由人胚胎干细胞衍生的适用于移植的视网膜色素上皮组织的构建

摘要

我们描述了一种构建视网膜组织的方法，该组织由人多能干细胞分化而来的视网膜色素上皮细胞组成，并将其培养于人羊膜上，进而制备用于动物模型移植的移植物。

摘要

眼部的多种病理状况会影响视网膜色素上皮（RPE）的功能和/或存活。这些疾病包括某些类型的视网膜色素变性（RP）和年龄相关性黄斑变性（AMD）。细胞治疗是目前提出用于治疗这些疾病最有前景的治疗策略之一，并已在人体中获得初步的积极结果。然而，移植物的制备方法对其在体内的功能效果具有显著影响。in vivo研究表明，以细胞悬液形式移植的RPE细胞，其功能表现低于以视网膜组织形式移植的相同细胞。本文介绍一种简单且可重复的RPE组织工程方法及其用于in vivo移植的制备流程。由人多能干细胞衍生的RPE细胞被接种于一种生物载体——人羊膜（hAM）上。与人工支架相比，该载体的优势在于其具有接近布鲁赫膜（Bruch's membrane）的基底膜结构，而内源性RPE细胞正是附着于布鲁赫膜上。然而，hAM的操作较为困难，因此我们开发了多种策略以实现其在体外的正确培养及用于in vivo移植前的适当处理。

引言

视网膜色素上皮（RPE）对其紧密关联的光感受器的存活和稳态至关重要¹。多种病理状态会改变其功能和/或存活能力，包括视网膜色素变性（RP）和年龄相关性黄斑变性（AMD）。

视网膜色素变性（RP）是一组影响光感受器细胞或视网膜色素上皮（RPE）细胞功能或同时影响这两类细胞的遗传性单基因突变疾病^2,3。据估计，仅影响RPE细胞的突变约占RP病例的5%²。年龄相关性黄斑变性（AMD）是另一种以RPE层发生改变为特征的疾病，最终导致中心视力丧失。AMD由遗传和环境因素的复杂相互作用引起，主要影响老年人群^4,5,6。根据预测，到2020年全球将有1.96亿患者受到AMD影响⁷。目前这些疾病尚无有效治愈手段，其中一种被提出的治疗策略是移植新的RPE细胞，以替代已死亡或功能丧失的原有RPE细胞⁸。

最终移植产品的制剂形式至关重要，以确保最佳的功能效果。以细胞悬液形式注射的视网膜色素上皮（RPE）细胞，尽管是一种简便且直接的递送方法，但其存活率、整合能力及功能表现仍令人担忧。^{9,10,11,12,13}科学家们目前正在开发更复杂的配方以递送工程化视网膜组织^{9,13,14,15,16}在此背景下，我们开发了一种原创方法以生成 体外 可用于移植的RPE组织⁹.

本方案中使用源自人类胚胎干细胞（ES 细胞）的视网膜色素上皮（RPE）细胞库。然而，也可采用其他来源的 RPE 细胞库（如人诱导性多能干细胞、原代 RPE 细胞， 等等。）并采用不同方法进行分化的细胞也适用于本方案。该方案包括使用细胞因子和/或小分子的定向分化方案。^{17,18,19,20,21,22}.

为了进行移植，工程化组织应在支架上制备。近年来，已开发出多种基于聚合物或生物来源基质的支架^13,23,24。本文所使用的生物基质为人羊膜（hAM），但也可采用其他基质，如去细胞的布鲁赫膜。本方法的优势在于使用了一种更接近视网膜色素上皮（RPE）天然微环境的生物支架。

人胚胎干细胞分化的RPE细胞需培养至少4周，以完全形成鹅卵石状单层结构。在此阶段，所获得的上皮组织具有功能性和极性⁹。最后，由于该组织容易皱缩，需将其包埋于一层薄的水凝胶载体中，以增强其刚性和弹性，并在注射过程中提供保护。该产品随后在4 °C保存，直至移植使用。

方案

本方案中使用的所有人类材料均按照欧盟法规进行使用。本研究中使用的人类胚胎干细胞系来源于一个独特的胚胎。捐赠该胚胎的夫妇已充分知情，并同意进行匿名捐赠。该胚胎经由Roslin Cells公司（英国）建立了符合临床级标准的人类胚胎干细胞系，并完成了细胞库建立、质量鉴定和相关文件记录。人羊膜细胞（hAMs）是在签署知情同意书同意捐赠胎盘的产妇进行剖宫产手术期间，按照医院指南（APHP，圣路易医院）在无菌条件下获取的。

