蜜蜂脑匀浆中磷脂酶C活性的检测

摘要

为了检测药理学试剂对蜜蜂大脑不同区域磷脂酶C（PLC）的抑制作用，我们提供了一种生物化学检测方法，用于测定这些区域中的PLC活性。该检测方法可用于比较不同组织之间的PLC活性，也可用于比较表现出不同行为的蜜蜂之间的PLC活性。

摘要

蜜蜂是研究复杂行为和高级脑功能（如学习、记忆和劳动分工）的模式生物。蕈形体（MB）被认为是蜜蜂复杂行为的神经基础，是高级脑中枢。尽管先前的研究已鉴定出在MB与其他脑区差异表达的基因和蛋白质，但这些蛋白质在各脑区中的具体活性尚不完全清楚。为了揭示这些蛋白质在脑内的功能，药理学分析是一种可行的方法，但首先必须确认药理学干预确实能够改变这些脑区中蛋白质的活性。

我们先前发现，与大脑其他区域相比，蘑菇体（MBs）中编码磷脂酶C（PLC）的基因表达水平更高，并通过药理学方法评估了PLC在蜜蜂行为中的作用。在该研究中，我们生化测试了两种药理学试剂，证实它们能够降低蘑菇体及其他脑区的PLC活性。本文详细描述了如何检测蜜蜂脑匀浆中的PLC活性。在此检测体系中，来自不同脑区的匀浆与一种合成的荧光底物发生反应，通过定量并比较各脑区因PLC活性产生的荧光强度来评估活性差异。我们还介绍了利用该体系评估特定药物对PLC活性抑制作用的方法。尽管该体系可能受到内源性荧光物质和/或检测组分及组织吸光度的干扰，但与需要使用放射性标记底物的传统方法相比，该方法在检测PLC活性时更安全、更简便。其操作步骤简单，使我们能够研究参与不同社会性任务的蜜蜂脑组织及其他组织中的PLC活性。

引言

欧洲蜜蜂（Apis mellifera L.）是一种真社会性昆虫，雌性蜜蜂表现出等级依赖性的生殖特征以及 年龄依赖性的劳动分工。例如，在被称为“工蜂”的不育等级中，较年轻的个体负责饲喂幼虫，而较年长的个体则在蜂巢外 采集花蜜和花粉¹。学习与记忆能力对蜜蜂的生存至关重要，因为采集蜂必须在食物源与蜂巢之间反复往返，并通过舞蹈通信将优质食物源的位置信息传递给同巢伙伴¹。先前的研究表明，昆虫的高级脑中枢——蘑菇体（MB），参与了蜜蜂的学习与记忆能力^2,3,4。已在蜜蜂大脑的不同区域鉴定出差异表达的基因和蛋白质^{5,6,7,8,9,10,11}，提示它们可能与各脑区的独特功能相关。尽管通过药理学手段抑制或激活特定蛋白是揭示该蛋白在蜜蜂行为中功能的常用方法^12,13,14，但目前尚不清楚所有药物是否在蜜蜂大脑的不同区域均具有功能性效应。对这些药物功能的验证将有助于加强行为药理学研究中的结论可靠性。

本文聚焦于磷脂酶C（PLC），该酶与小鼠认知功能相关^15,16,17,18。PLC通过将磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP₂）降解为肌醇1,4,5-三磷酸（IP₃）和二酰甘油（DAG），从而触发钙信号通路^19,20,21。IP₃可打开内质网（ER）上的IP₃受体，导致钙离子从内质网中释放。释放的钙离子在DAG存在的情况下，可激活钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）（与钙调蛋白共同作用）以及蛋白激酶C（PKC）。这两种蛋白激酶均参与学习与记忆过程^22,23，这与PLC在该过程中的作用相一致。根据结构不同，PLC可分为多种亚型，包括PLCβ、PLCγ和PLCε²⁰。每种PLC亚型在不同条件下被激活²⁰，且编码这些亚型的基因在不同组织中呈现差异性表达。我们先前已证实，蜜蜂的蘑菇体（MBs）中编码PLCβ和PLCε亚型的基因表达水平显著高于其他脑区²⁴，且两种广谱PLC抑制剂（edelfosine和新霉素硫酸盐[neomycin]）可降低蜜蜂不同脑区的PLC活性，并确实影响蜜蜂的学习与记忆能力²⁴。

传统上，PLC 的酶活性检测依赖于使用放射性标记的 PIP₂²⁵，该方法需要专门的培训、设备和设施。近年来，一种合成的荧光底物已被建立用于检测 PLC²⁶，使得在常规实验室中便捷地评估 PLC 活性成为可能。本文中，我们提供了一项详细方案，利用该荧光底物检测蜜蜂不同脑区的 PLC 活性，并进一步测试 edelfosine 和新霉素对这些组织中 PLC 活性的抑制作用。由于该方案仅需基本的操作步骤，因此也可适用于研究执行不同社会性任务的蜜蜂其他组织或脑区中的 PLC 活性。

