综合评估胎盘靶向药物递送的有效性与安全性的三种互补方法

摘要

我们介绍一种利用三种方法评估靶向胎盘药物递送安全性和有效性的系统：体内成像用于监测纳米颗粒的聚集，高频超声用于监测胎盘和胎儿发育，高效液相色谱法（HPLC）用于定量组织中的药物递送量。

摘要

目前尚无针对胎盘相关妊娠并发症的有效治疗方法，而开发能够将药物靶向递送至胎盘、同时尽量减少对胎儿和母体副作用的策略仍面临挑战。靶向纳米颗粒载体为治疗胎盘疾病提供了新的机遇。我们近期证明，一种合成的胎盘硫酸软骨素A结合肽（plCSA-BP）可用于引导纳米颗粒将药物递送至胎盘。在本实验方案中，我们详细描述了一种评估plCSA-BP介导药物向胎盘递送效率的系统，该系统联合使用三种独立方法：体内成像、高频超声（HFUS）和高效液相色谱法（HPLC）。通过体内成像技术，可在活体动物胎盘中观察到plCSA-BP引导的纳米颗粒；而HFUS和HPLC结果表明，与plCSA-BP偶联的纳米颗粒能够高效且特异性地将甲氨蝶呤递送至胎盘。因此，这三种方法的联合应用可作为实现药物靶向递送至胎盘的有效工具，并有助于开发多种妊娠并发症的新型治疗策略。

引言

胎盘介导的妊娠并发症，包括子痫前期、妊娠丢失、胎盘早剥和小于胎龄儿（SGA），较为常见，并导致显著的胎儿和孕产妇发病率和死亡率^1,2,3，而目前仅有极少数药物被证实对治疗妊娠相关疾病有效^4,5。在现代药物治疗中，开发更具选择性和安全性的靶向胎盘药物递送策略仍面临挑战。

近年来，多项研究聚焦于通过用肽或抗体包被纳米颗粒作为靶向胎盘的工具，实现药物向子宫胎盘组织的靶向递送。这些工具包括抗表皮生长因子受体（EGFR）⁶抗体、肿瘤归巢肽（CGKRK和iRGD）⁷、胎盘靶向肽⁸、胎盘血管靶向肽⁹以及抗催产素受体抗体¹⁰。

在此，我们证明了一种合成的胎盘硫酸软骨素A结合肽（plCSA-BP）可用于将纳米颗粒及其药物有效载荷靶向递送至胎盘¹¹。plCSA-BP引导的纳米颗粒与已报道的子宫胎盘靶向方法相辅相成，因其可靶向胎盘滋养层细胞。

作为一种非侵入性方法， 体内 成像技术已被用于监测小鼠胎盘特异性基因表达¹²，且吲哚菁绿（ICG）已广泛用于通过荧光成像系统追踪纳米颗粒^13,14,15因此，我们通过静脉注射负载吲哚菁绿（ICG）的plCSA-BP偶联纳米颗粒（plCSA-INPs），利用荧光成像仪观察plCSA-INPs在妊娠小鼠体内的分布情况。随后，我们将负载甲氨蝶呤（MTX）的plCSA-NPs通过静脉注射给予妊娠小鼠。高频超声（HFUS）是另一种无创、实时的成像工具。^16,17 用于监测小鼠胎儿和胎盘的发育情况。最后，我们采用高效液相色谱法（HPLC）定量分析甲氨蝶呤（MTX）在胎盘和胎儿中的分布。

在本实验方案中，我们详细描述了用于评估由plCSA-BP引导的纳米载体实现胎盘靶向药物递送效率的三种方法体系。

方案

所有小鼠实验均严格遵循中国科学院深圳先进技术研究院动物护理和使用委员会批准的方案（SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232）。

1. 靶向胎盘硫酸软骨素A的脂质-聚合物纳米颗粒的合成

1. 按照文献中详细描述的方法，合成载有MTX和ICG的脂质-聚合物纳米颗粒（分别为MNPs和INPs）以及plCSA-BP偶联的纳米颗粒（plCSA-MNPs和plCSA-INPs）¹⁸。