1. 培养基与试剂的制备

1. RPE细胞培养基的制备
   1. 配制RPE细胞培养基时，将4%血清替代物（终体积500 mL时为20 mL）、1,000倍稀释的2-巯基乙醇（终体积500 mL时为500 µL）和1% Eagle′s最低必需培养基（MEM）非必需氨基酸溶液（终体积500 mL时为5 mL）加入高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，终体积500 mL时为475 mL）中。
2. 转运/保存培养基的制备
   1. 制备转运/保存培养基时，向500 mL终体积的培养基中加入1%的青霉素-链霉素溶液（5 mL）。₂-独立培养基（最终体积500 mL，使用495 mL），4 °C保存。
3. 热蛋白酶的重悬
   1. 蛋白酶溶液的配制
      1. 将储存于 -20 °C 的嗜热菌蛋白酶粉末在室温下解冻，以配制其储备液。
      2. 由于酶活性在不同批次间可能存在差异，应根据所用批次热蛋白酶粉末随附的分析证书计算该活性。将 "活性中性蛋白酶计算值 = ANPC" （见分析证书）乘以181（即酪氨酸的分子量）。所得结果对应于所提供的嗜热菌蛋白酶粉末的总酶活性（U/瓶）。
      3. 通过将每瓶总酶活性（U/瓶）除以200（U/mL）计算所需水量，用该体积的水配制200 U/mL的储备液。
      4. 用移液器反复吹打加入的水以溶解酶。涡旋振荡溶液30秒，检查粉末是否已完全悬浮。可能需要进一步吹打以确保完全溶解。
      5. 将储备液分装后于 -20 °C 保存。
   2. 嗜热菌蛋白酶工作液的配制
      注意：热蛋白酶溶液必须在人羊膜处理当天配制。
      1. 在200 U/mL浓度下储存于-20 °C的嗜热菌蛋白酶储备液中，将其分装物解冻。用磷酸盐缓冲液（PBS）将储备液稀释200倍，以获得终酶活性为1 U/mL的工作液。每处理1–4片人羊膜（hAM）组织片，需准备40 mL工作液。
      2. 使用前，将嗜热菌蛋白酶溶液经0.2 µm滤膜过滤。
4. 明胶的重悬
   1. 20% 明胶溶液的制备与包埋
      注意：20% 明胶溶液和凝块可提前 1 周配制备用。
      1. 将 CO 预热₂-独立培养基置于42 °C水浴中30分钟（最长1小时）。在50 mL离心管中，将10 g明胶加入40 mL预热的CO₂₂-不含血清的培养基中涡旋混匀。
      2. 在 42 °C 下溶解明胶 30–60 分钟。每 10 分钟涡旋振荡一次，以使溶液均匀。
      3. 待溶液混匀后，向四个6 cm培养皿中各加入4 mL 20%明胶溶液。避免产生气泡。用塑料封口膜覆盖培养皿以作保护，于4 °C静置使其凝固。
   2. 8% 明胶溶液的制备
      注意：8% 明胶溶液可提前一天配制，并于 4 °C 保存。
      1. 将 CO 预热₂-独立培养基升温至 42 °C，持续 30 分钟（最长 1 小时）。在 50 mL 离心管中，将 4 g 明胶加入 46 mL 温热的 CO₂-不含血清的培养基中涡旋混匀。
      2. 将明胶在 42 °C 下溶解 30–60 分钟。若当天使用，需在管口覆盖一层塑料石蜡膜，并置于 37 °C 水浴中保存；若需后续使用，则在 4 °C 下储存。

2. 人羊膜的嗜热菌蛋白酶处理

1. 人羊膜清洗
   1. 将人羊膜（hAM）以小片形式（约 30 mm × 30 mm）固定在尼龙支架上，置于 PBS 中并保持在 4 °C，或以冷冻状态提供。若为冷冻状态，需在 37 °C 培养箱中解冻 30 分钟。
   2. 清洗羊膜：
      1. 将 1–4 片羊膜放入一个含有 80 mL PBS 的 250 mL 瓶中。根据需要使用多个瓶子。
      2. 将每个瓶子置于摇床中以高速振荡 5 分钟，弃去 PBS。加入 80 mL PBS，重复一次。
2. 嗜热菌蛋白酶处理
   1. 每瓶含羊膜的瓶子（每瓶含 1–4 片羊膜；每次最多处理 3 瓶）加入 40 mL 嗜热菌蛋白酶工作液（1 U/mL）。
   2. 将瓶子在 450 rpm 条件下振荡 5 分钟，然后涡旋 30 秒。重复一次。
   3. 弃去嗜热菌蛋白酶溶液，加入 80 mL PBS。
   4. 将瓶子在 450 rpm 条件下振荡 5 分钟，弃去 PBS，再加入 80 mL PBS。重复此洗涤步骤 3 次。

