由人胚胎干细胞衍生的适用于移植的视网膜色素上皮组织的构建

摘要

我们描述了一种构建视网膜组织的方法，该组织由人多能干细胞分化而来的视网膜色素上皮细胞组成，并将其培养于人羊膜上，进而制备用于动物模型移植的移植物。

摘要

眼部的多种病理状况会影响视网膜色素上皮（RPE）的功能和/或存活。这些疾病包括某些类型的视网膜色素变性（RP）和年龄相关性黄斑变性（AMD）。细胞治疗是目前提出用于治疗这些疾病最有前景的治疗策略之一，并已在人体中获得初步的积极结果。然而，移植物的制备方法对其在体内的功能效果具有显著影响。in vivo研究表明，以细胞悬液形式移植的RPE细胞，其功能表现低于以视网膜组织形式移植的相同细胞。本文介绍一种简单且可重复的RPE组织工程方法及其用于in vivo移植的制备流程。由人多能干细胞衍生的RPE细胞被接种于一种生物载体——人羊膜（hAM）上。与人工支架相比，该载体的优势在于其具有接近布鲁赫膜（Bruch's membrane）的基底膜结构，而内源性RPE细胞正是附着于布鲁赫膜上。然而，hAM的操作较为困难，因此我们开发了多种策略以实现其在体外的正确培养及用于in vivo移植前的适当处理。

引言

视网膜色素上皮（RPE）对其紧密关联的光感受器的存活和稳态至关重要¹。多种病理状态会改变其功能和/或存活能力，包括视网膜色素变性（RP）和年龄相关性黄斑变性（AMD）。

视网膜色素变性（RP）是一组影响光感受器细胞或视网膜色素上皮（RPE）细胞功能或同时影响这两类细胞的遗传性单基因突变疾病^2,3。据估计，仅影响RPE细胞的突变约占RP病例的5%²。年龄相关性黄斑变性（AMD）是另一种以RPE层发生改变为特征的疾病，最终导致中心视力丧失。AMD由遗传和环境因素的复杂相互作用引起，主要影响老年人群^4,5,6。根据预测，到2020年全球将有1.96亿患者受到AMD影响⁷。目前这些疾病尚无有效治愈手段，其中一种被提出的治疗策略是移植新的RPE细胞，以替代已死亡或功能丧失的原有RPE细胞⁸。

最终移植产品的制剂形式至关重要，以确保最佳的功能效....

方案

本方案中使用的所有人类材料均按照欧盟法规进行使用。本研究中使用的人类胚胎干细胞系来源于一个独特的胚胎。捐赠该胚胎的夫妇已充分知情，并同意进行匿名捐赠。该胚胎经由Roslin Cells公司（英国）建立了符合临床级标准的人类胚胎干细胞系，并完成了细胞库建立、质量鉴定和相关文件记录。人羊膜细胞（hAMs）是在签署知情同意书同意捐赠胎盘的产妇进行剖宫产手术期间，按照医院指南（APHP，圣路易医院）在无菌条件下获取的。

1. 培养基与试剂的制备

1. RPE细胞培养基的制备
   1. 配制RPE细胞培养基时，将4%血清替代物（终体积500 mL时为20 mL）、1,000倍稀释的2-巯基乙醇（终体积500 mL时为500 µL）和1% Eagle′s最低必需培养基（MEM）非必需氨基酸溶液（终体积500 mL时为5 mL）加入高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，终体积500 mL时为475 mL）中。
2. 转运/保存培养基的制备
   1. 制备转运/保存培养基时，向500 mL终体积的培养基中加入1%的青霉素-链霉素溶液（5 mL）。₂-独立培养基（最终体积500 mL，使用495 mL），4 °C保存。
3. 热蛋白酶的重悬

