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一个 体外 光动力疗法的应用方法

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DOI：

10.3791/58190

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2018年8月17日

 , 
1Department of Dermatology, University of California, Davis, 2Dermatology Service, Sacramento VA Medical Center, 3Department of Dermatology, State University of New York, Downstate Medical Center

本文内容

摘要

光动力疗法（PDT）是一种医疗程序，包括外源性施加的光敏剂（PS）孵育，随后通过可见光照射激活以诱导细胞凋亡。本文介绍一种体外（in vitro）PDT 实验方案，旨在模拟光动力疗法，可用于研究光敏剂孵育条件和光照处理参数的差异。

摘要

光动力疗法（PDT）是一种医疗程序，其过程包括外源性光敏剂（PS）的孵育，随后通过可见光照射激活，从而诱导细胞凋亡。美国食品药品监督管理局（FDA）已批准PDT用于治疗日光性角化病，临床指南亦推荐将PDT用于治疗某些非黑色素瘤皮肤癌和寻常痤疮。PDT作为一种治疗方式具有诸多优势，包括成本低、非侵入性，且不良反应和瘢痕形成极少。在PDT的第一步中，应用光敏剂并使其在细胞内蓄积；随后的光照可诱导活性氧物种的生成，最终可能导致细胞凋亡、细胞膜破坏、线粒体损伤、免疫调节、角质形成细胞增殖以及胶原更新。本文介绍了一种 体外 研究光动力疗法（PDT）在贴壁细胞系中作用的方法。该治疗方案旨在模拟光动力疗法，可调整用于研究不同细胞系、光敏剂、孵育温度或光激活波长条件下PDT的应用。鳞状细胞癌细胞分别与0、0.5、1.0和2 mM的5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）孵育30分钟，并用417 nm蓝光照射1,000秒进行光激活。主要观察指标为细胞凋亡与坏死，通过膜联蛋白V（annexin-V）和7-氨基放线菌素D（7-aminoactinomycin D）流式细胞术检测。结果显示，经30分钟5-ALA孵育后，细胞凋亡呈剂量依赖性增加。为确保实验间高度可重复性，在操作过程中需保持孵育条件和光照参数的一致性。 体外 光动力疗法实验。光动力疗法是一种有用的临床操作 体外 研究可能促进新型光敏剂的开发、治疗方案的优化以及光动力疗法新适应症的拓展。

引言

光动力疗法（PDT）是一种医疗程序，通过外源性施用光敏剂（PS）并孵育后，再以可见光照射激活，从而诱导细胞凋亡。美国食品药品监督管理局（FDA）已批准PDT用于治疗日光性角化病（AK），临床指南推荐PDT作为某些非黑色素瘤皮肤癌和寻常痤疮的治疗手段1,2。PDT新兴的非皮肤科应用包括治疗胃肠道、前列腺及妇科癌症3。PDT作为一种治疗方式具有优势，因其成本低、无创，且不良事件和瘢痕形成极少2。

在光动力疗法（PDT）的第一步中，应用光敏剂（PS）并使其在细胞内积累2。在美国，外用5-氨基酮戊酸（5-ALA）常用于治疗光化性角化病（AKs）。在孵育阶段，细胞通过血红素生物合成途径将5-ALA转化为原卟啉IX（PP-IX）3。癌细胞和癌前细胞中的亚铁螯合酶活性降低，而该酶通常负责将原卟啉IX（PP-IX）转化为最终产物血红素。因此，与正常细胞相比，癌细胞中会积累更多的PP-IX4,5。这种在癌细胞和癌前细胞中相对于周围组织选择性积累PP-IX的现象，使得PDT能够实现靶向治疗，并且不良反应最小。当氧气接受来自激发态PP-IX的电子时，光照会引发活性氧（ROS）的生成。PP-IX在紫外光谱区具有最大吸收峰，在可见光谱范围内（包括蓝光和红光）也有较小的吸收峰2。ROS的形成最终可能导致细胞凋亡、细胞膜破坏、线粒体损伤、免疫调节、角质形成细胞增殖以及胶原更新6,7,8,9,10。