2. 体内 荧光成像

1. 孕鼠的准备
   1. 将雌性CD-1小鼠（8–12周龄）与同品系的可育雄鼠按1:2的比例（雄:雌）于下午放入同一笼中，次日清晨检查阴道栓。若观察到阴道栓，则将该小鼠定义为胚胎发育第0.5天（E0.5）。
   2. 将怀孕小鼠单独饲养于无病原体动物房中，保持14小时光照/10小时黑暗的循环条件，并自由摄食和饮水，直至E14.5。
2. 纳米颗粒的静脉注射
   1. 操作前，通过0.22 μm注射器滤器过滤对纳米颗粒进行灭菌。在E11.5时称量孕鼠体重，以确定纳米颗粒注射的剂量和体积。
      注意：纳米颗粒注射体积应小于孕鼠体重的1%（体积/体重）。例如，25 g小鼠的纳米颗粒注射体积应小于0.25 mL。
   2. 为扩张尾静脉，使用加热垫对尾部加热5–10分钟。
   3. 注射前，用28号胰岛素注射器吸取INPs或plCSA-INPs。
   4. 将孕鼠转移至固定装置中，使其固定并暴露尾静脉。用酒精棉片清洁尾部，随后将注射器刺入尾静脉。在5–10秒内以均匀压力缓慢注射INPs或plCSA-INPs（ICG等效剂量为5 mg/kg）。
      注意：若尾部出现水疱，应立即停止注射，此现象表明针头未进入静脉。不同小鼠之间不得共用注射器，以最大限度减少疾病传播和交叉污染。
   5. 记录注射时间。同时，对注射部位施加轻柔压力直至出血停止，通常需要30–60秒。
3. 活体成像
   1. 注射后30分钟，使用活体荧光成像系统对孕鼠进行成像。
   2. 在麻醉机的诱导室中，以1.0 L/min的氧气流速和2–4%异氟烷对孕鼠进行麻醉，并通过观察其呼吸是否缓慢且规律来确认麻醉完全。随后将小鼠转移至成像室，将其保持仰卧位放置于成像腔内。
   3. 将鼻罩覆盖于口鼻处，以1.0 L/min的氧气流速供给1–2%异氟烷，维持麻醉状态。
   4. 选择2D荧光和摄影参数以采集ICG荧光信号。将曝光模式设为自动，激发/发射波长设为710/820 nm。
   5. 成像结束后，关闭异氟烷气流以终止麻醉，并小心将孕鼠放回饲养笼中。
   6. 在纳米颗粒注射后48小时，使用异氟烷麻醉孕鼠，随后通过颈椎脱臼法处死母鼠。使用Graefe镊、Graefe组织镊和解剖剪收集胎鼠和胎盘。
   7. 将胎盘和胎鼠放入成像腔中，按照步骤2.3.4所述方法进行成像。

3. 胚胎发育的高频超声评估

1. 动物模型
   1. 按照步骤 2.1 所述获取并准备怀孕小鼠。
   2. 在 E6.5 天使用高频超声（HFUS）对怀孕小鼠进行成像（见方案 3.2 和 3.3.3）。首先在 E6.5 天通过可视化胚胎确认妊娠，然后将怀孕小鼠随机分为三组：MNP 组、plCSA-MNP 组和磷酸盐缓冲盐水（PBS）组。
   3. 从 E6.5 天开始，每隔一天通过尾静脉向怀孕小鼠注射 PBS、MNPs 或 plCSA-MNPs（相当于 1 mg/kg MTX），具体操作见步骤 2.2。
2. 成像前准备
   1. 在注射纳米颗粒 24 小时后，使用 HFUS 成像系统对怀孕小鼠进行成像。
   2. 按照步骤 2.3.2 所述对怀孕小鼠进行麻醉。打开成像平台的集成温控系统，并将平台预热至 37–42 °C。用胶带将怀孕小鼠固定在平台上，保持仰卧位。
   3. 将连接至麻醉机的鼻罩覆盖在小鼠口鼻部。使用 2% 异氟烷，氧气流速为 1.0 L/min，以维持稳定的麻醉状态。
   4. 使用脱毛膏对腹部进行化学脱毛。用浸水纱布彻底擦除残留的脱毛膏，然后在腹部涂抹超声耦合凝胶。
3. 成像操作流程
   1. 将 40 MHz 探头安装至机械臂上。
   2. 调整探头位置，使胎儿和胎盘的纵向图像显示在焦点区域内。
   3. B 模式成像与分析
      注：参见 视频 1。
      1. 点击 B 模式 按钮，将探头缓慢下移至腹部，直至显示胎儿和胎盘图像。按下 扫描/冻结 按钮以开始或停止成像，按下 动态存储 按钮保存动态图像序列，按下 帧存储 按钮保存单帧图像。
      2. 点击 测量 按钮，分析孕囊长度（GS）、胎儿顶臀长（CRL）、双顶径（BPD）、腹围（AC）、胎盘直径（PD）和胎盘厚度（PT）。
   4. PW 多普勒成像与分析
      注：参见 视频 1。
      1. 在相同扫描切面上，点击 PW 按钮，将取样容积框置于脐动脉中央，按下 扫描/冻结 按钮开始成像。点击 动态存储 按钮采集脐动脉图像。
      2. 点击 测量 按钮，计算脐动脉峰值流速（UA）。
   5. 彩色多普勒模式成像与分析
      1. 在相同扫描切面上，点击 彩色 按钮，调整探头位置以获得胎儿心脏图像。按下 扫描/冻结 按钮开始成像，按下 动态存储 按钮采集图像。
      2. 点击 测量 按钮，计算胎儿心率（HR）。

