一种用于高通量筛选的平台 沙门氏菌 种（复数形式）/志贺氏菌 种（spp.）

摘要

Salmonella spp./Shigella spp. 是导致腹泻的常见病原体。本文介绍一种高通量平台，用于通过实时 PCR 结合导向培养法对 Salmonella spp./Shigella spp. 进行筛查。

摘要

急性胃肠炎的粪口传播时有发生，尤其是在处理食物和水源的人员感染了Salmonella spp./Shigella spp. 的情况下。检测Salmonella spp./Shigella spp. 的金标准方法是直接培养法，但该方法费时费力。本文介绍一种结合实时聚合酶链式反应（PCR）与引导培养的高通量Salmonella spp./Shigella spp. 筛查平台。该方法包含两个主要阶段：实时PCR和引导培养。在第一阶段（实时PCR）中，我们详细说明该方法的各个步骤：样本采集、前增菌、DNA提取和实时PCR检测。若实时PCR结果为阳性，则进入第二阶段（引导培养）：选择性培养、生化鉴定和血清学分型。我们还展示了该流程产生的代表性结果。本文所述方案可作为快速、特异、灵敏且高通量筛查Salmonella spp./Shigella spp. 的有效平台。

引言

腹泻仍然是全球范围内发病率较高的常见健康问题^1,2。尽管其死亡率相对较低，但部分患者会出现持续数周的各种症状（如稀便、水样便、排便急迫感），导致较高的社会经济负担^3,4。更严重的是，若未及时治疗，部分患者甚至可能发展为肠易激综合征⁵。可引起腹泻的病原体包括多种细菌、病毒和寄生虫⁶。Salmonella spp./Shigella spp. 是导致急性胃肠炎传播最常见的细菌之一^7,8,9,10,11。因此，许多国家已出台法律法规，要求对从事食品和饮用水相关工作的人员定期进行 Salmonella spp./Shigella spp. 筛查。例如，中国政府已颁布法规，规定每年必须进行一次 Salmonella spp./Shigella spp. 强制性筛查。

金标准方法用于 沙门氏菌 种（复数形式）/志贺氏菌 细菌培养是检测菌种的常用方法。通过细菌培养以及后续的生化鉴定和血清学表征，我们可以确定细菌的种类，这有助于疾病暴发的管理和抗菌药物谱的建立，从而辅助患者的治疗¹²它还可以帮助追踪感染的来源 沙门氏菌 种（复数）/志贺氏菌 种爆发¹³然而，该方法耗时耗力（需要手动操作），尤其在检测大量样本时需花费数天时间⁷此外，活的但不可培养（VBNC） 沙门氏菌 种（复数形式）/志贺氏菌 sp.（复数：spp.）可能存在于某些粪便样本中¹⁴鉴于这些缺点，许多实验室已尝试开发新的检测技术 沙门氏菌 种（复数）/志贺氏菌 sp.^{15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25}所有这些方法均采用核酸扩增检测（NAAT），其中聚合酶链式反应（PCR）最为常见。这类基于NAAT的方法存在一个主要局限性，即死亡细菌，甚至含有不完整基因组DNA的细菌碎片，也可能产生阳性结果²⁶，这可能在很大程度上影响疾病的准确诊断。Blanco 等 表明分子检测具有高度敏感性，不仅针对活的 沙门氏菌 在培养物中，以及来自既往感染或污染的不完整基因组和死亡或无活力的细菌²⁶因此，应开发新技术。

本文介绍了一种将基于核酸扩增技术（NAAT）的方法与培养法相结合的新方法。如图1所示，该新方法首先进行实时PCR筛查，然后将阳性样本送交细菌培养与鉴定。

方案

本方案遵循珠海国际旅行卫生保健中心人类研究伦理委员会制定的指南。实验过程中请采用标准的无菌操作。

1. 培养基成分与制备

1. 制备营养肉汤：将1%蛋白胨、0.3%牛肉浸膏、0.5%氯化钠、0.1%葡萄糖溶于H₂O中₂O，调节pH至7.5，于121 °C高压灭菌15分钟。
2. 制备亚硒酸盐胱氨酸培养基：溶解0.5%蛋白胨、0.4%乳糖、1% Na₂HCO₃，0.4% 亚硒酸氢钠，0.001% L-半胱氨酸在 H₂O，调节pH至7.0，并煮沸5分钟。
3. 制备木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂（XLD）平板：将0.3%酵母提取物、0.5% L-赖氨酸、0.375%木糖、0.75%乳糖、0.75%蔗糖、0.5%氯化钠、0.008%酚红、0.68%硫代硫酸钠、0.08%柠檬酸铁铵、0.25%脱氧胆酸钠、1.5%琼脂溶于H₂O中₂O，并调节pH至7.4。然后煮沸5分钟，倒入90 mm培养皿中。
4. 制备 沙门氏菌 显色培养基平板：将1.5%琼脂、0.7%蛋白胨和酵母提取物、1.29%选择性试剂溶解于H₂然后煮沸5分钟，倒入90 mm培养皿中。
5. 制备营养琼脂平板：将1%蛋白胨、0.3%牛肉提取物、0.5%氯化钠、1.5%琼脂溶于H₂O中₂O，并调节pH至7.3。随后在121 °C下高压灭菌15分钟，倒入90 mm培养皿中。
6. 制备麦康凯琼脂（MAC）平板：将2%蛋白胨、1%乳糖、0.5%氯化钠、0.5%OX胆盐、0.0025%中性红、1.5%琼脂、0.0001%结晶紫溶解于H₂O中₂O，并调节pH至7.2。随后在115 °C下高压灭菌20分钟，倒入90 mm培养皿中。

