火鸡疱疹病毒（HVT）被广泛用作重组疫苗的载体平台，以预防多种禽类疾病。本文介绍了一种简单且快速的重组HVT载体疫苗制备方法，该方法结合了NHEJ-CRISPR/Cas9与Cre-Lox系统。
本文内容
摘要
摘要
火鸡疱疹病毒（HVT）是一种理想的病毒载体，可用于利用细菌人工染色体（BAC）诱变或传统重组方法，研制针对多种禽类疾病的重组疫苗，例如禽流感（AI）、新城疫（ND）和传染性法氏囊病（IBD）。CRISPR/Cas9系统已在多种场景中成功用于基因编辑，包括对多个大型DNA病毒基因组的操作。我们已开发出一种快速且高效的基于CRISPR/Cas9的基因组编辑流程，用于构建重组HVT。为最大化该方法的应用潜力，本文详细介绍了表达传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP2蛋白的重组HVT的构建方法。VP2表达盒被插入至HVT基因组中 通过 一种依赖于NHEJ（非同源末端连接）的修复通路。首先将一个绿色荧光蛋白（GFP）表达盒连接到插入片段上，以便于观察，随后将其移除 通过 Cre-LoxP 系统。该方法为将其他病毒抗原引入HVT基因组以快速开发重组疫苗提供了一种高效途径。
引言
马立克病（MD）是由禽疱疹病毒2型（Gallid Herpesvirus 2 [GAHV-2]）血清型1引起的鸡淋巴增生性疾病 马立克病毒属 亚科中 α-疱疹病毒亚科. 马立克病毒属 还包括两种非致病性血清型：血清型2（GaHV-3）和血清型3（MeHV-1，历史上称为HVT），二者均被用作预防马立克病（MD）的疫苗。活HVT疫苗（FC-126株）是20世纪70年代初期使用的首代MD疫苗，目前仍广泛用于二价和多价疫苗配方中，以增强对MD的保护效果。由于HVT具有良好的通用性和对人类及禽类的安全性，它还被广泛用作疫苗载体，以诱导对多种禽类疾病的免疫保护 在卵内 以及皮下孵化场给药和提供终身免疫的能力。重组HVT疫苗的制备策略基于病毒感染细胞中的常规同源重组、重叠cosmid DNA技术或BAC诱变。2然而，这些方法通常耗时较长且劳动强度大，需要构建转移载体，并在 大肠杆菌 噬斑纯化，以及从编辑后的病毒中去除BAC序列和筛选标记3,4.
CRISPR/相关蛋白（Cas9）是近年来最受欢迎的基因编辑工具，因其具有高度的通用性和特异性。CRISPR/Cas9系统已成功用于高效构建基因修饰细胞和动物模型5,6,7,8,9,10，以及多种大型DNA病毒基因组的改造11,12,13,14,15,16,17,18,19,20。在报道了一种利用CRISPR/Cas9系统编辑HVT基因组的简单高效方法后21，我们进一步建立了一套快速高效生成重组HVT的技术流程22。
为了拓展该方法的潜在应用，本文详细描述了在HVT的UL45/46位点插入表达IBDV VP2基因的重组HVT疫苗的构建方法。该方法结合使用NHEJ-CRISPR/Cas9技术将带有GFP报告基因标记的VP2基因插入病毒基因组，并利用Cre-LoxP系统在后续阶段切除GFP表达盒。与传统的同源重组和BAC重组工程技术相比，我们证明NHEJ-CRISPR/Cas9联合Cre-LoxP系统是一种快速且高效的重组HVT疫苗构建策略。
方案
1. Cas9/gRNA 表达载体和供体质粒的制备
- 构建Cas9/gRNA表达质粒
- 按照先前所述方法设计靶向HVT病毒UL45与UL46基因间区的gRNA序列22。将该向导RNA靶序列与HVT基因组进行比对，以排除HVT基因组中任何可能的脱靶序列。合成并克隆靶向UL45/46区域的gRNA序列，以及来自已发表数据的sg-A序列23，插入至pX459-V2载体中，方法如前所述22。使用U6-Fwd引物通过Sanger测序验证克隆后的gRNA序列24。
- 供体质粒的构建
- 为构建含有VP2表达盒并携带可移除GFP报告基因表达盒的供体质粒，设计寡核苷酸Donor-F和Donor-R，其包含以下元件（图1A 和 图3A）：两端各有一个sg-A靶序列，用于GFP报告基因表达盒的克隆与切除的PacI位点两侧各有一个LoxP序列，以及两个用于VP2表达盒克隆的SfiI位点。