3. 在培养插件上固定人羊膜

1. 使用能够触及瓶底的长柄无菌镊子，逐个取出人羊膜（hAM），并将每张人羊膜转移至含有10 mL PBS的10 cm培养皿中。
2. 在另一个含有10 mL PBS的10 cm培养皿中，将其中一张羊膜放置于尼龙网朝下的位置。松开用于固定羊膜至尼龙网的四个夹子中的两个。
3. 将培养插件的小环插入尼龙网与羊膜之间。
4. 确保羊膜完全覆盖小环。将培养插件的上半部分夹在羊膜上方，使人羊膜的基底膜朝上位于培养插件内部。随后取下剩余的两个夹子。
5. 如有必要，用无菌剪刀剪去培养插件外多余的羊膜组织。用镊子将固定在培养插件中的羊膜转移至12孔板中，加入PBS，并将板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中保存。
6. 对其他羊膜重复上述操作（从步骤3.2至3.5）。

4. 视网膜色素上皮细胞在人羊膜上的解冻与接种

1. 视网膜色素上皮细胞的解冻
   1. 视网膜色素上皮细胞库以每支冻存管100万个细胞的数量在液氮中冻存。根据需要解冻相应数量的冻存管（每张膜接种35万个细胞）。
   2. 每支冻存管准备一个15 mL离心管，内含3 mL RPE培养基。冻存管解冻后，将细胞转移至各离心管中。对其他冻存管重复此操作。
   3. 混匀（用移液器上下吹打数次，使细胞在RPE培养基中重悬），取10 µL细胞悬液转移至1.5 mL离心管中，加入10 µL台盼蓝染液。取15 µL该混合液加入细胞计数板，在显微镜下用4倍物镜计数活细胞数量（未被染成蓝色的细胞）。对其他冻存管重复此操作。
   4. 同时，将15 mL离心管在110 × g 条件下离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于培养基中，调整细胞密度为700,000个细胞/mL。
2. 将视网膜色素上皮细胞接种至人羊膜上
   1. 从培养箱中取出含有羊膜的12孔板。
   2. 吸除PBS。在培养插件中央加入500 µL步骤4.1.4中制备的细胞悬液。在培养插件外侧（即孔内）加入1 mL RPE培养基。对其他羊膜重复此操作。
   3. 将含有羊膜的12孔板放回培养箱中继续培养。

5. 人羊膜上视网膜色素上皮细胞培养的维持

1. 每周更换两次培养基，通常在周一和周五，持续至培养的第30天或更长时间。
2. 吸去每个孔中培养插件内部和外部的培养基，并更换为新鲜培养基（培养插件外部加入1 mL，内部加入500 µL）。将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中。

6. 视网膜色素上皮移植片的制备

注意：培养至第30天时，组织即可用于移植。

1. 将8%明胶溶液在37 °C水浴中预热30分钟。用预冷的CO₂₂-不含血清的培养基（4 °C）
2. 将20%明胶块放入振动切片机中。
   1. 从冰箱中取出含有20%明胶块的6 cm培养皿。使用手术刀切出一块5 cm × 5 cm的明胶块。将明胶块的上表面用氰基丙烯酸酯胶水或其等效粘合剂粘附至支撑物上。
   2. 在振动切片机中安装新刀片。
   3. 调节模块的高度，直至其与剃刀刀片处于同一水平。
   4. 用新鲜的CO₂饱和溶液填充支撑物周围的浴槽₂-独立培养基中，4 °C 下用振动切片机以中等速度切割组织块，直至切面均匀平整。将位置设为 0。
   5. 吸干明胶块周围的培养基，直至完全干燥，然后从37 °C培养箱中取出含有组织的12孔培养板。
   6. 使用镊子小心地将培养插件在明胶块上打开。用剪刀剪去所有不含细胞的膜部分（即未进行细胞培养的环外部分）。吸除所有残留培养基。
   7. 加入1 mL 37 °C的液体8%明胶溶液以覆盖膜。小心去除多余液体。静置5–8分钟，使明胶凝固。
   8. 加入新鲜的CO₂-独立的介质（4 °C）加入浴槽中，直至覆盖膜。
   9. 使用振动切片机在 -100 µm 位置以中等速度进行切割，同时注意观察组织块的状态。切片结束时，需小心保持组织的方向性。
   10. 用手术刀切去一个角以确定切片的方向。
   11. 用刮勺收集嵌入明胶中的膜，置于盛有保存液的6孔板中，于4 °C保存，直至移植到受体眼内。
   12. 移植时，在手术显微镜下根据受体眼球大小调整移植物尺寸（大鼠为1–3 mm，10–15 mm）² 用于非人灵长类动物）。

