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采用管中芯片格式对散发性家族性腺瘤性息肉病患者进行遗传变异数字聚合酶链式反应检测

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DOI：

10.3791/58199

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2018年8月20日

 , 
1Department of Tumor Pathology, Hamamatsu University School of Medicine

本文内容

摘要

数字聚合酶链式反应（PCR）是一种用于高灵敏度检测单核苷酸变异和DNA拷贝数变异的有效工具。本文以管中芯片格式的数字PCR为例，展示利用该技术检测人类基因组中稀有变异时需考虑的关键因素。

摘要

对人类遗传变异进行定量分析对于理解肿瘤等严重医学状况的分子特征至关重要。由于数字聚合酶链式反应（PCR）能够精确定量DNA拷贝数变异，因此其正成为检测罕见遗传变异（如耐药突变）的重要工具。预计在不久的将来，基于数字PCR（dPCR）的分子诊断将应用于临床实践，因此如何高效地利用人类遗传物质开展dPCR已成为研究热点。本文介绍了一种采用“管中芯片”格式的dPCR方法，用于检测Adenomatous polyposis coli （APC）体细胞嵌合现象，该格式可同时进行八组dPCR反应。在将反应混合物填充并密封至芯片时需格外小心。本文演示了如何避免对阳性分区的过高或过低估计。此外，我们还提供了一种简单的方法，用于从芯片上的分区中收集dPCR产物，以便进一步验证特异性扩增。我们希望本方法学报告能够推动“管中芯片”式dPCR在遗传学研究中的广泛应用。

引言

定量PCR（qPCR）常用于量化人类遗传变异，包括单核苷酸变异（SNVs）和DNA拷贝数变异（CNVs）。在qPCR中，每个反应管中的聚合酶反应与传统的终点PCR相同，每经过一个热循环后从反应管中获取扩增信号。相比之下，本报告中所指的数字PCR（dPCR），即终点dPCR，是将PCR混合液加载到许多微小的腔室中，这些腔室被称为“分区”，其中DNA模板以限稀释的方式存在或不存在，并在PCR完成后对每个含有PCR混合液的分区判定为阴性或阳性。虽然可以很容易地推断阴性分区中没有DNA模板，但阳性分区中存在多少拷贝的DNA模板则并不明确。因此，基于泊松分布，利用阴性分区的计数来估算阳性分区中DNA模板的数量1。与qPCR相比，dPCR成本更高且动态范围较小，但该方法可实现绝对定量，并具有更高的灵敏度和更优的精密度2。

数字PCR（dPCR）的主要应用之一是验证下一代测序（NGS）所鉴定出的变异。尤其是在罕见变异（即低变异频率）的情况下，由于NGS可能出现测序错误，因此验证尤为关键3。尽管Sanger测序和qPCR可用于单核苷酸变异（SNV）和拷贝数变异（CNV）的验证，但与dPCR相比，其灵敏度较低。因此，在涉及罕见变异的遗传学研究中，dPCR技术备受关注。近年来，通过液体活检检测与癌症特征（如耐药性）相关的罕见变异已成为分子诊断与治疗领域的热点话题4。dPCR技术适用于液体活检研究，预计在不久的将来具有重要的临床应用前景，尽管其动态范围和成本方面仍需进一步优化。

商用数字PCR技术大致可分为基于液滴和基于芯片的平台，其区别在于DNA模板的分区方式5,6,7。在管中芯片格式的数字PCR中，PCR混合物通过毛细作用被分配到芯片上的各个分区。这些芯片集成于八联管条中，许多实验室人员对此已十分熟悉，因此可同时处理八个样本8。在读取步骤中，通过检测芯片的整体图像而非每个单独分区，可在<1小时内完成96个样本的分析。由于管中芯片格式的数字PCR与其他数字PCR系统相比具有较高的通量，因此其主要优势在于良好的可用性和高生产效率。

本报告以一名散发性家族性腺瘤性息肉病患者中APC基因的体细胞嵌合现象为典型案例，比较了数字PCR（dPCR）与下一代测序（NGS）的检测结果。本报告的主要目的是利用芯片管式数字PCR技术对单核苷酸变异进行精确定量。我们希望本报告能为有意采用dPCR平台开展研究工作的科研人员提供参考。