方案

1. 采集觅食蜜蜂

1. 从当地供应商处购买蜜蜂蜂群。
2. 使用昆虫网捕捉后腿携带花粉团并返回蜂巢的采集蜂。将蜜蜂转移至标准的50 mL塑料锥形管中，并盖紧管盖（图1）。将管子置于冰上以麻醉蜜蜂。
   注意：应穿戴指定的养蜂防护服，避免被蜜蜂蜇伤。根据实验需要，也可采集哺育蜂。为捕捉哺育蜂，需观察蜜蜂在蜂蜡巢脾上的行为，用镊子夹住正在将头部伸入幼虫巢房中饲喂幼虫的哺育蜂的翅膀或胸部，将其捕获。随后，将蜜蜂放入50 mL塑料管中，盖紧管盖，并如步骤1.2所述置于冰上。
3. 随机捕捉12只采集蜂。
   注意：本方案每批次使用2只蜜蜂，共获得六个批次。可将多只蜜蜂放入同一管中，单管中蜜蜂数量不限，因为在后续步骤中（见步骤3.1.1）每个批次的蜜蜂将被合并处理。夏季需保持管子低温，因管内温度过高会损伤蜜蜂。

2. 蜜蜂大脑的解剖

1. 在实验室中，将50 mL离心管置于冰上至少30分钟⁶，以麻醉蜜蜂。
2. 准备解剖台时，将一块牙科蜡对折（最终尺寸约为3.5 × 7.5 cm），并压入塑料培养皿（60 × 15 mm）中。
   注意：折叠后的蜡可牢固固定昆虫针。
3. 在双目显微镜下，用镊子将蜜蜂头部与身体分离，并通过将昆虫针插入每根触角基部，将头部前端朝上固定在牙科蜡上（图2A）。
   注意：使用前需用乙醇或无菌水清洗镊子。
4. 倒入足够量的生理盐水（0.13 mol/L NaCl、5 mmol/L KCl 和 1 mmol/L CaCl₂-2H₂O），使液体覆盖头部。若头部在溶液中漂浮，可用昆虫针再次刺穿固定。必要时可使用冰冻的生理盐水。
   注意：但本方案在不使用冷生理盐水的情况下亦可成功。
5. 使用镊子去除触角（图2B）。
6. 使用解剖刀在触角基部附近做水平切口，并沿复眼边缘做纵向切口；然后在头部顶端做水平切口。去除头壳以在脑部上方打开一个窗口（图2C）。
   注意：必要时，使用前需用乙醇或无菌水清洗解剖刀。
7. 用镊子去除单眼的视网膜以及脑部前表面的气管（图2D）。
8. 使用解剖刀将复眼边缘的切口向背侧和腹侧扩展（图2E）。接着，将镊子直接插入复眼表皮下方，去除复眼表皮与视网膜之间的结缔组织（图2F）。
9. 弃去复眼的表皮。用镊子夹住复眼视网膜的背侧尖端，并将镊子向腹侧移动，小心剥离视网膜（图2G）。
10. 用镊子小心去除脑部前表面残留的气管（图2H）。
11. 用镊子切断脑组织与周围组织之间的结缔组织，将脑从头壳中解剖出来（图2H）。
12. 用镊子剥离脑部后表面的气管（图2I）。
13. 使用解剖刀，在垂直叶（属于蘑菇体的一部分）附近切断蘑菇体（MBs）与其他脑区之间的连接（图2J）。
14. 将解剖得到的蘑菇体及剩余脑组织放入1.5 mL离心管中，并用干冰或液氮迅速冷冻（图2K）。将冷冻组织储存于-80 °C直至使用。
    注意：操作液氮时应佩戴专用手套并确保通风，以防冻伤和窒息。干冰也需戴手套小心操作。本步骤可作为暂停点。为避免蛋白质降解，脑组织的解剖和储存应逐只蜜蜂进行。