- 将上述序列克隆至pGEM-T-easy载体中，随后将GFP和VP2基因表达盒克隆至该重组载体中，构建命名为pGEM-sgA-GFP-VP2的供体质粒22。
注：可使用任何克隆载体构建供体质粒。
- 质粒DNA制备
- 根据制造商说明书，使用商业化的DNA提取试剂盒分别制备供体质粒和Cas9/gRNA表达质粒的DNA。
2. CRISPR/Cas9 介导的基因敲入：转染与感染
- 转染前一天，使用10日龄鸡胚在添加了5%胎牛血清（FBS）、10%胰蛋白胨磷酸盐肉汤、100 U/mL青霉素-链霉素和0.25 µg/mL两性霉素B的M199培养基中制备鸡胚成纤维细胞（CEFs），用于转染/感染实验。每孔加入2.5 mL培养基，以1.3 × 106个细胞/孔的密度接种至6孔板的每个孔中。
注意：CEF细胞可在4 °C下保存3天。 - 使用适当的转染试剂，按照制造商说明书，将步骤2.1中制备的CEF细胞与0.5 µg UL45/46-gRNA、0.5 µg sg-A以及1 µg pGEM-sgA-GFP-VP2共转染。将细胞在38.5 °C、5% CO2的培养箱中孵育12小时。
- 在Cas9/gRNA和供体质粒转染后12小时，用M199培养基将HVT病毒原液稀释至1 × 105 pfu/mL。向每个转染细胞孔中加入130 µL稀释后的病毒，并设置一个未转染细胞孔作为阴性对照，加入等量病毒。将转染/感染的细胞在38.5 °C、5% CO2条件下孵育3天。所有操作均须依照资助方批准的《联合操作规范》（JCoPR）进行。
3. HVT 重组病毒的收获与纯化
- 荧光激活细胞分选
- 在分选前一天，准备两块96孔板，每孔预先接种2 × 104 个CEF细胞。
- 转染或感染后第3天，用胰蛋白酶消化CEF细胞。吸除各孔中的培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞层。每孔加入1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA（0.48 mM），在38.5 °C培养箱中消化约5分钟。
- 将细胞用50 µL胎牛血清（FBS）重悬，并转移至1.5 mL微量离心管中。以200 × g 离心5分钟。
- 用含1% FBS的1 mL PBS重悬细胞。使用血细胞计数板计数细胞，并将细胞浓度调整至1 × 106 个/mL。
注：细胞可在冰上保存1–2小时。 - 将细胞通过聚苯乙烯分选管的滤帽转移至分选管中。根据细胞分选仪的制造商说明，将表达GFP的单个细胞分选至已接种CEF细胞的96孔板中。将分选后的细胞在38.5 °C、5% CO2 条件下培养5天。
注：若原始孔中表达GFP的单个细胞过多而GFP阳性蚀斑较少，则在分选前可能需要进行一次病毒传代。
- 重组病毒的传代
- 在传代前一天，准备6孔板，每孔接种1.3 × 106 个CEF细胞。分选后第5天，在荧光显微镜下检查96孔板，标记含有单个GFP阳性蚀斑的孔。
注：代表性GFP阳性蚀斑见图2A。 - 用50 µL胰蛋白酶-EDTA对每个GFP阳性孔消化3分钟，加入50 µL培养基，重悬细胞后将其转移至一个含CEF细胞的6孔板孔中。此即为第一代重组HVT病毒。
- 3天后收获第一代重组病毒，将每种病毒各取1 mL加入含10%胎牛血清（FCS）、10%二甲基亚砜（DMSO）和80%培养基的冻存液中，冻存于液氮中。
注：收获时间根据病毒的数量和增殖能力而定，通常为2–4天。 - 收集每种第一代病毒的1 × 105 个细胞，离心后弃去上清液。将细胞沉淀在-20 °C保存，用于DNA提取。
- 在传代前一天，准备6孔板，每孔接种1.3 × 106 个CEF细胞。分选后第5天，在荧光显微镜下检查96孔板，标记含有单个GFP阳性蚀斑的孔。
- 通过聚合酶链式反应检测基因组插入
