Salmonella spp./Shigella spp. 是导致腹泻的常见病原体。本文介绍一种高通量平台，用于通过实时 PCR 结合导向培养法对 Salmonella spp./Shigella spp. 进行筛查。
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本文内容
摘要
摘要
急性胃肠炎的粪口传播时有发生，尤其是在处理食物和水源的人员感染了Salmonella spp./Shigella spp. 的情况下。检测Salmonella spp./Shigella spp. 的金标准方法是直接培养法，但该方法费时费力。本文介绍一种结合实时聚合酶链式反应（PCR）与引导培养的高通量Salmonella spp./Shigella spp. 筛查平台。该方法包含两个主要阶段：实时PCR和引导培养。在第一阶段（实时PCR）中，我们详细说明该方法的各个步骤：样本采集、前增菌、DNA提取和实时PCR检测。若实时PCR结果为阳性，则进入第二阶段（引导培养）：选择性培养、生化鉴定和血清学分型。我们还展示了该流程产生的代表性结果。本文所述方案可作为快速、特异、灵敏且高通量筛查Salmonella spp./Shigella spp. 的有效平台。
引言
腹泻仍然是全球范围内发病率较高的常见健康问题1,2。尽管其死亡率相对较低，但部分患者会出现持续数周的各种症状（如稀便、水样便、排便急迫感），导致较高的社会经济负担3,4。更严重的是，若未及时治疗，部分患者甚至可能发展为肠易激综合征5。可引起腹泻的病原体包括多种细菌、病毒和寄生虫6。Salmonella spp./Shigella spp. 是导致急性胃肠炎传播最常见的细菌之一7,8,9,10,11。因此，许多国家已出台法律法规，要求对从事食品和饮用水相关工作的人员定期进行 Salmonella spp./Shigella spp. 筛查。例如，中国政府已颁布法规，规定每年必须进行一次 Salmonella....
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方案
本方案遵循珠海国际旅行卫生保健中心人类研究伦理委员会制定的指南。实验过程中请采用标准的无菌操作。
1. 培养基成分与制备
- 制备营养肉汤：将1%蛋白胨、0.3%牛肉浸膏、0.5%氯化钠、0.1%葡萄糖溶于H₂O中2O，调节pH至7.5，于121 °C高压灭菌15分钟。
- 制备亚硒酸盐胱氨酸培养基：溶解0.5%蛋白胨、0.4%乳糖、1% Na2HCO3，0.4% 亚硒酸氢钠，0.001% L-半胱氨酸在 H2O，调节pH至7.0，并煮沸5分钟。
- 制备木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂（XLD）平板：将0.3%酵母提取物、0.5% L-赖氨酸、0.375%木糖、0.75%乳糖、0.75%蔗糖、0.5%氯化钠、0.008%酚红、0.68%硫代硫酸钠、0.08%柠檬酸铁铵、0.25%脱氧胆酸钠、1.5%琼脂溶于H₂O中2O，并调节pH至7.4。然后煮沸5分钟，倒入90 mm培养皿中。
- 制备 沙门氏菌 显色培养基平板：将1.5%琼脂、0.7%蛋白胨和酵母提取物、1.29%选择性试剂溶解于H2然后煮沸5分钟，倒入90 mm培养皿中。
- 制备营养琼脂平板：将1%蛋白胨、0.3%牛肉提取物、0.5%氯化钠、1.5%琼脂溶于H₂O中2O，....
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结果
该方案用于对从事食品和饮用水处理人员的肛门粪便样本中沙门氏菌属（Salmonella spp.）和志贺氏菌属（Shigella spp.）的筛查。
在实时 PCR 步骤中，如图 5A所示，HEX 荧光通道中出现了成功扩增，表明该混合样本对沙门氏菌属（Salmonella spp.）呈阳性。随后对该阳性混合样本所包含的各个独立样本进行进一步的实时 PCR 检测。如图 5B所示，样本 2 呈阳性。因此，选择样本 2 进行沙门氏菌属（Salmonella spp.）的导向培养。在图 5C中，FAM 荧光通道中出.......
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讨论
由于 沙门氏菌 种（复数形式）/志贺氏菌 spp. 常与食物中毒及急性胃肠炎的粪-口传播有关28,29 常规方法要么费时，要么费力7我们描述了一个用于高通量的平台 沙门氏菌 种（复数形式）/志贺氏菌 spp. 筛查，采用实时PCR结合导向培养法。
为充分发挥该平台的性能，需考虑若干步骤。第一步是样本在营养肉汤（Nutrient Broth）中的预增菌步骤（步骤2.2）。尽管对于有明显症状（如腹泻）患者的粪便样本无需进行预增菌步骤， 等等。，对于在食品和饮用水从业人员岗前体检时采集的肛拭子样本，仍需进行常规的6小时预增菌步骤，因为这类人群主要是健康或至少无症状的成年人。如果该方案仅用于检测 沙门氏菌 spp.，则可使用亚硒酸盐胱氨酸增菌液进行预增菌，以提高检测灵敏度。第二个关键步骤是可疑菌落的鉴定（步骤 3.1.3.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了中国珠海市科技计划项目（项目编号 20171009E030064）、中国广东省科技计划项目（项目编号 2015A020211004）以及中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局科技计划项目（项目编号 2016IK302、2017IK224）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Tris | Sigma | 10708976001 | |
| EDTA | Sigma | 798681 | |
| NP40 | Sigma | 11332473001 | |
| ddH2O | Takara | 9012 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara | R040Q | |
| 营养肉汤 | LandBridge | CM106 | |
| 营养琼脂 | LandBridge | CM107 | |
| 亚硒酸盐胱氨酸培养基 | LandBridge | CM225 | |
| XLD | LandBridge | CM219 | |
| MAC | LandBridge | CM908 | |
| Salmonella 显色琼脂 | CHROMagar | SA130 | |
| Salmonella 诊断血清 | 天润 | SAL60 | |
| Shigella 诊断血清 | 天润 | SHI54 | |
| 肛拭子（含采样管） | 华辰阳 | ||
| 载玻片 | 明生 | 7102 | |
| 微量接种环 | 维康康 | W511 | |
| 培养箱 | 精宏 | DNP-9082 | |
| 高压灭菌器 | AUL | SS-325 | |
| 干式恒温器 | 精宏 | KB-20 | |
| 全自动微生物鉴定系统 | bioMérieux | VITEK2 | 可使用其他等效系统 |
| 荧光实时PCR仪 | 赛默飞世尔 | ABI7500 | 可使用其他等效仪器 |
参考文献
- Roy, S. L., Scallan, E., Beach, M. J. The rate of acute gastrointestinal illness in developed countries. Journal of Water and Health. 4, Suppl 2 31-69 (2006).
- Wilking, H., et al. Acute gastrointestinal illness in adults in G....
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重印与许可
