体试剂盒的用户说明书（参见 材料清单)13.
- 选项2：移液 200 µL 将T7克隆加入1.5 mL离心管中，并加入5单位的DNase I
- 盖上T7噬菌体样品管（步骤3.1）的管盖，并将它们孵育于 37 °C 在预热的干浴器中孵育10分钟（即， 加热块）
- 将步骤 3.2 中的试管置于 100 °C 在加热的干浴器中孵育15分钟（图3A).
注意：由于加热步骤中会发生蒸发和冷凝现象，务必确保1.5 mL离心管完全盖紧管盖。 - 将步骤 3.3 中热处理的噬菌体在 18,534 x g 10秒。将试管置于触控激活模式的涡旋混合器上涡旋10秒以混匀噬菌体，随后在18,534 x g 再次持续10秒。
注意：旋涡-混合-再旋涡的循环操作旨在确保加热后的噬菌体样品充分混匀。 - 将样本管置于实验台静置，于室温（RT）下冷却，或储存于 4 °C 在冰箱中过夜。
注意：本步骤可暂停实验。
4. 准备 qPCR 反应
注意：一个 PCR 反应对应一个样本。每个 PCR 反应包含 5 µL qPCR 预混液（见材料），1 µL 5 µM 引物对混合液，2 µL H2O 和 2 µL 经热处理的 T7 噬菌体样本。对于多个 PCR 反应，除噬菌体样本外的所有试剂在 1.5 mL 离心管中预先混合。预混液中每种试剂的体积取决于进行 qPCR 的噬菌体样本数量。
- 为10个未知浓度的噬菌体生物筛选样本和7个已知标准浓度的样本（每个样本设三个重复）准备qPCR预混液。因此，共有51个样本，即进行51次qPCR反应（即每个样本一次反应）。对于51次反应，配制预混液：255 µL qPCR预混试剂（51×5 µL）、51 µL引物（51×1 µL）和102 µL H2O（51×2 µL）。
注意：建议额外多准备几份qPCR反应体系，以补偿将PCR预混液分装至96孔qPCR板各孔时可能发生的体积损失。 - 将8 µL PCR预混液分装至96孔qPCR板的51个孔中（即共51次qPCR反应）。分装过程中无需更换枪头。
- 向每个孔中加入2 µL热处理后的T7噬菌体样本（步骤3.4）或T7噬菌体参考DNA（步骤2.1）（图3B）；在向不同孔中添加不同DNA样本时必须更换枪头，以防止交叉污染。此外，应将2 µL DNA样本加至qPCR预混液液面以下（即加入8 µL PCR预混液中）。
- 使用粘性封板膜密封qPCR板。
注意：无论使用何种类型的qPCR板，此步骤均至关重要。应使用推荐的试剂盒彻底密封板面；否则，任何未密封区域都可能导致PCR扩增过程中发生体积损失。 - 用铝箔纸包裹qPCR板，以减少荧光信号的光漂白，随后将板放入qPCR仪中运行程序。
5. qPCR 循环条件
注意：qPCR 扩增条件根据特定的 qPCR 仪器设置（参见材料表）。
- 将96孔qPCR板放入qPCR仪器中运行。在仪器上从菜单中选择设置，以建立以下实验条件（图3C）。
- 针对10 µL的样品体积，设置如下循环条件：50 °C下1个循环、持续2 min，95 °C下1个循环、持续2 min，随后进行40个循环（95 °C下15 s，60 °C下1 min）。之后运行熔解曲线程序：95 °C下15 s、60 °C下1 min，再95 °C下15 s，共1个循环。
- 按照步骤6所述进行数据分析。
6. 分析qPCR原始数据并将T7噬菌体的qPCR Ct值转换为gc/µL
- 分析原始qPCR数据，并通过分析原始数据的特征图来评估数据质量（图4).
注意：扩增曲线图、多组分图和熔解曲线图是验证qPCR数据质量的关键特征图。 - 根据标准曲线中每个浓度的三个重复样本（步骤 2.1），计算平均阈值循环（Ct）值。
- 绘制平均 Ct 值（Y 轴）相对于 log (gc/µL) (X)，得到线性曲线 Y = kX + b（k 为线性曲线的斜率，b 为截距）。
- 计算线性系数14 R2 (R2 必须是 >0.99).