2. 实时 PCR

1. 样本采集
   1. 将肛拭子插入患者肛门内 3-5 cm 深处，旋转 360°。
   2. 将肛拭子放入无菌采样管中，标记样本编号。
   3. 尽快将样本送至实验室。
      注意：样本可在 4 °C 保存，但不得超过 24 小时。
2. 预增菌
   1. 向每支采样管中的样本加入 3 mL 营养肉汤。
   2. 在培养箱中 36 °C 培养 6 小时。
3. 样本混合（可选）
   1. 若样本数量超过 10 个，可从每份预增菌培养物中取 100 µL，将 8-10 个样本混合至一支 1.5 mL 离心管中。
   2. 正确标记。
4. DNA 提取
   1. 将预增菌培养物在 800 × g 离心 2 分钟，使大颗粒沉淀，转移上清液至新管中，在 12,000 × g 离心 5 分钟。用移液器吸弃上清液。
   2. 向沉淀中加入 100 µL DNA 提取液（0.01 M pH 8.0 Tris-EDTA，0.01% Nonidet P 40 (NP40)），剧烈涡旋振荡 1 分钟。
   3. 在干浴仪中 100 °C 煮沸 5 分钟。
   4. 在 12,000 × g 离心 5 分钟，用新管收集上清液，作为后续实时 PCR 分析的模板。
5. 实时 PCR
   1. 反应体系配制如下：每个样本加入 12.5 µL 2× 反应混合液，每种引物 0.4 µM，每种探针 0.2 µM（序列见表 1）²⁷，模板 5 µL（按步骤 2.4.4 制备），用 ddH₂O 补足至 25 µL 总体积。
   2. 循环程序设置如下：95 °C 预变性 3 分钟，随后进行 40 个循环（95 °C 变性 15 秒，55 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 34 秒）。在延伸步骤（72 °C）期间，由荧光实时 PCR 仪自动采集 6-羧基荧光素（FAM）和六氯荧光素（HEX）通道的荧光信号。
   3. 按照仪器说明书，在荧光实时 PCR 仪上进行实时 PCR 检测。
   4. 若 FAM/HEX 通道出现阴性结果，表明样本中沙门氏菌（Salmonella spp.）/志贺氏菌（Shigella spp.）为阴性，可直接进入第 4 步并出具阴性报告。
   5. 若 HEX 和/或 FAM 通道出现阳性结果，分别提示样本可能为志贺氏菌（Shigella spp.）和/或沙门氏菌（Salmonella spp.）阳性。
      注意：若在步骤 2.3 中进行了样本混合，则应对构成该阳性混合样本的各个单独样本重新进行实时 PCR 检测，以筛选出真正的阳性样本。

