在Nicotiana benthamiana叶片中瞬时异源表达生物合成酶，可将内源性的2,3-环氧鲨烯代谢流导向生成新的高价值三萜类产物。本文描述了一种利用该高效植物表达平台，快速（5天）制备规模生产三萜及其类似物的详细实验方案。
本文内容
摘要
摘要
三萜类化合物是植物天然产物中最大且结构最多样的家族之一。许多三萜衍生物已被证明具有医学相关的生物活性。然而，迄今为止，这种潜力尚未转化为临床中大量基于三萜的药物。这可以说（至少部分原因）是由于对此类化合物缺乏实用的合成途径，这一问题可能阻碍传统药物化学流程对构效关系的探索以及先导候选分子的开发。尽管三萜类化合物具有极大的结构多样性，它们均源自同一个线性前体——2,3-环氧鲨烯。通过在N. benthamiana中瞬时异源表达生物合成酶，可将内源性的2,3-环氧鲨烯前体引导至生成该宿主本身不天然产生的新型高价值三萜产物。农杆菌浸润法是一种在N. benthamiana中实现瞬时表达的高效且简便的方法。该过程涉及将携带目标表达载体的Agrobacterium tumefaciens菌液浸润入植物叶片中。共浸润另一株携带编码可提升前体供应量酶的表达载体的A. tumefaciens菌株，可显著提高产量。经过五天的培养后，即可收获浸润过的叶片材料，并进行处理以提取和分离所得的三萜产物。该方法可通过简单增加实验中所用植株数量实现线性且可靠地放大。本文描述了一种利用该植物平台快速制备规模生产三萜类化合物的实验方案。该方案使用一种易于复制的真空浸润装置，可同时对多达四株植物进行浸润，从而在短时间内实现数百株植物的批次处理。
引言
三萜类化合物是植物天然产物中数量最多、结构多样性最丰富的家族之一。尽管其结构极为多样，但所有三萜类天然产物均被认为来源于同一线性前体——2,3-环氧鲨烯，后者是植物中甲羟戊酸途径的产物。2,3-环氧鲨烯的环化反应由一类称为环氧鲨烯环化酶（OSCs）的酶启动并调控。该环化步骤代表了结构多样化的第一步，自然界中已报道有数百种不同的三萜骨架1。这些骨架进一步通过修饰酶（包括但不限于细胞色素P450酶（CYP450s））进行结构修饰，从而产生更多样化的产物1,2。此类生物合成途径可导致极高的结构复杂性，有时最终产物与其母体三萜的结构已几乎无法辨认。例如，强效杀虫剂和拒食剂印楝素的复杂结构被认为源自四环三萜中的苦木烷型三萜骨架3。
许多三萜类天然产物，即使其母体骨架相对未经过修饰，也已被证明具有医学相关的生物活性4,5,6,7。然而，迄今为止，这种潜力尚未转化为临床上大量三萜类药物。这可以说（至少部分原因）是由于对此类化合物缺乏实用的合成途径，这一问题可能阻碍通过传统药物化学流程对构效关系进行探索以及先导化合物的开发。
在N. benthamiana叶片中瞬时表达其他植物物种的三萜类生物合成酶，可将内源性的2,3-环氧鲨烯代谢流导向合成新的高价值三萜类产物（图1）。该方法可用于功能鉴定候选酶，并重建重要天然代谢产物的生物合成途径。同样，该策略也可应用于组合生物合成方法，以生成新颖的三萜类化合物，从而构建一系列结构相似的类似物库，系统性地研究生物活性先导化合物的构效关系8,9。
农杆菌浸润法是一种在N. benthamiana叶片中实现瞬时表达的高效且简便的方法。该过程包括将含有目标双元表达载体的A. tumefaciens菌液浸润到叶片中。通过施加压力，使液体 forced 通过气孔进入，排出细胞间隙中的空气，并以A. tumefaciens菌液取而代之。细菌将相应的T-DNA转移至植物细胞内部，从而在浸润的叶片组织中实现局部且瞬时的蛋白表达。
尽管任何适用于产生转基因植物的双元载体均可用于瞬时表达，但我们采用的是豇豆花叶病毒（Cowpea Mosaic Virus, CPMV）衍生的超翻译（HT）蛋白表达系统10,11。在该系统中，目的基因两侧为CPMV RNA-2的非翻译区（UTR）。5' UTR含有特定修饰，可实现极高水平的蛋白质翻译，且不依赖病毒复制12。该技术已发展为“简易快速”（Easy-And-Quick, pEAQ）双元载体系列，其中包含适用于位点特异性重组克隆的构建体（pEAQ-HT-DEST）10,11。大多数pEAQ载体还在表达盒的T-DNA区域含有源自番茄丛矮病毒的P19基因沉默抑制因子13，从而无需共浸润携带P19的单独菌株，即可在宿主植物细胞中实现极高水平的蛋白表达10,11。
在研究植物生物合成途径时，使用N. benthamiana作为表达宿主具有独特优势。其细胞结构本身支持适当的mRNA和蛋白质加工以及正确的区室化，并且具备必要的辅酶、还原酶（用于CYP450）和代谢前体。其碳源来自光合作用，因此只需将植物种植于优质堆肥中，仅需水、空气中的CO2和阳光作为输入即可生长。该平台在共表达不同组合的蛋白质方面也极为便捷，可通过共注射不同菌株的A. tumefaciens轻松实现，从而无需构建大型多基因表达盒。此外，该过程可通过简单增加实验中所用植株数量实现线性且可靠的扩增。