- 进行DNA提取时，将步骤3.2.4中的细胞沉淀解冻，并用50 µL裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl [pH 8]，1 mM EDTA，25 mM NaCl，以及200 µg/mL蛋白酶K）重悬，在65 °C裂解30分钟，随后在95 °C加热2分钟以灭活蛋白酶K。
- 使用3'连接区引物（表1）进行聚合酶链式反应（PCR），每反应使用1 µL DNA样本。每个样本在冰上配制以下20 µL反应体系：2× PCR预混液（10 µL）、10 µM上游引物（0.5 µL）、10 µM下游引物（0.5 µL）、DNA模板（1 µL）和无核酸酶水（8 µL）。扩增程序为：95 °C预变性2分钟；95 °C变性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸40秒，共35个循环；72 °C终延伸7分钟。取2 µL扩增产物上样至1%琼脂糖凝胶的一个孔中进行电泳分析。
注：代表性3'连接区PCR结果见图2A。
4. 荧光报告基因的切除 通过 Cre-lox 系统
- 为了从重组病毒中移除 GFP 基因，使用转染试剂按照制造商说明书，将 2 µg 的 Cre 重组酶表达质粒转染至预先接种了 CEF 细胞的 6 孔板中。
- 转染后 12 小时，从液氮中取出一管重组病毒解冻，轻轻重悬后，向每孔转染细胞中加入 50 µL 病毒液，并设一孔为阴性对照，加入等量病毒。在 38.5 °C、5% CO2 条件下孵育 3 天。
5. 噬菌斑纯化
- 荧光激活细胞分选
- 在分选前一天，将CEF细胞以每孔2 × 104个细胞接种至两块96孔板中。
- 按照第4步感染后72小时（即第3.1步所述程序）处理感染细胞，用于分选。将单个无荧光信号的细胞分选至已接种CEF细胞的96孔板中。
- 重组病毒的传代及PCR验证
- 分选后第5天，挑选5–10个无荧光的单个噬斑，加入50 µL胰蛋白酶-EDTA溶液，在38.5 °C下消化3分钟，随后加入50 µL培养基重悬细胞。
注：代表性GFP阴性噬斑见图2B。 - 将一半细胞接种至预先接种了CEF细胞的6孔板中的每个孔，作为第二代病毒。
- 将每个克隆剩余的细胞在200 × g条件下离心5分钟，弃去上清液，用50 µL裂解缓冲液重悬细胞，用于DNA提取。
- 使用5'连接区引物（表1），取1 µL DNA模板，按照第3.3.2步所述相同的PCR反应条件进行PCR扩增。
注：代表性5'连接区PCR结果见图2B。 - 根据PCR结果，选择三个至五个HVT重组阳性克隆进行后续传代和验证。
- 分选后第5天，挑选5–10个无荧光的单个噬斑，加入50 µL胰蛋白酶-EDTA溶液，在38.5 °C下消化3分钟，随后加入50 µL培养基重悬细胞。
6. 重组HVT的验证
- 间接免疫荧光检测
- 将上一步（5.2）获得的第二代重组HVT感染前一天接种于24孔板中的CEF细胞（每孔2.5 × 105个细胞）。感染后48小时，吸除细胞培养基，加入500 µL含4%多聚甲醛的PBS固定细胞。室温孵育30分钟，随后吸除固定液，用PBS洗涤细胞层3次。
注意：此步骤后细胞可在4 °C保存数周。 - 吸除PBS，加入500 µL含0.1% Triton X-100的溶液，室温孵育15分钟以通透细胞，随后用PBS洗涤细胞层3次。
- 加入封闭缓冲液（含5%牛血清的PBS）封闭非特异性结合位点，室温孵育1小时。
- 将一抗（抗VP2单克隆抗体HH7-或HVT感染鸡血清）用封闭缓冲液按1:200稀释，每孔加入200 µL，室温孵育1小时，随后用PBS洗涤细胞层3次。
- 将二抗（Alexa 568标记的山羊抗小鼠IgG或Alexa 488标记的山羊抗鸡IgG）用封闭缓冲液按1:200稀释，每孔加入200 µL，室温孵育1小时，用PBS洗涤细胞3次。在荧光显微镜下观察蛋白表达情况。
注意：典型的VP2染色结果见图4。