方案

该研究设计已获得滨松医科大学医学院机构审查委员会的批准（编号：G-260-4）。已从患者及其父母处获得书面知情同意书。

1. 基因组DNA的质量控制

注意：使用成熟的基于二氧化硅膜的DNA纯化方法从外周血中提取基因组DNA（gDNA）。在进行以下步骤之前，已使用分光光度计测定gDNA的浓度。

  1. 将基因组DNA样本配制为浓度10–100 ng/µL。
  2. 向8联管条中加入10 µL DNA样本缓冲液。
  3. 向各管中加入1 µL DNA Marker或基因组DNA。使用微孔板振荡附件涡旋混匀1分钟。
  4. 将管子、凝胶装置和移液器吸头装入电泳仪（材料表），然后按下“开始”按钮启动运行。
    注意：电泳系统在点击“开始”按钮后将自动运行。
  5. 确认DNA样本缓冲液中的低分子量标记物在电泳图谱中被正确识别。若识别错误，请在软件的“电泳图模式”中手动指定标记物。
    注意：DNA完整性数值（DIN）将自动计算。DIN值反映DNA完整性，较高的DIN值表示基因组DNA完整性良好，较低的DIN值则表示基因组DNA严重降解。
  6. 在软件的“区域模式”中设定基因组DNA的片段大小范围（> 200 bp），以自动计算该范围内基因组DNA（> 200 bp）的浓度。

2. 引物和探针设计

  1. 计算熔解温度（Tm）值，使用任何开放获取工具，需满足以下条件：10–25 个碱基，50 mM Na+/+，0.80 mM dNTPs 和 3 mM Mg2+ (材料表）。设计扩增包含目标等位基因的基因组区域的正向和反向引物，其中含有 Tm 大约的数值 60 °C 扩增子长度为100–300 bp。
    注意：请参阅 表1 用于寡核苷酸的浓度测定。
  2. 根据以下条件设计参考等位基因和变异等位基因的锁核酸（LNA）探针：（i）每条探针包含1–6个LNA；（ii）每条探针的5'端和3'端分别标记荧光染料和淬灭基团；（iii）参考等位基因与变异等位基因探针的Tm值之差应大于5 °Cm 匹配探针与不匹配探针的值之差 > 10 °C；（iv）Tm 匹配探针和错配探针的值分别高于和低于引物的值[例如，正向引物： 60.8 °C，反向引物： 59.8 °C，参考等位基因探针（匹配/不匹配）：62.6/45.3 °C，变异等位基因探针（匹配/不匹配）：61.7/50.5 °C]. Tm 使用与步骤 2.1 相同的开源工具计算数值。
  3. 确保设计的引物和探针不包含频率高于设定阈值的单核苷酸多态性 > 0.1%，根据数据库确定例如单核苷酸多态性数据库（dbSNP）