结果

人羊膜（hAM）含有上皮层，在接种视网膜色素上皮（RPE）细胞前应将其去除。通过在振荡条件下使用嗜热菌蛋白酶（thermolysin）对膜进行酶处理。为避免丢失膜的方向性（上皮层位于一侧），需将膜固定在支撑物上，支撑物的材质可能因供应商而异（图1A）。在此步骤中检查膜与支撑物之间的粘附情况，必要时添加夹子固定。将膜固定于培养插件时，操作应轻柔，避免在膜上产生孔洞，并保持其极性，使基底膜面朝上（图1B）。当细胞接种到膜上时，若存在孔洞，细胞可能从孔洞中逸出，导致最终细胞浓度降低。可通过显微镜观察，或向培养插件内加入磷酸盐缓冲液（PBS）并检查是否有渗漏，来判断是否存在孔洞。任何有孔洞的膜均应弃用。

在培养插件固定后，通过相差显微镜评估膜上是否存在残留细胞（图1C 和 1D

讨论

我们描述了一种在生物支架上培养视网膜色素上皮（RPE）细胞的方法，并介绍了其在动物模型中移植前的制备步骤。该方案中的一个关键步骤是在整个操作过程中始终保持羊膜（hAM）的方向性，直至将其包埋入明胶中。实际上，需去除膜上的天然上皮层，使其基底膜暴露⁹。RPE细胞必须接种于该暴露的基底膜表面。在进行明胶包埋准备时，至关重要的是所有试剂均需在规定温度下操作。因为明胶在4 °C时呈固态，而在体温（37 °C）时呈液态⁹。若未严格控制温度，明胶可能在不期望的步骤中提前凝固或液化。

已提出多种生物支架，例如Descemet膜²⁵或人羊膜（hAMs）²⁶。特别是来自剖宫产手术获取的人羊膜²⁷，已被证明在视网膜下腔具有良好的耐受性，仅引起轻微炎症反应，并可减少脉络膜新生血管形成²⁶。该膜能够成功支持人视网膜色素上皮...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无菌生物安全柜	TechGen International	不适用
用于抽吸的液体废液处理系统	Vacuubrand	BVC 21
CO2控制的37 °C细胞培养箱	Thermo Electron Corporation	BVC 21 NT
200 µL移液器：P200	Gilson	F144565
1 mL移液器：P1000	Gilson	F144566
移液辅助器	Drummond	75001
4 °C冰箱	Liebherr	不适用
振动切片机	Leica	VT1000S
精细剪刀	WPI	501758
镊子（×2）	WPI	555227F
水浴锅	Grant subaqua pro	SUB6
精密天平	Sartorius	CP225D
离心机	Eppendorff	5804
显微镜	Olympus	SC30
水平往复摇床	IKA-WERKE	IKA MTS 214D
涡旋振荡器	VWR	LAB DANCER S40
一次性手术刀	WPI	500351
塑料石蜡膜	VWR	PM992
0.200 µm一次性针头滤器	SARTORIUS	16532
50 mL无针头注射器	Dutscher	50012
250 mL瓶	Dutscher	28024
15 mL无菌Falcon管	Dutscher	352097
50 mL无菌Falcon管	Dutscher	352098
培养插件	Scaffdex	C00001N
60 mm细胞培养皿：B6	Dutscher	353004
12孔细胞培养板	Corning	3512
6孔细胞培养板	Corning	3506
剃须刀片	Ted Pella, Inc	121-9
氰基丙烯酸酯胶水	Castorama	3178040670105
PBS 1×（500 mL）	Sigma	D8537
嗜热菌蛋白酶	Roche	5339880001
DMEM，高糖，含GlutaMAX	Invitrogen	61965-026
KSR CTS（KnockOut SR XenoFree CTS）	Invitrogen	12618-013
MEM-NEAA（100×）	Invitrogen	11140-035
β-巯基乙醇（50 mM）	Invitrogen	31350-010
青霉素/链霉素	Invitrogen	15140122
CO2非依赖性培养基	GIBCO	18045-054
明胶	MERCK	104078
人羊膜	巴黎圣路易医院组织库（法国巴黎）	不适用