- 将上一步（5.2）获得的第二代重组HVT感染前一天接种于24孔板中的CEF细胞（每孔2.5 × 105个细胞）。感染后48小时，吸除细胞培养基，加入500 µL含4%多聚甲醛的PBS固定细胞。室温孵育30分钟，随后吸除固定液，用PBS洗涤细胞层3次。
- VP2基因测序
- 使用高保真DNA聚合酶及引物UL45-F1和UL46-R1（表1）扩增覆盖UL45与UL46基因间区的DNA序列，以检测完整插入片段。
- 配制以下50 µL反应体系：10x Pfx反应缓冲液5 µL，10 µM上下游引物混合液1.5 µL，10 mM dNTP混合液1 µL，50 mM MgSO4 1 µL，DNA模板1 µL，Pfx DNA聚合酶0.5 µL，加无核酸酶水至50 µL。扩增程序为：95 °C预变性2分钟；95 °C变性15秒，55 °C退火30秒，68 °C延伸3分钟，共35个循环。将全部PCR产物上样至1%琼脂糖凝胶进行电泳分析。
- 按照DNA凝胶回收试剂盒说明书纯化PCR产物。将10 µL PCR产物（浓度30 ng/µL）送至测序公司，以确认VP2基因的敲入情况。
7. 重组病毒的稳定性
- 在病毒扩增前一天，将 2.6 × 106 个 CEF 细胞接种至每个 T25 培养瓶中。
- 从步骤 5.2 中解冻至少三个阳性克隆；将每管细胞/病毒加入一个 T25 培养瓶中。在 38.5 °C、5% CO2 条件下培养，直至观察到 50% 的细胞病变效应。
- 用 2 mL 培养基收集细胞；取 50 µL 感染已预先接种 CEF 细胞的新 T25 培养瓶，用于下一代扩增。将重组病毒连续传代至少 15 代。每代病毒均通过 PCR 检测 VP2 序列的存在，并通过间接免疫荧光分析（IFA）检测 VP2 表达，以评估重组病毒的稳定性。
结果
重组HVT疫苗构建策略如图1所示，包括供体质粒的构建方法（图1A）以及生成重组HVT的操作流程（图1B）。转染并感染后第3天，在荧光显微镜下可观察到基因敲入孔中出现5至30个被野生型蚀斑包围的GFP阳性蚀斑。通过单细胞分选获得的纯化病毒（图2A）经3'侧翼区PCR分析，结果显示扩增出预期大小的PCR产物（图2A，下图）。利用Cre重组酶切除GFP报告基因后，超过50%的蚀斑失去GFP表达。经单细胞分选获得GFP切除后的纯化蚀斑（图2B），进一步通过5'侧翼区PCR验证，结果显示扩增出正确大小的PCR产物（图2B，下图）。图3展示了两个侧翼区PCR产物的测序结果，并以不同颜色标示各序列元件。图4通过IFA使用VP2特异性单克隆抗体和抗HVT鸡血清确认了蛋白表达。正如预期，亲本HVT感染的细胞仅能被抗HVT血清染色（绿色），而重组HVT感染的细胞则明显表达VP2基因（红色）。
图1: 重组HVT载体疫苗的制备策略. (A) 该图展示了用于构建供体质粒的克隆策略示意图。关键元件包括两个Cas9靶位点（sgA），用于释放插入片段；两侧带有LoxP序列的报告基因GFP表达盒，用于GFP的切除；以及VP2表达盒。B该图展示了一种两步基因敲入策略的概览。GFP和VP2表达盒的插入片段通过Cas9/sgA切割释放，并在UL45/46位点插入至HVT基因组中 通过 NHEJ-CRISPR/Cas9。随后通过单细胞荧光激活细胞分选（FACS）对GFP阳性重组病毒进行分选和纯化。接着利用Cre重组酶切除GFP报告基因，并对重组病毒进行纯化和鉴定。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 2：重组 HVT 的鉴定。（A）该图显示在荧光显微镜下观察到的 GFP 阳性蚀斑（HVT-GFP-VP2）（上图），以及使用引物 VP2-F 与 UL46-R1 对 HVT-GFP-VP2 的 3' 连接区进行 PCR 鉴定的结果。（B）该图显示通过 Cre 重组酶切除 GFP 后获得的蚀斑（HVT-VP2），以及使用引物 UL45-F1 与 VP2-R1 对 HVT-VP2 的 5' 连接区进行 PCR 鉴定的结果。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：重组HVT病毒的序列分析。