3. 数字PCR

  1. 使用 TE 缓冲液配制引物、探针和基因组 DNA 储存液，浓度如表 1所述，并将其储存于 -20–4 °C。
  2. 在室温下将试剂混合，总体积为 15 µL，终浓度如表 1 所述。
    1. 在无模板对照（NTC）中，加入 3 µL 去离子水代替基因组 DNA。
    2. 为避免移液误差，按三份平行样准备 3.5 倍量的 PCR 混合液。
  3. 上下吹打 PCR 混合液以充分混匀。
  4. 将加样平台安装到 8 孔排管内置芯片上，并将其置于自动加样器中。确保芯片与加样平台之间接触良好。
  5. 将加样滑块安装在平台上，并用手握住滑块，使止动器脱离加样器。
  6. 在滑块尖端附近的平台上加入 15 µL PCR 混合液（图 1A）。
  7. 按下加样器按钮运行加样程序（约 1 分钟）。
    注意：若平台上有少量 PCR 混合液残留并无影响，可依次重复运行加样器。
  8. 将装有 PCR 混合液的芯片管放入密封增强仪的侧槽中。推动滑动盖和顶盖边缘时需小心，避免损坏芯片（图 1B）。
  9. 运行密封增强仪（约 2 分钟）。若仍可见液体积聚，需依次重复运行密封增强仪 1 分钟，以防密封不全导致阳性信号交叉污染（图 1C 和 1D）。
  10. 向各管中加入 230 µL 封闭液（一种油性试剂）。
    注意：此时芯片应完全浸没于液体中。
  11. 将管子放入热循环仪中，按照表 2所述程序运行（约 2 小时）。若阳性分区分布不均，可调整 PCR 的温度或时间（图 1E）。
    注意：建议将升降温速率设置为约 1 °C/s。
  12. 将管子留在热循环仪中至少 15 分钟，以降低基线噪声。
    注意：也可过夜放置。次日仍可检测到荧光信号。
  13. 将管子置于检测夹具中，并向夹具内倒入 6 mL 去离子水。若管内外可见气泡，请清除气泡（图 1F 和 图 1G）。
  14. 将夹具装入检测仪，选择“荧光”、“实验”和“样品/NTC”标签页后，点击软件中的“运行”按钮开始检测（材料表）。
    注意：默认强度下，八份样品的双色检测耗时约 4–5 分钟。
  15. 确认位置图、直方图和二维散点图。
    注意：若阴性分区的荧光强度过高，可点击软件中的“设置”按钮调整强度，使其落在 30–70 范围内。
  16. 使用以下公式计算变异等位基因频率（VAF）：
    用于方差计算的 VAF 公式；Cv/(Cr+Cv)×100；文本格式方程。
    其中，Cv 和 Cr 分别为变异等位基因和参考等位基因的拷贝数。
    注意：软件程序将基于泊松统计自动计算上述数值。

4. PCR 产物的收集

  1. 从离心管中移除封口液。
  2. 向离心管中加入 100 µL TE 缓冲液，剧烈涡旋振荡 30 秒，然后短暂离心。
  3. 将 TE 溶液转移至另一离心管，加入 30 µL 3 M 醋酸钠和 200 µL 乙醇。
  4. 将溶液于 -20 °C 冷却过夜。
  5. 在 16,000 x g 条件下离心 30 分钟，并移除上清液。
  6. 向离心管中加入 300 µL 80% 乙醇，并涡旋振荡。
  7. 在 16,000 x g 条件下离心 15 分钟，移除上清液，将沉淀物在空气中干燥 5 分钟。
  8. 干燥后，用 1–5 µL TE 缓冲液溶解沉淀物。
  9. 如有必要，参照步骤 1 使用电泳仪检测产物大小。取 1 µL 溶液上样至凝胶装置以获得高灵敏度检测结果（材料表）。

结果

我们根据上述方法回顾了一例散发性家族性腺瘤性息肉病患者的APC基因体细胞嵌合现象。在先前的研究中，通过Sanger测序和NGS9发现该患者携带APC c.834 + 2T > C突变，而其父母未携带该突变。代表性实验结果中所用引物和探针的设计见表3。从先证者、其父母以及六名健康供体的血液中提取基因组DNA。九份gDNA样本的DIN值介于6.7–7.9之间（图2和表4）。FAM和HEX分别用作C和T等位基因的荧光染料。位点图上的绿色和黄色斑点分别代表FAM阳性和HEX阳性的分区（图3A）。蓝色斑点表示FAM和HEX均为阴性的分区。黑色背景对应未加入反应混合物的分区。在先证者中检测到大量C和T等位基因的阳性分区，而在先证者的父亲或NTC样本中仅检测到极少量C等位基因的阳性分区，且在后者中未检测到T等位基因的阳性分区。在二维（2-D）散点图上，C和T等位基因之间的信号分离清晰，HEX和FAM的最强阳性信号彼此互斥（图3B）。先证者的VAF为13.2%，与NGS检测结果（12.7%）相近（表4）。先证者父母及健康供体的VAF均< 0.1%。使用10–11 ng总gDNA进行重复测量，以3倍标准差估算，APC c.834 + 2T > C突变的检测限约为0.3%10。

在针对 APC c.834 + 2T > C 的数字PCR（dPCR）检测中，扩增子大小预计为 123 bp。为确认dPCR产物以单一条带形式扩增，从检测芯片中回收了dPCR产物。通过电泳分析，清晰地检测到单一扩增条带，且产物大小与预期一致（图4）。