光动力疗法（PDT）于20世纪70年代开发，是一种不断发展的治疗方式3。美国食品药品监督管理局（FDA）批准的光动力疗法治疗光化性角化病（AKs）的方案建议5-氨基酮戊酸（5-ALA）皮肤孵育时间为14–18小时，但在临床实践中通常采用1至2小时的孵育时间2。体外实验中，我们已证明与未处理的成纤维细胞相比，短至15分钟的5-ALA孵育即可增加成纤维细胞的凋亡11,12。此外，新型基于氯素、酞菁及纳米颗粒的光敏剂（PSs）正在被研究以提高PDT的疗效3。本文中，我们介绍一种用于研究贴壁生长的鳞状细胞癌细胞光动力疗法的体外方法。在本方案中，SCC-13细胞分别与0、0.5、1.0和2 mM的5-ALA在30分钟内孵育，并用417 nm蓝光照射1,000秒进行光激活。主要观察指标为细胞凋亡与坏死，通过膜联蛋白V（annexin-V）和7-氨基放线菌素D（7-AAD）染色结合流式细胞术进行检测。该治疗方案旨在模拟光动力疗法，可根据需要调整用于研究其他细胞系、光敏剂、孵育温度或光激活波长条件下的PDT效应。实验中可能需要设置额外的对照组，包括未染色组、单荧光染料染色组、阴性对照组和阳性对照组，以满足流式细胞术分析需求。有关凋亡/坏死流式细胞术的理论、方案、实验设计及设门策略的全面综述可参见其他文献13。

方案

1. 细胞的制备

  1. 在生物安全柜中使用无菌技术，将20,000个细胞接种于2 mL培养基中，加入6孔板的每个孔内。
  2. 将6孔板置于加湿培养箱（37 °C，5% CO2）中培养24小时，使细胞贴壁。

2. 细胞治疗用光敏剂的制备

  1. 在培养基中配制 0.5、1 和 2 mM 的 5-ALA 溶液。如果培养基中含有胎牛血清（FBS），则在含 0.1% FBS 的培养基中配制 5-ALA 溶液并用于细胞处理，以进行孵育11,12。本实验中，SCC-13 细胞无需 FBS，因此将 5-ALA 直接加入添加了牛垂体提取物和表皮生长因子的角质形成细胞无血清培养基中。
  2. 吸除培养基，并用至少 2 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
  3. 吸除 PBS，向不同的培养皿或孔中分别加入 2 mL 的 0、0.5、1 或 2 mM 5-ALA 溶液。
  4. 将细胞置于 36 至 37 °C 的加热板上，用 0、0.5、1 或 2 mM 5-ALA 孵育 30 分钟。孵育期间使用铝箔包裹以避免光照。
  5. 吸除 0、0.5、1 和 2 mM 的 5-ALA 溶液，并用 2 mL PBS 洗涤细胞。
  6. 吸除 PBS，每孔加入 2 mL 培养基，用于蓝光照射。

3. 蓝光光疗

  1. 照射细胞前，打开蓝光设备（例如，发光二极管、荧光灯或卤素灯），并运行一个循环（1,000 秒）以预热设备。蓝光设备的输出波长应为 417 ± 5 nm。在处理前让设备运行一个循环，可确保光激活阶段中蓝光的波长和辐照度保持一致。
  2. 使用光度计测量细胞表面的辐照度。细胞表面的蓝光辐照度应为 10 mW/cm2。根据光源的强度，可能需要调整光源与细胞之间的距离，以达到 10 mW/cm2 的辐照度。
  3. 将 0、0.5、1 和 2 mM ALA 处理组置于蓝光光源下的黑色表面上。用蓝光照射细胞 1,000 秒（16 分 40 秒），总能量密度为 10 J/cm2。蓝光光激活完成后，细胞即可用于后续分析。

4. 收集与染色

  1. 根据制造商指南配制流式缓冲液（参见 材料表）。
  2. 吸去培养基，并用 2 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
  3. 加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，孵育约 3 至 5 分钟使细胞脱落。可在显微镜下观察以确认细胞是否已脱落。
  4. 加入含 10% 胎牛血清的 1 mL 培养基（或 PBS）以中和胰蛋白酶活性。
  5. 将细胞悬液收集至已标记的 5 mL 流式管中。
  6. 在离心机中以 201 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，勿扰动细胞沉淀。
  7. 向每个样品中加入 200 µL 含偶联 annexin-V 抗体的流式缓冲液（每 39 µL 流式缓冲液加 1 µL annexin-V）。
  8. 重悬细胞后置于孵箱（37 °C，5% CO2）中孵育 20 分钟，使 annexin-V 充分结合。
  9. 向每个样品中加入 3 µL 7-AAD，室温孵育 5 分钟。

5. 流式细胞术分析

  1. 遵循流式细胞仪制造商提供的设置指南（参见 材料表).
  2. 使用流式细胞术收集和分析样本。13
  3. 使用方差分析（ANOVA）对处理组和对照组进行统计学比较14. 采用Dunnett检验将处理组的均值与对照组的均值进行比较 事后检验 分析。