本实验室先前的研究已证明该平台在制备规模实验中的实用性，包括制备新型三萜化合物用于生物活性检测，以及放大生产以获得克级分离产物。此外，通过共表达一种N端截短且对反馈抑制不敏感的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（tHMGR）——甲羟戊酸途径中一种限速的上游酶——可使异源三萜产物的积累量提高数倍8。
此类制备规模实验的关键在于能够方便地放大渗透过程。在典型实验中，可能需要数十至数百株植物才能达到目标产物的分离量。通过手工（使用无针注射器）逐片浸润叶片在操作上要求高，且往往耗时过长，使该方法难以常规放大应用。真空浸润相比手工浸润具有优势，因其不依赖操作者的技术水平，并可实现更大叶面区域的浸润。该方法已用于商业化大规模生产药用蛋白14。本方案采用一种易于复制的真空浸润装置，可由市售部件组装而成。该装置可同时浸润多达4株植物，从而在短时间内快速、高效地完成数百株植物的批次浸润（图2a - 2b）。真空浸润装置由一台真空烘箱构成浸润室（图2f），烘箱通过真空储罐连接至真空泵，这显著缩短了在浸润室内达到目标真空度所需的时间。植物被固定于定制支架上，并倒置浸入装有A. tumefaciens悬浮液的10 L不锈钢水浴中（图2a - 2c）。确保植物地上部分完全浸没对于实现高效浸润至关重要。随后将水浴置于浸润室内（图2d - 2e），施加真空以抽出叶片间质空间中的空气。当压力降低880 mbar（此过程约需1分钟）后，通过打开烘箱进气阀，在20 - 30秒内迅速使浸润室恢复至大气压，此时浸润即已完成。
侵染后第五天，植物材料即可进行采收，并随后提取和分离目标产物。自此之后的流程即为从叶片材料中提取和纯化天然产物的常规步骤，这一工作流程对于任何天然产物化学研究人员而言都十分熟悉。目前存在多种不同的初始提取及后续纯化方法15。具体方法的选择以及实验条件的设定，在很大程度上取决于目标化合物特定的化学性质，同时也受实验人员技能水平和/或设备可用性的限制。本实验方案无法也不宜提供一种完全通用、可盲目套用于任何目标三萜产物的从采收植物叶片材料到最终分离产物的逐级操作流程。然而，本方案将概述我们实验室所采用的基本工作流程，并介绍该流程前期阶段的一些方法，根据我们的经验，这些方法对大多数含氧非糖基化三萜产物具有较好的普适性。其中包括两种相对少见的技术：加压溶剂萃取（Pressurized Solvent Extraction, PSE）以及利用强碱性离子交换树脂进行叶绿素去除的简便非均相相分离方法。
PSE 是一种从固体基质中高效提取小分子有机物的技术。提取过程在加压条件下进行（约 100 - 200 bar），其主要优势在于能够使用超过萃取溶剂沸点的升高温度。与简单的回流或索氏萃取等其他热溶剂方法相比，该方法可显著减少实现完全萃取所需的时间和溶剂用量。16市面上可购买到商用的台式PSE仪器，其采用可更换的提取单元，并具备自动化的溶剂处理、加热和监测功能，使该技术使用极为便捷。此外，该方法的危险性可能更低，尤其对于实践经验较少的化学操作人员而言更为安全。
在回流条件下对粗制叶提取物进行皂化，随后进行液/液分配，是常规用于在进一步纯化或分析前大量去除叶绿素的技术。然而，该方法在较大规模操作时往往较为繁琐。此外，界面难以识别，或因乳化现象导致产物损失，均可能带来问题。采用强碱性离子交换树脂进行非均相相水解可作为一种便捷的替代方法。水解后叶绿素的色素部分仍吸附在树脂上，可通过简单过滤予以去除。本方案采用了一种此前报道的分析方法17的制备规模改进版本，使用市售的碱性离子交换树脂。
下文介绍了一种利用该植物平台进行三萜类化合物制备规模生产的详细且快速的实验方案。本实验室常规采用此方案制备数十至数百毫克的纯化三萜产物，用于核磁共振（NMR）波谱法进行结构表征，和/或进一步开展功能检测研究。
方案
注意：在执行本方案之前，应熟悉所用所有物质的材料安全数据，并采取适当的安全预防措施。这些措施包括但不限于：在真空条件下操作玻璃器皿时佩戴护目镜，以及在通风橱中处理干燥的硅胶。此外，必须查阅并遵守当地关于转基因材料操作的法律法规，包括遵循适当的 containment 操作程序。
1. 制备用于侵染的A. tumefaciens菌株
注意：我们在此提供生成适用于瞬时表达的A. tumefaciens菌株所需步骤的简化描述。这些步骤的更多细节见Sainsbury et al.8。
- 通过PCR扩增或合成目的基因的蛋白编码区，其两侧分别带有适用于位点特异性重组克隆策略的5’和3’ attB序列，以构建入门克隆18,19.