3. 脑组织匀浆的制备

1. 向冷冻脑组织中加入10 µL匀浆缓冲液（含50 mmol/L HEPES-KOH（pH 7.2）、70 mmol/L KCl和1.0 mmol/L CaCl₂），在1.5 mL离心管中用塑料研磨杵手动施加压力进行组织匀浆。至少研磨200次。
   ​注意：第3节中所述操作需在冰上进行。使用与离心管匹配的研磨杵充分捣碎组织，因组织易在匀浆缓冲液中漂浮。
   1. 将匀浆后的组织溶液转移至同一批次的下一份组织中，并以相同方式匀浆该组织。
      注意：在此步骤中，同一批次的蜜蜂组织被合并。本方案使用六个批次。
2. 加入30 µL匀浆缓冲液。
3. 将匀浆后的组织样品在约900 × g²⁷、4 °C条件下离心10分钟。
4. 将上清液转移至新的1.5 mL离心管中，在约9,500 × g²⁷、4 °C条件下再次离心20分钟。
5. 将上清液置于新的1.5 mL离心管中。将匀浆液于-20 °C保存，直至使用。
   ​注意：本方案可在此处暂停。
6. 使用二辛可宁酸（BCA）法测定蛋白浓度。
   1. 取2.5 µL匀浆液加入17.5 µL无菌水中稀释（即八倍稀释），并将全部稀释后的匀浆液用于后续测定。
      注意：由于匀浆液黏度较高，使用微量移液器取样时必须小心操作。
   2. 使用0、0.1、0.2、0.4、1.0和2.0 mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）各20 µL作为标准品进行BCA测定。
      注意：根据匀浆液和标准品的体积，可按需调整BCA测定的量程。本方案可在此处暂停。

4. 脑匀浆中的PLC反应

1. 制备荧光底物WH-15的储备液²⁶ 溶于无菌水，配制成50 µmol/L浓度，并于-80 °C保存。
   注意：用铝箔覆盖含有底物的溶液，以防止褪色。
2. 在所需体积中配制反应预混液，使10 µL反应体系中的终浓度为：50 mmol/L HEPES-KOH（pH 7.2）、70 mmol/L KCl、1.0 mmol/L CaCl₂₂，2.0 mmol/L 二硫苏糖醇，50 mg/L BSA，以及 12.5 µmol/L WH-15。
3. 如有需要，用匀浆缓冲液稀释匀浆液。
4. 将含有1.3 µg蛋白质的反应预混液与匀浆液在聚合酶链式反应（PCR）管中混合，使反应体系终体积为10 µL。
   1. 为统计分析准备两种对照混合物：加入匀浆液但不加入WH-15 混合物（对照混合物1），以及 反之亦然 （对照混合物2）
      注意：在冰上配制反应混合物和对照混合物，以防止蛋白质降解和磷脂酶C（PLC）发生反应。对照混合物1和2分别用于检测匀浆液和游离底物的荧光。
5. 用移液枪冲洗离心管，并将其放入热循环仪中，在25 °C下孵育30分钟。
6. 通过加入2 µL 25 mmol/L乙二醇双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸终止反应。
   注意：适当的蛋白用量和反应时间因实验而异。因此，为了优化反应条件，可能需要在预实验中重复步骤4.1至5.3所述操作，通过调整蛋白用量和孵育时间，直至荧光信号呈线性增加。作为参考，当 来自其他脑区的匀浆在反应中通常于30分钟内与1.3 µg或更少的蛋白质呈线性关系，但当蛋白质含量达到至少2.7 µg或孵育时间延长至90分钟及以上时，线性关系会下降。

5. 检测由 PLC 活性产生的荧光结果

1. 将反应混合物及对照混合物在约 310 × g²⁸ 条件下离心 5 分钟，取 10 µL 上清液转移至适用于荧光检测的 384 孔微孔板的不同孔中。
   注意：为防止荧光淬灭及灰尘污染，应用封口膜覆盖微孔板。
2. 使用微孔板专用离心机对微孔板进行短暂离心。
3. 将微孔板放入微孔板读数仪中，每个样品进行三次技术重复检测荧光信号。
   注意：激发波长和发射波长分别为 344 nm 和 530 nm。如仪器支持（取决于微孔板读数仪型号），可在每次检测前将样品混合 5 秒。本实验方案可在此处暂停。

6. 药理学试剂抑制作用的检测

1. 配制适当浓度的爱德福司和新霉素储备液，并储存备用：爱德福司浓度为 5.0 mmol/L，储存于 -20 °C；新霉素浓度为 550 mmol/L，储存于 4 °C。
2. 按照步骤 4.2 所述配制反应预混液时，将抑制剂加入预混液中，使其达到适当的终浓度：爱德福司为 1.0 mmol/L，新霉素为 0.55 mmol/L。
3. 将匀浆液加入反应预混液及相应的对照混合液中，操作同步骤 4.4。
   1. 准备三种类型的对照混合液：在对照混合液 1 中加入匀浆液和抑制剂，但不加底物；在对照混合液 2 中加入底物和抑制剂，但不加匀浆液；在对照混合液 3 中仅加入抑制剂，不加匀浆液和底物。
4. 按照步骤 4.5 至 5.3 所述进行 PLC 反应及荧光检测。