结果

人羊膜（hAM）含有上皮层，在接种视网膜色素上皮（RPE）细胞前应将其去除。通过在振荡条件下使用嗜热菌蛋白酶（thermolysin）对膜进行酶处理。为避免丢失膜的方向性（上皮层位于一侧），需将膜固定在支撑物上，支撑物的材质可能因供应商而异（图1A）。在此步骤中检查膜与支撑物之间的粘附情况，必要时添加夹子固定。将膜固定于培养插件时，操作应轻柔，避免在膜上产生孔洞，并保持其极性，使基底膜面朝上（图1B）。当细胞接种到膜上时，若存在孔洞，细胞可能从孔洞中逸出，导致最终细胞浓度降低。可通过显微镜观察，或向培养插件内加入磷酸盐缓冲液（PBS）并检查是否有渗漏，来判断是否存在孔洞。任何有孔洞的膜均应弃用。

在培养插件固定后，通过相差显微镜评估膜上是否存在残留细胞（图1C 和 1D

讨论

我们描述了一种在生物支架上培养视网膜色素上皮（RPE）细胞的方法，并介绍了其在动物模型中移植前的制备步骤。该方案中的一个关键步骤是在整个操作过程中始终保持羊膜（hAM）的方向性，直至将其包埋入明胶中。实际上，需去除膜上的天然上皮层，使其基底膜暴露⁹。RPE细胞必须接种于该暴露的基底膜表面。在进行明胶包埋准备时，至关重要的是所有试剂均需在规定温度下操作。因为明胶在4 °C时呈固态，而在体温（37 °C）时呈液态⁹。若未严格控制温度，明胶可能在不期望的步骤中提前凝固或液化。

已提出多种生物支架，例如Descemet膜²⁵或人羊膜（hAMs）²⁶。特别是来自剖宫产手术获取的人羊膜²⁷，已被证明在视网膜下腔具有良好的耐受性，仅引起轻微炎症反应，并可减少脉络膜新生血管形成²⁶。该膜能够成功支持人视网膜色素上皮.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无菌生物安全柜	TechGen International	不适用
用于抽吸的液体废液处理系统	Vacuubrand	BVC 21
CO2控制的37 °C细胞培养箱	Thermo Electron Corporation	BVC 21 NT
200 µL移液器：P200	Gilson	F144565
1 mL移液器：P1000	Gilson	F144566
移液辅助器	Drummond	75001
4 °C冰箱	Liebherr	不适用
振动切片机	Leica	VT1000S
精细剪刀	WPI	501758
镊子（×2）	WPI	555227F
水浴锅	Grant subaqua pro	SUB6
精密天平	Sartorius	CP225D
离心机	Eppendorff	5804
显微镜	Olympus	SC30
水平往复摇床	IKA-WERKE	IKA MTS 214D
涡旋振荡器	VWR	LAB DANCER S40
一次性手术刀	WPI	500351
塑料石蜡膜	VWR	PM992
0.200 µm一次性针头滤器	SARTORIUS	16532
50 mL无针头注射器	Dutscher	50012
250 mL瓶	Dutscher	28024
15 mL无菌Falcon管	Dutscher	352097
50 mL无菌Falcon管	Dutscher	352098
培养插件	Scaffdex	C00001N
60 mm细胞培养皿：B6	Dutscher	353004
12孔细胞培养板	Corning	3512
6孔细胞培养板	Corning	3506
剃须刀片	Ted Pella, Inc	121-9
氰基丙烯酸酯胶水	Castorama	3178040670105
PBS 1×（500 mL）	Sigma	D8537
嗜热菌蛋白酶	Roche	5339880001
DMEM，高糖，含GlutaMAX	Invitrogen	61965-026
KSR CTS（KnockOut SR XenoFree CTS）	Invitrogen	12618-013
MEM-NEAA（100×）	Invitrogen	11140-035
β-巯基乙醇（50 mM）	Invitrogen	31350-010
青霉素/链霉素	Invitrogen	15140122
CO2非依赖性培养基	GIBCO	18045-054
明胶	MERCK	104078
人羊膜	巴黎圣路易医院组织库（法国巴黎）	不适用