- 使用正向引物： GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTANNNNNNNNNNNNNNNNNN，反向引物： GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTANNNNNNNNNNNNNNNNNN（NNNN… = 特定序列）。
- 使用（代表性）PCR 条件：反应体系（总体积 25 µL），缓冲液（5×，5 µL，参见 材料表），dNTPs（10 mM，0.5 µL），正向引物（10 µM，1.25 µL），反向引物（10 µM，1.25 µL），模板DNA（浓度可变，50–250 ng，0.5 µL），DNA聚合酶（2000 U/mL，0.25 µL，参见 材料表），无核酸酶水（加至25 µL）。PCR扩增程序如下：初始变性（98 °C，30 s）；循环步骤（98 °C，30 s；45–72 °C，20 s；72 °C，30 s/kb），共35个循环；最终延伸（72 °C，10 min）。
- 遵循标准的位点特异性重组克隆实验方案18,19 使用任何非卡那霉素抗性的入门载体（我们使用 commercially available 的 pDONR207）构建入门克隆。
注意： 在用于生成 pEAQ- 之前，应通过测序确认入门克隆的完整性HT-DEST1 表达载体。pEAQ-HT-DEST1 可向位于英国诺里奇的约翰英纳斯中心 Lomonossoff 实验室申请获取。 - 分离 pEAQ-HT-DEST1 载体，来自步骤 1.1.3 中构建的表达克隆，于 -20 °C 保存，待步骤 1.3 使用
注意： 任何市售的基于离心柱的质粒纯化试剂盒，专为从克隆菌株中提取质粒而设计 E. coli 适用于该情况。请遵循所选质粒纯化试剂盒的特定说明（参见 材料表).
- 制备化学感受态 A. tumefaciens 用于转化。
- 在选择性LB（Luria-Bertani培养基：10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl、5 g/L酵母提取物，10 g/L琼脂，pH 7.0）琼脂平板（含50 μg/mL利福平、100 μg/mL链霉素）上划线接种 A. tumefaciens 从甘油冻存菌种中接种LBA4404，在28 °C静置培养箱中过夜培养。
- 接种50 mL选择性液体LB培养基（含50 μg/mL利福平，100 μg/mL链霉素） A. tumefaciens 来自步骤1.2.1的LBA4404细胞。在28 °C、200 rpm条件下于摇床培养箱中过夜培养。
- 将步骤1.2.2中的培养物置于冰上冷却10分钟，然后离心收集菌体 A. tumefaciens 4 °C、4500 × g 离心 5 分钟收集细胞（弃去上清液）。
- 将1.2.3步骤中获得的沉淀物重悬于1 mL预冷的20 mM CaCl₂水溶液中2 溶液，并重复步骤1.2.3的离心操作（弃去上清液）。
- 将步骤1.2.4中的沉淀物重悬于1 mL预冷的20 mM CaCl₂水溶液中2 溶液并将其分装成50 µL的等份。将分装样品在液氮中快速冷冻2 -80 °C 保存，以备使用。
- 转化已制备的 A. tumefaciens LBA4404 菌株含有分离的 pEAQ-HT-DEST1 载体（在步骤 1.2 中构建）
- 解冻 50 µL 的 A. tumefaciens 将步骤1.2中制备的悬浮液置于冰上，并加入100‒200 ng分离的pEAQ-HT-DEST1 载体，于步骤 1.1 中制备，0 °C 孵育 5 分钟。
- 将步骤1.3.1中孵育的悬液进行液氮冷激处理2 30 秒，然后恢复至室温。
- 加入 200 μL SOC 培养基（SOC：20 g/L 细菌胰蛋白胨，5 g/L 酵母提取物，0.58 g/L NaCl，0.19 g/L KCl，2.03 g/L MgCl₂）2，将2.46 g/L七水合硫酸镁、3.6 g/L葡萄糖加入步骤1.3.2的冷激悬浮液中，于28 °C、200 rpm摇床中孵育4小时。
- 将步骤1.3.3中的SOC培养物接种至选择性LB琼脂平板（含50 μg/mL利福平、50 μg/mL卡那霉素、100 μg/mL链霉素），充分涂布，于28 °C静置培养箱中培养3天。
- 从步骤1.3.4中挑取单菌落，接种于5 mL选择性LB培养基（含50 μg/mL利福平、50 μg/mL卡那霉素、100 μg/mL链霉素）中，于28 °C、200 rpm摇床中过夜培养。
- 向1.3.5步骤中的1 mL液体培养物中加入200 μL甘油，充分混匀后于-80 °C保存。
注意： 通过在含有适当抗生素（如下所述）的LB琼脂平板上划线，可使该菌种恢复生长，用于后续实验。
2. 准备侵染悬浮液
- 从第1步制备的甘油菌种中，用划线法接种含有目标 A. tumefaciens 菌株的选择性 LB 琼脂平板。在28 °C静置培养箱中过夜培养。
注意：可同时包含一个携带位于 pEAQ-HT-DEST1 载体中的 tHMGR 基因的菌株。- 分别取第2.1步中培养的每种 A. tumefaciens 菌株样品，接种至50 mL选择性 LB 液体培养基中，在28 °C、200 rpm摇床中过夜培养。