（A）本图中不同颜色标注的关键元件序列分别为：UL45/46之间的HVT基因间区，其中下划线部分为gRNA靶序列，箭头指示Cas9切割位点；VP2表达盒，其末端序列为斜体小写字母；红色显示的sg-A靶序列，箭头指示Cas9切割位点；绿色显示的LoxP位点序列；以及蓝色显示的两个SfiI位点序列。（B）本图展示了5'和3'连接区的测序结果，以及HVT-VP2结构的示意图，图中关键元件的颜色与其在序列中的表示相对应。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：重组 HVT-VP2 的表征。 本图通过间接免疫荧光法（IFA）使用抗 VP2 单克隆抗体 HH7（红色）检测，证实 VP2 在感染的 CEFs 中成功表达。HVT 感染通过使用 HVT 感染鸡血清（绿色）的 IFA 确认。比例尺 = 20 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
CRISPR/Cas9 系统已成为基因编辑中一种重要的工具。传统的重组 HVT 载体构建技术，如同源重组13和 BAC 诱变技术25，通常需要多轮的载体克隆与筛选，以及大规模的筛选过程，可能耗时数月。本文所述的基于 NHEJ-CRISPR/Cas9 策略并结合 Cre-Lox 系统和单细胞分选的方法，在重组疫苗的构建中更为便捷、高效且快速。通过该流程，可在仅 1 - 2 周内获得重组病毒24，并且可通过荧光激活细胞分选将噬斑纯化步骤减少至单轮分离17。从 gRNA 设计和供体质粒构建到获得纯化的重组 HVT 病毒，整个过程可在 1 个月内完成。成功构建重组 HVT 的关键步骤包括：选择高效 gRNA 以靶向病毒基因组，确保外源基因插入时发生高效切割；实现高转染效率，以最大化 Cas9/gRNA 与病毒在同一细胞内相遇并进行编辑的机会；以及在供体质粒和 gRNA 质粒转染与病毒感染之间设置 12 小时的时间间隔，以确保在病毒进入细胞前，Cas9 和 gRNA 已达到适当的表达水平。
HVT 重组体构建的局限性在于通过连接 PCR 鉴定 GFP 阳性克隆的复杂性。GFP-VP2 盒子可能以任意方向插入。此处描述的连接 PCR 仅适用于鉴定正向插入的片段。若插入片段为反向，则使用所述引物对进行 PCR 将无法扩增，此时可互换使用内部引物以达到鉴定目的。另一个潜在问题是，由于 Cre 处理去除 GFP 后仍会残留 LoxP 序列，供体质粒只能用于同一病毒中单个基因的插入。若需进行多次插入，可改用带有变异 LoxP 序列的新供体质粒。
NHEJ 和 HDR（同源定向修复）是 Cas926,27 诱导的双链断裂（DSBs）的两种修复途径。NHEJ 效率更高，因其在整个细胞周期中均可发生28，而 HDR 效率较低，仅发生在 S 期和 G2 期6,29,30。本研究利用效率更高的 NHEJ 修复途径，将外源基因导入靶向位点。尽管 NHEJ 修复可能通过一种不依赖同源性的、机制上灵活的过程，连接被切割的供体序列与基因组 DNA 之间不匹配或受损的 DNA 末端，从而引入插入或缺失（indels）31,32，但这些 indels 仅可能出现在 sgA 的切割位点处，而不会影响外源基因表达盒。该方法的另一优势在于，NHEJ 不受同源臂构建的限制，使克隆步骤极为简便。这凸显了 NHEJ 在外源基因插入应用中的巨大潜力。在外源基因表达盒两端引入通用的 gRNA 靶位点，可使该过程更加迅速，供体模板可直接构建，无需针对特定 gRNA 进行筛选。含有 sgA 靶位点、LoxP 位点以及 PacI 和 SfiI 位点的供体质粒骨架，也可在不同报告基因、外源基因表达盒及不同病毒载体之间广泛共用，使这一新方法具备高度可定制化的优点。