使用接触平台和滑块在实验室设置中进行含混合物、塞子和芯片的PCR过程。
图1：芯片管式dPCR检测的注意事项。（A）本图展示如何在自动加样器中设置8联管条。（B）本图展示破损的芯片。（C）本图展示（i）加样后和（ii）封膜后的芯片表面情况。（iii）若封膜不完全，可见液面积聚。（D）本图展示发生交叉污染时的位置图。（E）本图展示分布不均时的位置图。（F）本图展示浸入水中时管表面附着的气泡。（G）本图展示管内存在的气泡。在整个图中，黑色和白色箭头分别指示破损的芯片碎片和气泡。请点击此处查看此图的放大版本。

DNA完整性分析、电泳图，显示供体6和供体3的强度与片段大小（bp）关系。
图2：血液基因组DNA的代表性电泳图谱。 上图和下图分别显示DNA完整性数值（DIN）为6.7和7.9的血液基因组DNA电泳图谱。星号表示较低的标记。DIN：DNA完整性数值。请点击此处查看该图的放大版本。

基因分型分析示意图；用于DNA等位基因检测的FAM和HEX荧光散点图
图3：采用芯片管式数字PCR检测APC体细胞嵌合的代表性结果。（A）显示了无模板对照（NTC）、先证者和父亲的位置图，以及（B）散点图。HEX和FAM分别对应参考等位基因和变异等位基因。垂直线和水平线分别表示HEX和FAM荧光强度的阈值。本图经Kahyo et al.10修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

凝胶电泳结果、DNA片段分析，显示了ladder、NTC、先证者、亲本样本。
图4：检测芯片中dPCR产物的收集结果。 收集并浓缩的dPCR产物进行了电泳分析。预期目标片段大小为123 bp。该图改编自Kahyo et al.10。NTC：无模板对照。 请点击此处查看此图的放大版本。

试剂浓度
储备液		体积μL)终浓度推荐
终浓度
无DNase/RNase的蒸馏水-1.75--
2x PCR预混液-7.5--
主要等位基因的LNA探针2 μM0.566.7 nM3.33–100 nM
针对次要等位基因的LNA探针2 μM0.566.7 nM3.33–100 nM
上游引物1 μM0.533.3 nM3.33–50.0 nM
反向引物1 μM0.533.3 nM3.33–50.0 nM
20x dPCR 溶液-0.75--
gDNA3.33 ng/μL3666 pg/μL20 pg/μL–2,000 pg/μL1

表1：数字PCR检测所用试剂。 1根据预期的精密度和灵敏度而定。

步骤温度时间循环数
初始变性95 °C5 m1
变性
退火与延伸		95 °C
58 °C		50 s
90 s		42
最终延伸70 °C5 m1

表2：PCR仪的热循环条件。

名称序列1Tm 值2
正向引物5'-GGTCAAGGAGTGGGAGAAATC-3′60.8 °C
反向引物5'-TCTTAGAACCATCTTGCTTCATACT-3′59.8 °C
T等位基因LNA探针5'-HEX-ATTT[A]CCTGACCA-IBFQ-3'匹配：62.6 °C
不匹配：45.3 °C
C等位基因LNA探针5'-FAM-TTT[G]CCTGACC-IBFQ-3'匹配：61.7 °C
不匹配：50.5 °C

表3：引物和探针的设计。1下划线标注的字母为锁核酸（LNA），括号内的字母为目标变异位点。2根据实验方案第2步计算得出。

NGS3dPCR4
样本1组织输入DNA (ng)DIN2VAF (%)变异拷贝数参考拷贝数VAF (%)
均值RSD
NTC----1.230N/AN/A
先证者血液11.37.612.73792.48 x 10313.20.0353
父亲血液10.37.70.01671.083.42 x 1030.03410.439
母亲血液10.87.60.01360.9563.04 x 1030.03130.637
供体-1血液11.77.3-1.643.01x 1030.05430.414
供体-2血液10.57.6-1.062.90 x 1030.04060.539
供体-3血液17.67.9-4.245.65 x 1030.07130.783
供体-4血液12.37.6-2.384.16 x 1030.06660.557
供体-5血液19.27-1.486.79 x 1030.02130.571
供体-6血液14.46.7-3.444.67 x 1030.07280.729