- 将第2.1.1步得到的50 mL培养物分别转移至1000 mL选择性 LB 培养基（含利福平50 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL、链霉素100 μg/mL）中，在28 °C、200 rpm摇床中过夜培养。
- 通过离心（4000 × g）分别收集第2.1.2步所得液体培养物中的 A. tumefaciens 菌体沉淀（弃去上清液）。
- 将第2.1.3步所得的菌体沉淀分别重悬于50 mL新配制的MMA缓冲液中（MMA缓冲液：10 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸，用KOH调pH至5.6，10 mM MgCl2，150 μM 3’5’-二甲氧基-4’-乙酰苯酮），避光室温孵育1小时。
- 根据第2.1.4步制备的每种 A. tumefaciens MMA悬液的适当体积进行混合，使最终总体积为10 L时，每种菌株的OD600至少达到0.2。
- 向第2.1.5步混合后的菌悬液中加入MMA缓冲液，定容至最终体积1 L（立即用于第3步）。
注意：建议额外准备2 L浸润悬浮液，以在浸润过程中维持液体体积。 - 配制1 L 10倍浓度的MMA缓冲液。
3. 进行真空浸润
注意： 真空渗透装置的构建示意图见图2。后续步骤使用种植在9 cm × 9 cm花盆中的5周龄N. benthamiana植株。幼苗应播种于F1培养土（例如 Levington品牌）中，生长2周后移栽至含有F2培养土的独立花盆中。植株应在温室中于25 °C条件下培养，每日光照16小时（必要时使用补光灯），每天浇水，最大种植密度为100株/m2。
- 将步骤2中制备的1 L浸润悬浮液和1 L 10倍浓度的MMA缓冲液转移至浸润浴中，随后加入8 L水。
- 取下定制植物固定架的可拆卸侧翼，插入4株植物（5周龄植物，参见前述说明），然后重新安装侧翼。将固定架倒置并放置在浸润浴上方，使叶片完全浸入浸润悬浮液中。
注意：确保悬浮液液面达到植物固定架的顶部表面。如液面不足，可添加额外的浸润悬浮液以提高液位。 - 将带有浸没植物的浸润浴转移至浸润室，并关闭舱门。确保浸润装置的进气阀处于关闭状态。启动真空泵，先打开通向真空储罐的管路阀，再打开浸润室的真空进气阀。
- 当浸润室内压力降低880 mbar后，关闭真空进气阀，然后打开进气阀。待浸润室恢复至大气压后，打开舱门并取出浸润浴。
- 将植物固定架提起，使植物不再浸没于浸润悬浮液中，然后轻轻摇动固定架，使叶片上多余的悬浮液流回浸润浴中。
- 将固定架恢复直立位置，取下可拆卸侧翼，并取出植物。
- 重复步骤3.1.1至3.1.5，直至完成所需数量植物的浸润处理。
- 使用后的浸润悬浮液在丢弃前须进行高压灭菌处理。
- 浸润浴在后续实验重复使用前须进行高压灭菌。
- 通过70%乙醇清洁浸润室内部，并静置晾干后方可用于后续实验。
- 取下定制植物固定架的可拆卸侧翼，插入4株植物（5周龄植物，参见前述说明），然后重新安装侧翼。将固定架倒置并放置在浸润浴上方，使叶片完全浸入浸润悬浮液中。
4. 培养侵染后的植株
- 将步骤3中浸润的植物以每平方米最多100株的密度排列2 在温室中。
- 在25 °C条件下培养5天，每天光照16小时（必要时使用补充照明），并每日浇水。
5. 收获浸润的叶片
- 生长5天后，收获叶片。
- 在处理前，对废弃的植物材料、花盆和土壤进行高压灭菌。
6. 干燥收获的叶片
注意：以下所述的精确冻干程序取决于可用冻干设备的类型。
- 将收获的叶片进行冻干处理直至干燥。
- 将收获的叶片放入厚度为2 mm的聚丙烯袋中。将装有叶片的袋子置于-80 °C超低温冰箱中冷冻30分钟。
- 用针在袋子上穿刺多个小孔。将装有冷冻叶片的袋子放入冻干机的主腔室中。确保所有烧瓶连接口的阀门均处于关闭状态，然后启动冻干机。待冷凝器温度降至至少-50 °C且系统压力降至至少0.15 mbar后，继续运行过夜。
- 关闭冻干机，通过打开一个烧瓶连接口的阀门释放真空。从主腔室中取出已干燥的叶片，进入步骤7。
7. 加压溶剂萃取
注意：以下步骤涉及使用一种市售的PSE仪器（参见材料表）。有关操作的详细信息，请参考制造商提供的技术文献。该仪器可同时进行4个样品的提取。
- 通过合适的方法将干燥的叶片研磨成粗粉（例如，对于大多数目标三萜类化合物，可使用家用食品加工机，或将叶片装入袋中后手动碾碎）。
注意：通常无需在液氮条件下使用研钵和研杵进行研磨。- 在合适的容器中将叶粉与石英砂（0.3 ‒ 0.9 mm，按体积计20%）混合；石英砂作为分散剂，可提高提取过程的效率。
- 准备4个提取池（120 mL）用于装填。将提取池倒置，依次插入玻璃纤维滤膜、金属烧结滤片和固定塞。然后将提取池恢复直立位置，并在底部加入一层约1 cm厚的石英砂（0.3 ‒ 0.9 mm）。
- 装填提取池。
- 将步骤7.1制备的叶粉装入提取池，直至达到填充线。如有需要，可在装填过程中轻轻压实粉末，以便每个提取池中加入更多的样品量。
- 在压实的粉末顶部覆盖一层薄薄的石英砂（0.3 ‒ 0.9 mm），然后插入顶部的纤维素滤膜。