本研究中使用携带 VP2 插入片段的 HVT 来描述本文的实验方案；然而，通过使用靶向相应目标序列的 gRNA，相同的方法也可用于在 HVT 基因组的不同基因组位点插入更多的病毒基因，从而开发多价重组 HVT 载体疫苗。其他马立克氏病病毒（MDV）疫苗株，如 SB-1 和 CVI988，以及其他禽类疱疹病毒（包括传染性喉气管炎病毒和鸭肠炎病毒），以及其他的禽类 DNA 病毒（如痘病毒和腺病毒），也可采用相同的方法进行改造，用于多价重组疫苗的开发。利用本文所述的 CRISPR/Cas9 系统平台开发新型多价载体疫苗，将对家禽产业预防多种家禽疾病具有重要意义。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Pippa Hawes 在共聚焦成像方面的协助。本项目获得了生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC）基金 BBS/E/I/00007034 和 BB/L014262/1 的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| M199 培养基，Earle's 盐 | Life technology | 11150059 | 细胞培养基 |
| 胎牛血清 | Sigma | F0926 | 细胞培养基 |
| 青霉素和链霉素 | Life technology | 15140148 | 抗生素 |
| Fungizone | Sigma | 1397-89-3 | 抗真菌剂 |
| 胰蛋白胨磷酸盐肉汤 | Sigma | T8782 | 细胞培养基 |
| HVT Fc126 毒株 | Avian Disease and Oncology Laboratory | 野生型 HVT 病毒 | |
| pX459-v2 | Addgene | 质粒 #62988 | Cas9 和 gRNA 表达载体 |
| pGEM-T Easy 载体系统 | promega | A1360 | 供体质粒克隆 |
| Subcloning Efficiency DH5α 感受态细胞 | Invitrogen | 18265-017 | 转化 |
| PacI | NEB | rR0547S | 供体质粒克隆 |
| SfiI | NEB | R0123S | 供体质粒克隆 |
| T4 DNA 连接酶 | NEB | M0202S | 克隆 |
| QIAprep Spin Miniprep 试剂盒 | QIAGEN | 27106 | 质粒提取 |
| TransIT-X2 | Mirus | MIR 6004 | 转染 |
| 细胞培养 6 孔板 | Thermofisher | 140675 | 细胞培养 |
| GoTaq Master Mix | Promega | M7123 | 连接 PCR 扩增 |
| Platinum Pfx DNA 聚合酶 | Thermofisher | 11708021 | 完整插入片段的 PCR 扩增 |
| 山羊抗鸡 IgY (H+L) 抗体，Alexa Fluor 488 标记 | Invitrogen | A-11039 | 免疫荧光染色 |
| 山羊抗小鼠 IgG 抗体，Alexa Fluor 568 标记 | Invitrogen | A-11004 | 免疫荧光染色 |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Leica Microsystems | Leica TCS SP5 LASAF | 免疫荧光 |
| FACS 细胞分选仪 | BD biosciences | BD FACSAria | 单细胞分选 |
| 多聚甲醛（PBS 中 4%） | Santa cruz biotechnology | SC-281692 | 细胞固定 |
| Triton X-100 | GeneTex | GTX30960 | 通透处理 |
参考文献
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