结果

SCC-13细胞经0、0.5、1和2 mM 5-ALA孵育30分钟后，接受1000秒蓝光照射，细胞凋亡呈剂量依赖性增加。在0、0.5、1和2 mM 5-ALA孵育30分钟并接受蓝光照射1000秒后，总凋亡率（均值±均值标准误差）分别为3.94 ± 0.34、7.90 ± 0.52、23.86 ± 0.52和38.33 ± 1.81（图1）。我们采用单因素方差分析（ANOVA）比较了0、0.5、1和2 mM 5-ALA孵育组之间凋亡细胞的平均百分比。与0 mM 5-ALA处理组相比，1和2 mM 5-ALA处理组的细胞凋亡显著增加。图2A展示了SCC-13细胞在0、0.5、1和2 mM 5-ALA孵育条件下前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）的代表性流式细胞术门控图。圆形门控圈定SCC-13细胞群体。本实验共收集7500个事件，SCC-13细胞群体门控捕获了至少90%的事件。图2B展示了以7-AAD为横轴、annexin-V为纵轴的代表性散点图。细胞群体被划分为四个象限（Q1至Q4），用于区分凋亡细胞。Q1（高annexin-V，低7-AAD）代表处于早期凋亡的细胞；Q2（高annexin-V，高7-AAD）代表处于晚期凋亡或坏死的细胞；Q3（低annexin-V，高7-AAD）代表处于坏死的细胞；Q4（低annexin-V，低7-AAD）代表未发生凋亡或坏死的细胞。为计算发生凋亡的细胞百分比，我们将Q1和Q2中的细胞百分比相加。5-ALA孵育时间长短、孵育温度或光激活照射剂量的不一致可能影响光动力疗法（PDT）的效果。图3展示了在不同孵育温度（i.e., 27、36或42 °C）下annexin-V与7-AAD流式细胞术图的代表性结果。结果显示凋亡率随温度升高而增加。

不同ALA浓度下凋亡细胞百分比的柱状图；统计学显著性已标出。
图1：5-ALA孵育三十分钟后细胞凋亡呈剂量依赖性增加。 在SCC-13细胞中，5-ALA于36 °C孵育三十分钟，随后接受1,000秒蓝光照射。各柱代表每组处理组与对照组中annexin-V阳性细胞的平均百分比。实验均设技术重复三次。统计学显著性通过ANOVA分析确定，*表示p <0.05。误差线表示均值±均值标准误。请点击此处查看该图的高清版本。

流式细胞术图谱；5-ALA浓度；细胞散射与凋亡分析；实验数据
图2：代表性流式细胞术图谱。 (A代表性前向散射 与 侧向散射流式细胞术图，横轴与纵轴单位为任意单位（AU），显示经 0、0.5、1 和 2 mM 5-ALA 孵育的细胞。本实验共收集 7500 个事件，SCC-13 细胞群门控捕获了 90% 的事件。B代表性annexin-V 与 7-AAD 流式细胞术图，x轴和y轴单位为AU，对应经 0、0.5、1 和 2 mM 5-ALA 孵育的细胞。Q1：早期凋亡细胞，Q2：晚期凋亡/坏死细胞，Q3：坏死细胞，Q4：活细胞。 请点击此处以查看此图的放大版本。

流式细胞术凋亡分析；Annexin-V 与 7-AAD，温度变化，散点图
图3：在不同温度下孵育5-ALA可能改变光动力疗法（PDT）的效果。 SCC-13细胞在0.5 mM 5-ALA条件下于27、36和42 °C孵育后，以x轴和y轴均为AU表示的代表性Annexin-V vs. 7-AAD流式细胞术图。Q1：早期凋亡细胞，Q2：晚期凋亡/坏死细胞，Q3：坏死细胞，Q4：活细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

在分别用0.5、1和2 mM的5-ALA孵育30分钟后，再经1,000秒蓝光照射，SCC-13细胞的凋亡显著增加。这些结果与我们先前发表的研究一致，表明30分钟的5-ALA孵育后经蓝光激活，可导致成纤维细胞凋亡比例呈剂量依赖性升高12,14。

这种研究光动力疗法（PDT）的实验方法具有优势和局限性。所描述的方法符合临床实践，因其采用了 commercially available PS 和光源。研究者可根据需要，使用不同的细胞类型、光敏剂（PSs）、光源及照射参数对本方法进行优化。然而，该方法也存在局限性，因为本实验方案专为单层培养的贴壁细胞设计。在临床实践中，组织结构或疾病病理学的差异可能影响治疗效果。即， 角化过度或纤维化可能会降低光敏剂（PS）的吸收或光的穿透性15因此，治疗剂量和实验结果可能无法直接对应于临床实践。球形肿瘤模型和微流控芯片已被研究作为更接近模拟肿瘤微环境的方法。16,17,18类球体具有内层和外层的细胞微环境，可能对光敏剂的摄取存在差异，从而体现肿瘤结构的异质性。其他研究者曾利用微流控芯片筛选治疗条件及光敏剂的血管递送效果。然而，微流控芯片的开发成本较高，且对于不熟悉该技术的研究人员而言可能难以实施。此外，类球体和微流控芯片可能无法完全模拟皮肤癌的临床治疗过程，因为在实际治疗中，光敏剂是直接应用于肿瘤表面，而非通过血管系统递送。研究人员可能需要评估单层细胞培养、类球体肿瘤模型和微流控芯片在不同疾病体系中用于光动力治疗研究的优缺点。由于缺乏免疫细胞和细胞外基质，无法确定光动力治疗对复杂细胞间相互作用的影响。研究人员可能需要验证 体外 使用动物模型和临床试验获得的实验结果。为了实现较高的测试间有效性，在进行实验时保持一致的孵育条件和光照参数至关重要 体外 光动力疗法实验