- 将装填好的提取池插入PSE仪器中，并运行设定的方法。使用以下参数和材料：溶剂：100%乙酸乙酯；温度：100 °C；压力：130 bar。运行3个循环，具体如下：循环1：保持时间0 min；循环2和3：保持时间5 min；最后进行2 min溶剂冲洗和12 min氮气冲洗。
注意：建议首先在小规模上优化提取方法。然而，上述方法通常足以满足大多数氧化型三萜苷元的提取需求。通过将废液管线指定为提取液收集路径，而非标准的独立收集管线，可将各个提取池的提取液合并至同一个外部收集容器中。请注意，所用溶剂量取决于提取池的装填情况以及设定的温度和压力。上述方法在4个平行提取时通常可获得约800 mL的提取液。 - 重复步骤7.2至7.3.3，直至所有叶粉均完成处理。
- 通过减压旋转蒸发将合并后的提取液浓缩至干燥。检查预期产物（即，深绿色浆状物）。
注意：具体操作可能因所用旋转蒸发仪的配置而异。进行旋转蒸发时务必佩戴护目镜，并在施加真空前检查玻璃器皿是否有破损。- 开启冷却循环器，使传热液体冷却至至少5 °C。开启水浴并设定温度为35 °C。
- 将提取液转移至蒸发瓶中（填充量不得超过蒸发瓶体积的一半）。若总体积超过此限值，应分批浓缩（使用同一蒸发瓶）。将装有液体的蒸发瓶连接至旋转蒸发仪的蒸汽导管上（用接头夹固定）。
- 调节蒸发瓶的升降位置和角度，使其底部三分之一部分以约45°角浸入水浴中。启动旋转，调节转速，使提取液开始沿瓶壁铺展。
- 确保通气阀关闭，然后开始通过真空泵控制器降低系统压力，直至冷凝器与接收瓶之间出现适中的滴液。
注意：切勿让提取液开始沸腾。若发生沸腾，应降低真空强度以控制蒸馏过程。 - 根据需要监测并调节真空强度和旋转速度，直至所有溶剂完全蒸发。
8. 去除叶绿素的基础离子交换树脂处理方法
注意：以下步骤中提到的数量基于最初的实验规模为 100 ‒ 150 株植物。第 8 步不适用于含有羧酸基团的产品，或在碱性条件下会发生水解的功能基团（如酯基）。
- 将第7步得到的粗提物溶于最小体积的乙醇中。
- 向第7.1.1步的产物中加入50 mL碱性离子交换树脂珠（参见材料表），室温下振荡30分钟。
注意：不得用搅拌装置替代振荡操作。磁力搅拌或机械搅拌可能破坏树脂珠的完整性。也可通过将反应瓶置于旋转蒸发仪上缓慢旋转（真空阀关闭或处于常压状态）来实现适当的搅动。 - 每间隔30分钟追加50 mL碱性离子交换树脂珠，直至反应完全；树脂珠颜色将由粉红色变为绿色，液相颜色则根据反应规模不同由绿色变为橙色或浑浊的棕色。
- 若对反应是否完成存疑，可取0.5 mL液体样品，通过硅藻土小柱过滤，观察滤液颜色；反应通常在1.5小时内完成。
- 将反应混合物通过短硅藻土柱过滤。
- 可通过减压过滤或使用玻璃快速柱层析柱配合手动打气球加压进行。若过滤速度变慢，可用搅拌棒轻轻搅动硅藻土层表面。收集滤液。
- 依次用乙醇、1:1乙醇:正己烷和正己烷冲洗收集的树脂珠。每次冲洗所用体积应足以使树脂珠在硅藻土柱顶部重新悬浮。
- 合并第8.4步所得滤液与第8.5步的冲洗液，于减压条件下通过旋转蒸发浓缩至干燥。
9. 初步粗分级分离
注意：以下方法通常适用于典型的氧化三萜苷元，并采用自动快速色谱仪进行。有关操作的更多细节，请参考仪器制造商的文献资料。
- 将第8步生成的粗产物吸附于快速色谱级硅胶（孔径：60 Å，粒径：35 ‒ 75 μm）上，以便通过干法上样方法将其加载至快速色谱柱中。
- 用最小体积的合适有机溶剂溶解第8步生成的粗产物，确保完全溶解。
注意：通常，二氯甲烷中加入几滴甲醇是合适的溶剂选择。 - 拧开一个100 g预装快速色谱柱（参见材料表）的顶部，取出内插件，暴露出用于干法上样的顶部空腔。利用该空腔测量适合干法上样的硅胶体积。
- 将量取好的用于干法上样的硅胶转移至粗产物溶液中，然后在减压条件下通过旋转蒸发除去溶剂。
注意：硅胶应恢复为自由流动的粉末状。在蒸发过程接近结束时，可能需要轻轻刮擦以使硅胶从蒸发瓶壁上脱离。 - 使用至少5个柱体积的100%正己烷，在100 mL/min流速下平衡100 g快速色谱柱，理想情况下应持续至柱内填料完全且均匀润湿。
- 通过倾倒方式，将第9.1.3步制备好的干法上样硅胶转移至已平衡的100 g快速色谱柱的干法上样顶部空腔中。如有残留硅胶难以转移，可使用正己烷悬浮并配合宽口移液管辅助转移。
- 用100%正己烷润湿已转移的干法上样硅胶床，以去除干法上样空腔中的空气。
- 运行以下色谱程序：溶剂[A]：正己烷，溶剂[B]：乙酸乙酯，流速：100 mL/min，梯度：在3000 mL内由0% [B] 线性升至100% [B]，收集模式：全部收集，馏分体积：250 mL。
- 通过薄层色谱（TLC）8或气相色谱-质谱联用（GC-MS）8分析各馏分，并对含有目标化合物的馏分在减压条件下通过旋转蒸发浓缩至干。
- 用最小体积的合适有机溶剂溶解第8步生成的粗产物，确保完全溶解。
- 进行后续精细纯化，直至达到所需纯度。
注意：后续精细纯化完全取决于具体化合物，无法提供标准化操作步骤（详见讨论部分）。
结果