- 使用标准曲线 Y = kX + b 计算生物筛选样品中 T7 噬菌体的数量（即， 针对囊性纤维化样黏液筛选出的噬菌体）在 gc/µL (图5).
注：k 为标准曲线的斜率。 - 通过以下公式计算扩增效率
(2)
注意：k 是由参考 DNA 的 qPCR 结果生成的标准曲线的斜率。扩增效率的理想范围为 90–110%。
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结果
可使用不同的引物设计工具来设计qPCR引物。通常，引物设计程序具有内置算法，用于计算和验证引物的关键参数， 例如， GC含量、熔解温度（Tm）、引物二聚体或发夹结构形成 等等。 通常，不同引物设计工具的关键标准相似，可根据其说明进行引物设计。可使用Primer BLAST验证引物的特异性。以下展示一对靶向T7基因组DNA可变区上游的引物 图1为了确定生物淘选中噬菌体样品的未知浓度，采用绝对定量方法——标准曲线定量法——对噬菌体基因组DNA拷贝数进行计数。使用已知浓度的参考T7噬菌体DNA（见材料） 0.1 µg/µL 从1.0 × 10开始连续稀释0 至 1.0 x 106 fg/µL. 采用公式1将T7噬菌体DNA浓度从fg/µL 基因组拷贝数（gc）/µL；参考 T7 噬菌体 DNA 浓度为 2.66 x 101 至 2.66 × 107 gc/µL (
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讨论
我们开发了qPCR方法用于定量噬菌体基因组DNA5，在此描述并优化了一种qPCR方法，用于计数针对类似囊性纤维化（CF）黏液屏障筛选出的T7噬菌体。我们参照《定量实时PCR实验发表的最低信息标准》（MIQE）指南，开发并验证了用于T7噬菌体计数的qPCR方法15。我们建立的用于定量生物筛选实验中噬菌体的方案，是一种高效、可靠且经济的方法。在qPCR样品制备过程中，本方案仅需对噬菌体溶液进行高温处理（100 °C，15 min），无需像传统方法那样进行噬菌体DNA的提取与纯化步骤11,17,18。此外，为了更准确地计数噬菌体颗粒，在高温处理前向噬菌体溶液中添加DNase，以去除未被包裹的游离噬菌体DNA18,19,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了PhRMA基金会研究启动资助以及美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所授予的R01HL138251号资助的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 材料与试剂 | |||
| T7 基因组 DNA 引物 | IDT | F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT | |
| T7 Select 包装对照 DNA | EMD Millipore | 69679-1UG | |
| MicroAmp 光学 96 孔反应板 | ThermoFisher Scientific | N8010560 | |
| qPCR 预混液——Power up SYBR Green 预混液 | Applied biosystems | A25742 | |
| MicroAmp 光学密封膜试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 4313663 | |
| T7Select 415-1 克隆试剂盒 | EMD Millipore | 70015 | 使用说明：http://www.emdmillipore.com/US/en/product/T7Select-415-1-Cloning-Kit,EMD_BIO-70015#anchor_USP |
| DNase I 溶液 | ThermoFisher Scientific | 90083 | |
| 24 孔 Transwell 小室板 | Corning | 3472 | |
| UltraPure DNase/RNase-Free 去离子 H2O | Invitrogen | 10977015 | |
| 磷酸盐缓冲液（1×） | Corning | 21040CV | |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 仪器设备 | |||
| ViiA7 实时荧光定量 PCR 系统（快速 96 孔模块） | ThermoFisher Scientific | 4453535 | |
| Heraeus Pico 21 微型离心机 | ThermoFisher Scientific | 75002415 | |
| Fisherbrand 数字涡旋混合器 | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| Thermo SCIENTIFIC Multi-Blok 加热模块 | ThermoFisher Scientific | 型号：2001 | |
| Sorvall Legend X1 离心机 | ThermoFisher Scientific | 75004220 | |
| M-20 微孔板摆动转子 | ThermoFisher Scientific | 75003624 | |
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 软件 | |||
| QuantStudio 实时 PCR 软件 | ThermoFisher Scientific | v1.2 | |
| 实时定量 PCR 引物设计 | IDT | ||
| OligoAnalyzer 3.1 | IDT |
参考文献
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