已知温度会影响光动力疗法（PDT）的疗效19。一项研究表明，将细胞在最高达44 °C的温度下与5-ALA共同孵育，可增强细胞死亡、5-ALA摄取、原卟啉IX（PP-IX）形成以及细胞因子释放19。高于44 °C的孵育温度可能导致热诱导的细胞死亡，而低于20 °C的孵育温度则可能无法实现显著的5-ALA摄取与积累19。我们建议研究人员在可调温的加热金属块上以恒定温度进行光敏剂孵育，以控制可能产生干扰的热效应。此外，必须保证光敏剂有足够的孵育时间，以使5-ALA充分转化为PP-IX。在本实验方案中，SCC-13细胞与5-ALA孵育30分钟，成功诱导了细胞凋亡。我们先前已证明，与未处理的对照成纤维细胞相比，10分钟的5-ALA孵育并未显著增加成纤维细胞的凋亡水平11,14。在37 °C条件下孵育6分钟后，小鼠皮肤中即开始出现PP-IX的积累。因此，在5-ALA孵育10分钟后，PP-IX的积累可能不足以诱导细胞凋亡20。基于我们先前的研究，我们建议5-ALA的最低孵育时间为20至30分钟11,14。研究人员可能需要根据实验室条件、所用光敏剂、细胞类型及临床适应证优化孵育时间。为获得最佳结果，可依据制造商的指导进行抗体滴定与优化实验。在蓝光照射激活后，还可开展其他相关检测，例如采用二氢乙啶进行流式细胞术定量检测活性氧（ROS）14。

单位面积接收的光量差异（即， 辐照度）和总辐照剂量（即， 在光激活阶段，光通量可能影响活性氧（ROS）的形成及细胞凋亡21. 氟量、辐照度与时间之间的关系可用以下公式描述：

能量密度（J/cm2）= 辐照度（W/cm2）× 时间（s）

由于能量密度依赖于时间，延长或缩短光激活阶段可能会改变治疗效果。辐照度与光源和靶组织之间距离的平方成正比。因此，如果光源距离过远，则可能无法向靶组织输送足够的光能以激发光敏剂（PS）。相反，周围表面的光反射可能会增加辐照度。因此，我们建议将细胞培养板放置在黑色表面上进行光照，以防止光反射。研究人员可使用市售或经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的蓝色发光二极管（LED）和荧光装置进行光动力疗法（PDT）实验，但这些装置可能具有不同的功率输出和光照场均匀性。每次实验前，应使用波长特异性光度计测量细胞表面的辐照度及光照场的均匀性，以确保结果的一致性。如有必要，可使用市售的漫射器来提高光照场的均匀性。

总之，我们已描述了一种 体外 通过详述光动力疗法的理论、实验方法、局限性、潜在风险及优化建议，提供一种研究光动力疗法的途径。光动力疗法是一种有用的临床治疗手段， 体外 研究可能促进新型光敏剂的开发、治疗方案的优化以及光动力疗法新适应症的探索。

披露

DUSA/Sun Pharmaceutical 提供了 5-ALA 和 BLU-U 光照设备。本手稿由 Jagdeo 博士的剩余经费资助。本内容不代表美国退伍军人事务部或美国政府的观点。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
角质形成细胞无血清培养基 Thermofisher17005042SSC-13 细胞的培养基
DMEM 低糖 GlutaMAXThermofisher10567022其他细胞类型的可能培养基
6 孔培养板Thermofisher720083
PBSThermofisher14190250
0.25% 胰蛋白酶-EDTAThermofisher25200056
台盼蓝溶液，0.4%Thermofisher15250061用于细胞计数和铺板 
BLU-U 光源 DUSA向生产商申请其他蓝色 LED、荧光或卤素光源也可使用 
5-ALADUSA向生产商申请
FBSAtlanta BiologicalsC17032
FlowCellect Annexin Red 试剂盒Millipore Sigma FCCH100108 碘化丙啶可替代 7-AAD。试剂盒包含 Annexin-V、7-AAD 和流式缓冲液
FACSCanto IIBD向生产商申请可使用任意流式细胞仪 
细胞计数板Hausser3120用于细胞计数和铺板 
FlowJoFlowJo向生产商申请流式细胞术分析软件

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