典型的分离产率取决于所研究的酶或酶组合、目标化合物的化学稳定性以及纯化过程的难易程度。我们此前报道过，通过组合生物合成实验获得的β-香树脂醇衍生物的分离产率范围为每克干重0.12至3.87毫克 N. benthamiana 叶粉。这些化合物的氧化程度差异较大，并包含非天然的酶组合（图3)8本方案在本实验室常规用于制备数十至数百毫克纯化产物，以进行核磁共振波谱结构表征及后续功能检测。我们还通过该平台制备了0.8 g纯度高于98%的三萜骨架化合物β-amyrin，验证了其制备级应用价值。该实验共使用459株植物，每克干重材料的分离产率为3.3 mg N. benthamiana 叶粉8.
图1：示意图总结。 利用生物合成酶在N. benthamiana叶片中瞬时表达，将内源性2,3-环氧鲨烯的供应导向制备性生产新型高价值三萜类产物的过程示意图。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：真空渗透装置的构建与操作流程。a) 定制植物固定架，其中一侧翼片已拆下。b) 定制植物固定架两侧翼片已安装到位。c) 植物倒置并浸入液体中。d) 渗透浴的插入。e) 渗透浴已放置于渗透室内部。f) 完整的真空渗透装置：(1) 真空泵 (2) 真空泵至真空储罐的连接管路 (3) 真空储罐隔离阀 (4) 真空储罐与渗透室之间的连接管路 (5) 压力表 (6) 进气阀 (7) 渗透室 (8) 真空储罐。g) 一株植物经绿色荧光蛋白（GFP）表达载体渗透处理后，第五天生长的代表性叶片。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：使用本方案制备性合成β-香树脂醇衍生物的既往代表性结果8。本表格按分离产率排序。各列根据相对数值以颜色进行条件格式化标注：红色表示较高值，绿色表示较低值（中间值为黄色）。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
高通量真空浸润技术使得本实验方案可在本实验室常规用于制备具有多种下游应用价值的三萜类化合物。文中所述真空浸润装置易于复制。建议添加真空储罐以缩短达到所需真空度的时间，但也可直接将未经改装的真空烘箱用作浸润室。理论上，通过加装合适的冷凝器来保护真空泵是合理的，但在本实验室的实际操作中发现此步骤并非必需。
如果叶片未完全浸入浸润悬浮液中，则浸润覆盖率会受到影响。为尽量减少该问题，应确保悬浮液液面达到植物固定装置的上表面，并且植物固定装置与浸润浴槽之间紧密贴合。从图2中可以看出，装置就位时，植物固定装置的上表面会凹陷于浸润浴槽内部。这一设计通过固定装置中部边缘的面板实现，这些面板与浸润浴槽顶部形成锚定连接。浸润悬浮液需要定期补充以维持液面高度。最理想的做法是加入过量的浸润悬浮液，以防止在大批量分批浸润过程中OD600逐渐降低。然而，据我们经验，用清水替代部分悬浮液在制备规模上似乎对预期产量无明显影响，尽管该现象尚未进行定量研究。一批浸润悬浮液可处理多少株植物目前仍无定论。我们通常使用一批浸润悬浮液处理100至200株植物。此外，在浸润过程中，少量土壤渗入浸润悬浮液是正常现象。但据观察，这并不会对浸润效率产生明显影响。
收获时建议（但非关键）仅收获经过浸润的叶片（部分叶片可能在浸润后才生长出来）。选择性收获可避免与无生产功能的组织混合，否则会增加内源性杂质相对于目标化合物的比例。这会对后续纯化的难易程度产生轻微影响，并增加这些操作的规模。当使用tHMGR来增强前体供应时，通常会在浸润后的生长期观察到出现坏死表型。这是正常现象，实际上有助于选择性收获以及后续的干燥过程。干燥后的叶片粉末通常可储存在密封容器中，并置于阴凉、干燥、避光处，但最好在真空干燥器中保存。具体储存方式取决于目标化合物的稳定性。若选择在-80 °C超低温冰箱中保存，需格外谨慎。确保干燥叶片置于防水容器中，在取出后、打开容器前，应先让其恢复至室温。若未执行此步骤，将导致叶片重新吸湿，妨碍后续处理。
本方案中的采后步骤仅用于示例说明，并为可能缺乏实际化学操作经验的研究人员提供帮助。这些步骤可用许多其他天然产物提取/纯化技术替代。如引言中所述，加压溶剂萃取（PSE）具有多种优势，但市售PSE设备的资本成本可能过高，且并非必需。使用基础型离子交换树脂处理是一种非常便捷的方法，可替代传统的皂化反应及随后的液-液分配步骤。然而，该方法不适用于含有羧酸基团或在碱性条件下易水解的功能基团（如酯基）的产物，这些产物预期会保留在碱性离子交换树脂上。不过，这一特性有可能被用于开发捕获-释放流程（本文未作记录）。在适合采用传统皂化反应的情况下，基础型离子交换树脂处理可作为便捷的替代方案。步骤9中所述色谱方法已被证实适用于图3中描述的化合物。然而，极性更高的化合物可能需要延长以100%乙酸乙酯洗脱的时间。针对步骤9.2，后续精细纯化完全取决于具体化合物，同时也受制备规模的影响。通常情况下，采用优化梯度的多次小规模快速色谱足以获得适合核磁共振（NMR）分析的纯度。在较大规模时，结晶往往是更便捷的替代方法。在处理困难情况时，可根据所需分离化合物的量选择制备型或半制备型高效液相色谱（HPLC）。有关一系列代表性化合物后续纯化过程的实例，可参见其他文献8。
