方法文章

蜜蜂脑匀浆中磷脂酶C活性的检测

DOI：

10.3791/58173

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2018年9月14日

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1Bioproduction Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 2Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, The University of Tokyo

本文内容

摘要

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为了检测药理学试剂对蜜蜂大脑不同区域磷脂酶C（PLC）的抑制作用，我们提供了一种生物化学检测方法，用于测定这些区域中的PLC活性。该检测方法可用于比较不同组织之间的PLC活性，也可用于比较表现出不同行为的蜜蜂之间的PLC活性。

摘要

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蜜蜂是研究复杂行为和高级脑功能（如学习、记忆和劳动分工）的模式生物。蕈形体（MB）被认为是蜜蜂复杂行为的神经基础，是高级脑中枢。尽管先前的研究已鉴定出在MB与其他脑区差异表达的基因和蛋白质，但这些蛋白质在各脑区中的具体活性尚不完全清楚。为了揭示这些蛋白质在脑内的功能，药理学分析是一种可行的方法，但首先必须确认药理学干预确实能够改变这些脑区中蛋白质的活性。

我们先前发现，与大脑其他区域相比，蘑菇体（MBs）中编码磷脂酶C（PLC）的基因表达水平更高，并通过药理学方法评估了PLC在蜜蜂行为中的作用。在该研究中，我们生化测试了两种药理学试剂，证实它们能够降低蘑菇体及其他脑区的PLC活性。本文详细描述了如何检测蜜蜂脑匀浆中的PLC活性。在此检测体系中，来自不同脑区的匀浆与一种合成的荧光底物发生反应，通过定量并比较各脑区因PLC活性产生的荧光强度来评估活性差异。我们还介绍了利用该体系评估特定药物对PLC活性抑制作用的方法。尽管该体系可能受到内源性荧光物质和/或检测组分及组织吸光度的干扰，但与需要使用放射性标记底物的传统方法相比，该方法在检测PLC活性时更安全、更简便。其操作步骤简单，使我们能够研究参与不同社会性任务的蜜蜂脑组织及其他组织中的PLC活性。

引言

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欧洲蜜蜂（Apis mellifera L.）是一种真社会性昆虫，雌性蜜蜂表现出等级依赖性的生殖特征以及 年龄依赖性的劳动分工。例如，在被称为“工蜂”的不育等级中，较年轻的个体负责饲喂幼虫，而较年长的个体则在蜂巢外 采集花蜜和花粉1。学习与记忆能力对蜜蜂的生存至关重要，因为采集蜂必须在食物源与蜂巢之间反复往返，并通过舞蹈通信将优质食物源的位置信息传递给同巢伙伴1。先前的研究表明，昆虫的高级脑中枢——蘑菇体（MB），参与了蜜蜂的学习与记忆能力2,3,4。已在蜜蜂大脑的不同区域鉴定出差异表达的基因和蛋白质5,6,7,8,9,10,11，提示它们可能与各脑区的独....

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方案

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1. 采集觅食蜜蜂

  1. 从当地供应商处购买蜜蜂蜂群。
  2. 使用昆虫网捕捉后腿携带花粉团并返回蜂巢的采集蜂。将蜜蜂转移至标准的50 mL塑料锥形管中，并盖紧管盖（图1）。将管子置于冰上以麻醉蜜蜂。
    注意：应穿戴指定的养蜂防护服，避免被蜜蜂蜇伤。根据实验需要，也可采集哺育蜂。为捕捉哺育蜂，需观察蜜蜂在蜂蜡巢脾上的行为，用镊子夹住正在将头部伸入幼虫巢房中饲喂幼虫的哺育蜂的翅膀或胸部，将其捕获。随后，将蜜蜂放入50 mL塑料管中，盖紧管盖，并如步骤1.2所述置于冰上。
  3. 随机捕捉12只采集蜂。
    注意：本方案每批次使用2只蜜蜂，共获得六个批次。可将多只蜜蜂放入同一管中，单管中蜜蜂数量不限，因为在后续步骤中（见步骤3.1.1）每个批次的蜜蜂将被合并处理。夏季需保持管子低温，因管内温度过高会损伤蜜蜂。

2. 蜜蜂大脑的解剖

  1. 在实验室中，将50 mL离心管置于冰上至少30分钟6，以麻醉蜜蜂。
  2. 准备解剖台时，将一块牙科蜡对折（最终尺寸约为3.5 × 7.5 cm），并压入塑料培养皿（60 × 15 mm）中。
    注意：折叠后的蜡可牢固固定昆虫针。
  3. 在双目显微镜下，用镊子将蜜蜂头部与身体分离，并通过将昆虫针插入每根触角基....

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结果

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脑组织匀浆中的蛋白质浓度：
我们使用采集蜂制备匀浆。原始匀浆中计算得到的蛋白质浓度如图3所示。原始匀浆中蛋白质浓度大约为：蘑菇体（MBs）中1.5 mg/mL，其他脑区中2.3 mg/mL。每批次使用两只蜜蜂，共分析了六个批次。

脑组织匀浆中PLC活性的检测：
在预实验中，我们发现其他脑区的荧光强度高于蘑菇体（MBs）。因此，我们使用其他脑区的匀浆重复了初步实验，并确定了反应时间（即，30分钟）和蛋白量（即，1.3 µg）。在这些条件下反应的结果如图4A所示。含有组织匀浆和荧光底物的反应体系的荧光强度比仅含组织匀浆或仅含荧光底物的对照组高出>4.2倍，表明在反应体系中检测到了P.......

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讨论

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蛋白质活性的生化检测对于理解脑内分子信号传导至关重要，因为酶的活性会受到多种分子（如底物和抑制剂）的影响，因而可能随着动物行为的变化而改变。例如、学习与记忆）5在蜜蜂研究中，据免疫组织化学报道，环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A、环磷酸鸟苷依赖性蛋白激酶、蛋白激酶C、磷酸化CaMKII和腺苷酸环化酶在不同脑区呈差异表达5,10,29,30,31然而，不同脑区之间酶活性的差异仅有部分被报道6在此，我们描述了一种详细的方案，用于检测脑干（MBs）及其他脑区中磷脂酶C（PLC）的活性，并评估药理学试剂对PLC活性的抑制作用。

存在一些可能干扰荧光检测的因素。首先.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

图4B - 4D 经《Biology Open》许可，改编自 Suenami et al.24。作者感谢出版社授予使用许可。本研究由人类前沿科学计划（RGY0077/2016）资助，受资助者为 Shota Suenami 和 Ryo Miyazaki。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒ThermoFisher Scientific23227用于测定蛋白质浓度的试剂盒
Pierce 牛血清白蛋白标准品安瓿瓶 2mg/mLThermoFisher Scientific23209BCA 检测中使用标准样品
石蜡GC13B1X00155000141用作解剖平台的牙科蜡
昆虫针ShigaNo. 0不锈钢实心头针
PLCglowKXT BioKCH-0001PLC 的荧光原性底物
384 孔微孔板Corning4511低体积、圆底、黑色微孔板
Gemini EM 微孔板读板仪Molecular Devices
艾迪菲松Santa Cruz Biotechnologysc-201021广谱 PLC 抑制剂
硫酸新霉素Santa Cruz Biotechnologysc-3573广谱 PLC 抑制剂

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Winston, M. L. The Biology of the Honey Bee. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1991).
  2. Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in Kenyon cells of the honeybee mushroom body. Frontiers in Systems Neuroscience. 2, 3(2008).
  3. ....

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PLC

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