表4：dPCR检测结果 APC 体细胞嵌合现象 1NTC：无模板对照；Donor：健康供体。 2DIN：DNA完整性编号。 3Iwaizumi 等9，Hum Genome Var. 2 15057 (2015)。 4实验均设三个重复，并独立重复3次；数据以平均值表示；RSD：相对标准偏差；N/A：不适用。本表格经Kahyo修改。 等10.

讨论

DIN值常用于评估受损的DNA（例如，福尔马林固定石蜡包埋组织的基因组DNA）在定量或测序前进行评估，因为基因组DNA的严重降解可能导致低质量数据。因此，DIN评估正成为人基因组DNA质量控制中的重要步骤11由于代表性实验中所用的基因组DNA（gDNA）在从血液中提取后已在4 °C下保存了4至11年，因此在数字PCR（dPCR）检测前需测定其DNA完整性值（DIN）以进行质量控制。若怀疑样本存在损伤，此步骤尤为必要。gDNA浓度亦通过电泳法测定。由于dPCR的动态范围受限于分区数量，其范围不及qPCR宽，因此准确测定gDNA浓度是确保dPCR检测成功的重要步骤。输入DNA的量与dPCR检测中变异等位基因和参考等位基因的总拷贝数呈显著相关性（R² = 0.935； 表4电泳可用于在数字PCR检测前测定基因组DNA浓度。

上样和封膜过程是获得成功结果的重要步骤。必须确认PCR混合液已正确装载至平台上，并确保芯片与平台之间充分接触。图1A。PCR混合物从滑片中溢出可能导致芯片上的分布无效. 在进行精确分析时，还需确认位置图上阳性和阴性分区的分布情况，因为泊松统计学假设DNA模板被随机分配到各反应腔室中。1在代表性结果中，阳性分区在整个芯片上均有分布（图3）。该结果符合泊松统计的要求，表明加载和密封步骤操作有效。在将管子放入密封增强装置时，若过度用力按压顶部盖子的中央部分，可能导致芯片破裂。图1B）。为避免此情况，可轻轻推动上盖边缘。如果出现阳性分区的人工聚类（图1D)，由于分区之间发生交叉污染，可能导致拷贝数被高估。如果在表面观察到液滴，应改进密封程序。图1C) (例如，通过依次重新运行密封增强程序1分钟）。如果阳性分区分布不均（图1E），由于扩增不足或封接液与水的污染，可能导致拷贝数被低估。此时应调整PCR条件[例如通过调节PCR的温度或时间（方案步骤3.11），或确保夹具中使用的密封液和加入的水保持洁净，可避免干扰。荧光信号从浸入蒸馏水中的8联管中检测获得。若气泡附着在管壁表面，则可能干扰信号的检测。图 1F）。因此，应使用细小的移液器吸头等工具清除气泡。此外，当试管放入夹具时，管内可能产生气泡图1G）。如果管内的气泡足够大，能够覆盖芯片，则也应清除。气泡在室温下静置数分钟后可能会自行消失。

在阴性对照（NTC）中可能会检测到一些阳性分区。为避免DNA模板污染，应保持实验台面清洁，并尽可能使用带风扇过滤装置的洁净工作区。如果怀疑DNA模板已被污染，应彻底清洁操作区域和/或丢弃已使用的试剂。相反，如果在存在基因组DNA（gDNA）的情况下未能检测到参考等位基因的阳性分区，则需重新确认gDNA、引物和探针的浓度。值得注意的是，在代表性实验中，引物的使用浓度低于常规PCR中的浓度（表1）12。此外，确认升降温速率也至关重要，而这一参数在常规PCR中很少被调整。