本方案在本实验室中已常规使用，并已证明具有实用价值。然而，该表达平台仍有较大的进一步优化空间。本实验室目前正在持续研究如何通过进一步的途径工程改造以及对蛋白质表达水平的差异性调控，在缓解对宿主细胞毒性的前提下，进一步提高三萜类化合物的产量。此外，还可探索对细胞内运输系统的调控20,21，以及将酶定向至不同细胞区室22,23的策略，这些途径有望提升多步氧化反应的效率。也可进一步探究修饰关键细胞器基础形态的潜在优势。例如，已有研究发现，过表达拟南芥（Arabidopsis thaliana）HMGR 的膜结构域可诱导植物内质网发生肥大24，而内质网是 CYP450 酶活性的关键场所。本方案非常适合用于制备毫克至克级规模的三萜类产物，可在科研环境中用于获取下游研究所需的化合物（例如，系统性地探索构效关系，以及对具有临床研究价值的先导化合物进行药效学和药代动力学的初步研究）。此外，该平台可通过增加所用植株数量实现线性且可靠的放大，农杆菌浸润介导的瞬时表达在工业规模上生产药用蛋白的可行性已有报道14，因此该平台具备用于高价值三萜类化合物商业化生产的潜力。或者，也可设想构建稳定转化的植株，使其携带最终确定的多基因生物合成通路，从而实现转基因N. benthamiana品系的大规模栽培和持续“种植”，以生产不同具有商业价值的化合物。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了诺维奇研究园研究生奖学金（JR）、工程与物理科学研究理事会/生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC）联合资助的OpenPlant合成生物学研究中心项目（BB/L014130/1）（M.J.S.、A.O.）；约翰·英纳斯中心知识交流与商业化项目（BB/KEC1740/1）（B.B.）；以及BBSRC研究所战略项目资助“自然分子”（BB/P012523/1）和约翰·英纳斯基金会（A.O.）的支持。我们感谢George Lomonossoff提供pEAQ载体，以及Andrew Davis提供摄影支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| GC-MS 仪器 | 任意 | n/a | |
| 适用于 PCR 反应的热循环仪 | 任意 | n/a | |
| 凝胶电泳装置 | 任意 | n/a | |
| 可调式空气置换移液器（规格：1000 µL、200 µL、100 µL、20 µL、10 µL 和 2 µL） | 任意 | n/a | |
| 宽口液氮运输罐（规格：2 L） | 任意 | n/a | |
| 台式微量离心机（容量：24 × 1.5/2 mL，最高转速：=/> 15000 rpm） | 任意 | n/a | |
| 台式离心机（容量：20 × 50 mL，最高转速：=/> 4000 rpm） | 任意 | n/a | |
| 大型落地式离心机（容量：4 × 1 L，最高转速：=/> 4000 rpm） | 任意 | n/a | |
| 立式培养箱 | 任意 | n/a | |
| 摇床培养箱（烧瓶夹规格：10 mL、50 mL、2 L） | 任意 | n/a | |
| 离心瓶（1 L） | 任意 | n/a | |
| 真空渗透装置 | 定制 | n/a | |
| 9 × 9 cm 植物花盆 | 任意 | n/a | |
| 冷冻干燥装置（冷凝器容量 ≥> 8 升） | 任意 | n/a | |
| Buchi SpeedExtractor 914 配 120 mL 提取池（PSE 仪器） | Buchi | SpeedExtractor E-914 | |
| 旋转蒸发仪 | 任意 | n/a | |
| 蒸发瓶（规格：100 mL、500 mL、1 L、2 L） | 任意 | n/a | |
| Duran 瓶（规格：1 L、10 L） | 任意 | n/a | |
| 锥形瓶（规格：100 mL、2 L） | 任意 | n/a | |
| 刮勺（多种规格） | 任意 | n/a | |
| 分析天平（五位数） | 任意 | n/a | |
| 天平（两位数） | 任意 | n/a | |
| 量筒（10 mL、100 mL、1 L） | 任意 | n/a | |
| –80 °C 超低温冰箱 | 任意 | n/a | |
| Biotage Isolera 仪器，配 250 mL 收集架和收集瓶（自动快速色谱仪） | Biotage | ISO-1EW | |
| 护目镜 | 任意 | n/a | |
| 实验服 | 任意 | n/a | |
| 高压灭菌器 | 任意 | n/a | |
| 耗材 | |||
| 移液器吸头（规格：1000 µL、200 µL、100 µL、20 µL、10 µL 和 2 µL） | 任意 | n/a | |
| 微量离心管（规格：2 mL） | 任意 | n/a | |
| 离心管（规格：15 mL、50 mL） | 任意 | n/a | |
| 一次性转移吸管（规格：2 mL） | 任意 | n/a | |
| 培养皿（规格：100 mL） | 任意 | n/a | |
| Biotage® SNAP KP-SIL 100 g 快速色谱柱 | Biotage | FSK0-1107-0100 | |