3. 指导性培养

1. Salmonella spp. PCR 阳性样本
   1. 选择性培养基培养
      1. 取 100 µL 前增菌培养物加入含有 5 mL 亚硒酸盐胱氨酸培养基的试管中。置于 36 °C 恒温培养箱中培养 18–24 小时。
   2. 平板分离培养
      1. 用微量接种环取一环培养物，在 XLD 平板或 Salmonella 显色琼脂平板上划线接种。置于 36 °C 恒温培养箱中培养 18–24 小时。
   3. 生化鉴定
      1. 在 XLD 平板上挑选可疑菌落（粉红色菌落，有或无黑色中心；黑色菌落；黄色菌落，有或无黑色中心）或在 Salmonella 显色琼脂平板上挑选可疑菌落（紫色或紫红色菌落，表面光滑且呈圆形）（图 2）。
      2. 根据仪器说明书，将可疑菌落接种至自动化微生物鉴定系统进行生化鉴定。
   4. 血清学分型
      1. O 抗原分型
         1. 取一滴 O 抗原多价血清滴加于洁净载玻片上。
         2. 用微量接种环取一环菌落，在血清中研磨混匀。
         3. 若出现类似流沙样凝集现象，则表明菌落与血清发生反应，进入步骤 3.1.4.1.4（图 3）；否则进入步骤 3.1.4.1.5。
         4. 使用 O 抗原单价血清重复步骤 3.1.4.1.1 至 3.1.4.1.3，直至确定特异性 O 抗原类型。
         5. 使用 Vi 血清重复步骤 3.1.4.1.1 至 3.1.4.1.3。将与 Vi 血清发生反应的菌落收集于试管中，在干浴器中 100 °C 煮沸 5 分钟，然后以 12,000 × g 离心 5 分钟。取沉淀物重复步骤 3.1.4.1.1 至 3.1.4.1.4，直至确定特异性 O 抗原类型。
      2. H 抗原分型
         1. 取一滴 H 抗原多价血清滴加于洁净载玻片上。
         2. 用微量接种环取一环菌落，在血清中研磨混匀。
         3. 若出现类似流沙样凝集现象，则表明菌落与血清发生反应，进入步骤 3.1.4.2.4。
         4. 使用 H 抗原单价血清重复步骤 3.1.4.2.1 至 3.1.4.2.3，直至确定特异性 H 抗原类型。
            注：有时需要进行血清诱导以鉴定第二相 H 抗原。如需诱导，请执行以下可选步骤。
         5. （可选）在营养琼脂平板上滴加一滴特异性 H 抗原血清，待血清完全吸收。
         6. （可选）用微量接种环取一环菌落，在已吸收特异性 H 抗原血清的平板上划线接种。置于 36 °C 恒温培养箱中培养 18–24 小时。
         7. （可选）使用 H 抗原单价血清重复步骤 3.1.4.2.1 至 3.1.4.2.3，直至鉴定出第二相 H 抗原。
         8. 进入步骤 4。
2. Shigella spp. PCR 阳性样本
   1. 平板分离培养
      1. 用微量接种环取一环前增菌培养物，在 XLD 平板或 MAC 平板上划线接种。置于 36 °C 恒温培养箱中培养 18–24 小时。
   2. 生化鉴定
      1. 在 XLD 平板上挑选可疑菌落（光滑、圆形、透明、红色菌落）或在 MAC 平板上挑选可疑菌落（光滑、圆形、透明、无色菌落，直径约 2–3 mm；Shigella sonnei 菌落可能较大，随培养时间延长逐渐变为淡粉色）（图 4）。
      2. 根据仪器说明书，将可疑菌落接种至自动化微生物鉴定系统进行生化鉴定。
   3. 血清学分型
      1. 取一滴 Shigella spp. 多价血清滴加于洁净载玻片上。
      2. 用微量接种环取一环菌落，在血清中研磨混匀。
      3. 若出现类似流沙样凝集现象，则表明菌落与血清发生反应，进入步骤 3.2.3.4。
      4. 使用 Shigella spp. 单价血清重复步骤 3.2.3.1 至 3.2.3.3，直至确定具体的 Shigella spp. 类型。
      5. 进入步骤 4。

4. 报告

1. 根据上述结果出具阳性或阴性报告。

结果

该方案用于对从事食品和饮用水处理人员的肛门粪便样本中沙门氏菌属（Salmonella spp.）和志贺氏菌属（Shigella spp.）的筛查。

在实时 PCR 步骤中，如图 5A所示，HEX 荧光通道中出现了成功扩增，表明该混合样本对沙门氏菌（Salmonella spp.）呈阳性。随后对该阳性混合样本所包含的各个独立样本进行进一步的实时 PCR 检测。如图 5B所示，样本 2 呈阳性。因此，选择样本 2 进行沙门氏菌（Salmonella spp.）的导向培养。在图 5C中，FAM 荧光通道中出现了...

讨论

由于 沙门氏菌 种（复数形式）/志贺氏菌 spp. 常与食物中毒及急性胃肠炎的粪-口传播有关^28,29 常规方法要么费时，要么费力⁷我们描述了一个用于高通量的平台 沙门氏菌 种（复数形式）/志贺氏菌 spp. 筛查，采用实时PCR结合导向培养法。

为充分发挥该平台的性能，需考虑若干步骤。第一步是样本在营养肉汤（Nutrient Broth）中的预增菌步骤（步骤2.2）。尽管对于有明显症状（如腹泻）患者的粪便样本无需进行预增菌步骤， 等等。，对于在食品和饮用水从业人员岗前体检时采集的肛拭子样本，仍需进行常规的6小时预增菌步骤，因为这类人群主要是健康或至少无症状的成年人。如果该方案仅用于检测 沙门氏菌 spp.，则可使用亚硒酸盐胱氨酸增菌液进行预增菌，以提高检测灵敏度。第二个关键步骤是可疑菌落的鉴定（步骤 3.1.3...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Tris	Sigma	10708976001
EDTA	Sigma	798681
NP40	Sigma	11332473001
ddH2O	Takara	9012
PrimeSTAR HS (Premix)	Takara	R040Q
营养肉汤	LandBridge	CM106
营养琼脂	LandBridge	CM107
亚硒酸盐胱氨酸培养基	LandBridge	CM225
XLD	LandBridge	CM219
MAC	LandBridge	CM908
Salmonella 显色琼脂	CHROMagar	SA130
Salmonella 诊断血清	天润	SAL60
Shigella 诊断血清	天润	SHI54
肛拭子（含采样管）	华辰阳
载玻片	明生	7102
微量接种环	维康康	W511
培养箱	精宏	DNP-9082
高压灭菌器	AUL	SS-325
干式恒温器	精宏	KB-20
全自动微生物鉴定系统	bioMérieux	VITEK2	可使用其他等效系统
荧光实时PCR仪	赛默飞世尔	ABI7500	可使用其他等效仪器