7. 统计分析

1. 使用第4节所述混合物检测PLC活性时，通过减去匀浆液或游离底物所发射的荧光，计算PLC与底物反应产生的荧光值。
   
   Fl（PLC 活性）= Fl（反应混合物）- {Fl（对照 1）+ Fl（对照 2）}
   ​
   注意：Fl（PLC 活性）、Fl（反应混合物）、Fl（对照 1）和 Fl（对照 2）表示 真正有效的 分别来自PLC活性的荧光、反应混合物中检测到的荧光，以及对照混合物1和2中的荧光。
   1. 在按照步骤4.1–5.3测量各混合物的荧光值后，根据步骤7.1中的公式计算Fl（PLC活性），然后计算每份匀浆样本的技术重复三次测定的Fl（PLC活性）平均值。
   2. 使用步骤 7.1.1 中获得的技术重复三份样本的平均 Fl（PLC 活性）值，重新计算 MBs 及其他脑区生物学重复样本的平均 Fl（PLC 活性）值，并比较各脑组织之间的数值。
2. 对于使用第6节所述混合物检测抑制剂存在下的PLC活性，按如下方法计算来自匀浆液、底物和抑制剂反应所产生的荧光。
   
   Fl（加入抑制剂后的PLC活性）= Fl（反应混合物）- {Fl（对照1）+ Fl（对照2）} + Fl（对照3）
   
   ​注意：此处 Fl（加入抑制剂时的 PLC 活性）为 真正 抑制剂存在下由PLC活性产生的荧光。Fl（反应混合物）、Fl（对照1）、Fl（对照2）和Fl（对照3）分别为在反应混合物、对照混合物1、对照混合物2和对照混合物3中检测到的荧光信号。
   1. 在按照步骤6.1–6.4测量各混合物的荧光值后，根据步骤7.2中的公式计算Fl（含抑制剂时的PLC活性）。然后，计算每种匀浆液的技术重复三次的Fl（含抑制剂时的PLC活性）的平均值。
   2. 根据步骤7.2.1中计算出的平均值，计算从每种脑组织获得的生物学重复样本的平均Fl值（含抑制剂的PLC活性）。比较每种脑组织中步骤7.1.2获得的Fl值（含抑制剂的PLC活性）与Fl值（PLC活性）。

结果

脑组织匀浆中的蛋白质浓度：
我们使用采集蜂制备匀浆。原始匀浆中计算得到的蛋白质浓度如图3所示。原始匀浆中蛋白质浓度大约为：蘑菇体（MBs）中1.5 mg/mL，其他脑区中2.3 mg/mL。每批次使用两只蜜蜂，共分析了六个批次。

脑组织匀浆中PLC活性的检测：
在预实验中，我们发现其他脑区的荧光强度高于蘑菇体（MBs）。因此，我们使用其他脑区的匀浆重复了初步实验，并确定了反应时间（即，30分钟）和蛋白量（即，1.3 µg）。在这些条件下反应的结果如图4A所示。含有组织匀浆和荧光底物的反应体系的荧光强度比仅含组织匀浆或仅含荧光底物的对照组高出>4.2倍，表明在反应体系中检测到了P...

讨论

蛋白质活性的生化检测对于理解脑内分子信号传导至关重要，因为酶的活性会受到多种分子（如底物和抑制剂）的影响，因而可能随着动物行为的变化而改变。例如、学习与记忆）⁵在蜜蜂研究中，据免疫组织化学报道，环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A、环磷酸鸟苷依赖性蛋白激酶、蛋白激酶C、磷酸化CaMKII和腺苷酸环化酶在不同脑区呈差异表达^{5,10,29,30,31}然而，不同脑区之间酶活性的差异仅有部分被报道⁶在此，我们描述了一种详细的方案，用于检测脑干（MBs）及其他脑区中磷脂酶C（PLC）的活性，并评估药理学试剂对PLC活性的抑制作用。

存在一些可能干扰荧光检测的因素。首先...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	ThermoFisher Scientific	23227	用于测定蛋白质浓度的试剂盒
Pierce 牛血清白蛋白标准品安瓿瓶 2mg/mL	ThermoFisher Scientific	23209	BCA 检测中使用标准样品
石蜡	GC	13B1X00155000141	用作解剖平台的牙科蜡
昆虫针	Shiga	No. 0	不锈钢实心头针
PLCglow	KXT Bio	KCH-0001	PLC 的荧光原性底物
384 孔微孔板	Corning	4511	低体积、圆底、黑色微孔板
Gemini EM 微孔板读板仪	Molecular Devices
艾迪菲松	Santa Cruz Biotechnology	sc-201021	广谱 PLC 抑制剂
硫酸新霉素	Santa Cruz Biotechnology	sc-3573	广谱 PLC 抑制剂