| HPLC 小瓶（1 mL）、内插管和瓶盖 | 任意 | n/a | |
| 一次性紫色丁腈手套 | 任意 | n/a | |
| E-914 顶部滤膜，纤维素材质 | Buchi | 51249 | |
| E-916 / 914 底部滤膜，玻璃纤维材质 | Buchi | 11055932 | |
| 试剂 | |||
| 石英砂，0.3 – 0.9 mm | Buchi | 37689 | |
| Celite 545（硅藻土） | Simga-Alrich | 22140-1KG-F | |
| 硅胶 60（0.040 – 0.0063 mm） | Merck | 1.09385.5000 | |
| 2-(N-吗啉代)乙磺酸 | Melford | B2002 | |
| MgCl2 | Simga-Alrich | 208337-100G | |
| KOH | Simga-Alrich | 60377-1KG | |
| 3’5’-二甲氧基-4’-乙酰苯（乙酰丁香酮） | Simga-Alrich | D134406-1G | |
| 利福平 | Alfa Aesar | J60836 | |
| 硫酸卡那霉素 | Gibco | 11815-032 | |
| 链霉素 | Simga-Alrich | S6501-100G | |
| 庆大霉素 | MP biomedicals | 190057 | |
| LE 级琼脂糖凝胶 | Melford | MB1203 | |
| LB 肉汤培养基 | Simga-Alrich | L3522-250G | |
| 琼脂 | Simga-Alrich | A5306-250G | |
| NaCl | Simga-Alrich | S5886-500G | |
| KCl | Simga-Alrich | P9541-500G | |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Alrich | M2773-500G | |
| 葡萄糖 | Sigma-Alrich | G7021-100G | |
| Ambersep® 900 氢氧型（碱性离子交换树脂） | Sigma-Alrich | 06476-1KG | |
| 正己烷 | Fisher | H/0406/PB17 | |
| 乙酸乙酯 | Fisher | E/0900/PB17 | |
| 二氯甲烷 | Fisher | D/1852/PB17 | |
| 甲醇 | Fisher | M/4056/PB17 | |
| 溴化乙锭 | Sigma-Alrich | E7637-1G | |
| 乙醇 | VWR | 20821-330 | |
| Milli-Q 水 | 任意 | n/a | |
| Levington F1 培养土 | 任意 | n/a | |
| Levington F2 培养土 | 任意 | n/a | |
| QIAprep Spin Miniprep 试剂盒（质粒纯化试剂盒） | Qiagen | 27104 | |
| NEB 5-alpha 感受态大肠杆菌 | 供应商 New England Biolabs Ltd | C2987I | |
| pEAQ-HT-DEST1 载体 | Lomonossoff 实验室 John Innes 中心 | n/a | |
| pDONR207 | Thermo-Fisher | pDONR207 | |
| 农杆菌 LBA4404 | Thermo-Fisher | 18313015 | |
| GATEWAY LR CLONASE(tm) II 酶混合物（位点特异性重组克隆试剂盒） | Thermo-Fisher | 11791020 | |
| GATEWAY BP CLONASE (tm) II 酶混合物（位点特异性重组克隆试剂盒） | Thermo-Fisher | 11789020 | |
| GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX | Promega UK Ltd | M7822 | |
| PHUSION 高保真 DNA 聚合酶 | New England Biolabs Ltd | M0530S | |
| dNTP 混合液 100 mm | Thermo-Fisher | 10297018 | |
| RNEASY 植物小量提取试剂盒 | Qiagen Ltd | 74904 | |
| RQ1 RNase-Free DNase | Promega UK Ltd | M6101 | |
| Invitrogen SuperScript III 第一链合成系统 | Fisher | 10308632 | |
| 胰蛋白胨 | Sigma-Alrich | T7293-250G | |
| 烟草本塞姆氏（Nicotiana benthamiana）种子 | 任何信誉良好的供应商 | n/a |
参考文献
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