采用芯片管格式的数字PCR（dPCR）的独特之处在于，其PCR混合物的分隔直接在通用8联管条内完成8,13。该系统无需将分隔室转移至PCR管中，从而降低了污染风险。此外，芯片管格式的dPCR系统还具有另一优势：在该系统中完成96个检测所需时间少于< 4小时，而基于液滴的dPCR完成相同数量的检测至少需要5小时14。同时，通用8联管条的设计使得该系统可使用常规的热循环仪，而不同于另一种需要配备平板模块热循环仪的芯片式dPCR系统15。此外，传统PCR已积累的知识和试剂也可直接应用于该dPCR系统，这将有助于拓展dPCR的应用范围。

需要注意的是，数字PCR（dPCR）存在若干局限性。在采用管中芯片（chip-in-a-tube）格式的dPCR中，芯片的分区数量相较于其他dPCR平台相对较低。为进一步提高依赖于分区数量的动态检测范围，需对芯片装置进行改进。由于通用试管内部空间有限，必须通过突破性设计来增加分区数量。未来若能实现dPCR全流程的自动化，将可显著减少人为误差，从而获得更加可靠的结果。由于其高通量和高灵敏度的特性，管中芯片格式的dPCR有望被应用于液体活检和环境DNA等大量样本的检测。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由日本科学促进会（JSPS）科学研究费补助金（C）（编号：15K08397）资助Tomoaki Kahyo，以及由日本医疗研究开发机构（AMED）（编号：927960719）、探索性研究费补助金（编号：16K15256）、国立大学经营改革激励特别预算关联项目支出（编号：1019253）和吸烟研究基金会资助Haruhiko Sugimura。作者感谢Iwaizumi博士和Kurachi博士提供的临床支持。资助方在本文撰写过程中未发挥任何作用。图3、图4和表4经Elsevier许可，改编并转载自Kahyo等10的文章。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
QIAamp DNA Blood Maxi 试剂盒Qiagen51194方案 1 前：基因组 DNA 提取
NanoDrop 1000ThermoFisher SCIENTIFICND-8000方案 1 前：分光光度计
8联管Agilent Technologies401428方案 1
基因组 DNA 样品缓冲液Agilent Technologies5067-5366方案 1：
基因组 DNA Screen Tape 检测试剂盒的组分
DNA 标准分子量标记Agilent Technologies5067-5366方案 1：
基因组 DNA Screen Tape 检测试剂盒的组分
MS3 Basic 小型振荡器IKA3617000方案 1：涡旋混合器
基因组 DNA ScreenTapeAgilent Technologies5067-5365方案 1：凝胶装置
2200 TapeStation 系统Agilent TechnologiesG2965AA方案 1：电泳仪器
TapeStation 分析软件Agilent Technologies随 G2965AA 捆绑提供方案 1：分析软件
DNA 寡核苷酸引物IDT定制订购方案 2
LNA 探针IDT定制订购方案 2
软件工具IDT网站：http://biophysics.idtdna.com/方案 2
dbSNP 数据库NCBI网站：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/方案 2
TE 缓冲液ThermoFisher SCIENTIFIC12090015方案 3
无 DNase/RNase 蒸馏水ThermoFisher SCIENTIFIC10977015方案 3（表 1）
Clarity 数字 PCR 探针预混液JN Medsys12013方案 3（表 1）：2xPCR 预混液
#10011 的组分
Clarity 封膜液JN Medsys12005方案 3：封膜液
#10011 的组分
Clarity JN 溶液JN Medsys12006方案 3（表 1）：20x dPCR 溶液
#10011 的组分
Clarity 管条JN Medsys12007方案 3：管中芯片
#10011 的组分
Clarity 样品加样试剂盒JN Medsys12008方案 3：加样平台和滑片
#10011 的组分
Clarity 自动加样器JN Medsys11002方案 3：自动加样器
#10001 的组分
Clarity 封膜增强剂JN Medsys11003方案 3：封膜增强剂
#10001 的组分
Clarity 读取仪JN Medsys11004方案 3：读取仪
#10001 的组分
Life Eco 梯度 PCR 仪Bioer TechnologyTC-96GHbC方案 3：PCR 仪
Clarity 软件JN Medsys随 #10001 捆绑提供方案 3：分析软件
高灵敏度 D1000 筛查胶带Agilent Technologies5067-5584方案 4：高灵敏度凝胶装置

参考文献

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