4. 高效液相色谱分析

1. 组织准备
   1. 在妊娠晚期（例如，E14.5）按照步骤3.1.3所述方法，对怀孕小鼠单次注射MNPs或plCSA-MNPs（相当于1 mg/kg MTX剂量）。
   2. 24小时后，通过腹腔注射240 μg/克体重的戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉。通过足部夹捏测试确认无反应，以确保小鼠已完全麻醉。
   3. 用75%乙醇喷洒胸部区域。按照先前详细描述的方法^19,20进行心脏灌流（剪开右心房，从左心室灌流），使用50 mL冰冻的0.9%生理盐水持续灌流10分钟，以清除未结合的纳米颗粒。
   4. 处死母鼠。使用格拉夫镊子、解剖剪和格拉夫组织镊进行剖宫产，取出胎儿和胎盘，并将组织在分析前储存于-80 °C。
   5. 配制匀浆液（10%高氯酸），并置于冰上保存。每份样品取约200 mg组织，加入500 μL匀浆液。使用匀浆器以全速匀浆30秒，重复该操作两次。
   6. 在4 °C条件下以14,000 ×g离心20分钟。将上清液（约300 μL）通过0.45 μm注射器滤膜过滤，转移至HPLC小瓶中。将样品小瓶放入自动进样器托盘中待进样。
2. 标准品制备
   1. 配制流动相溶液：40 mM磷酸氢二钾（pH 4.5）与乙腈（88:12, v/v）。将溶液通过0.45 μm孔径的注射器滤膜过滤后，转移至洁净的HPLC储液瓶中。
      注意：使用0.1 M磷酸调节pH值。每次使用前需超声振荡15分钟以脱气。
   2. 称取10 mg MTX置于1.5 mL离心管中，加入1 mL 1 M氢氧化钠。
   3. 高速涡旋振荡直至MTX完全溶解。
      注意：此为初级储备液，可在-20 °C保存数月。
   4. 为制备次级MTX储备液（500 μg/mL），取50 μL初级储备液加入950 μL流动相中稀释。
      注意：使用前置于冰上保存，且需每日新鲜配制。使用流动相配制标准品至关重要，以避免样品进样后因不同溶液混合而产生额外峰。
   5. 进一步稀释以制备标准品（表1）。标准品应置于冰上保存，并每日新鲜配制。实验样品应与标准品系列同时运行。

编号	终浓度 (μg/mL)	500 μg/mL 标准品, μL	流动相(μL)
1	0.5	1	999
2	1	2	998
3	2.5	5	995
4	10	20	980
5	25	50	950
6	50	100	900
7	100	200	800

表1. 甲氨蝶呤标准曲线的制备。 甲氨蝶呤标准溶液的终浓度范围为0.5–100 μg/mL。

3. HPLC 仪器与操作参数
   注意：样品在配备溶剂泵、紫外分光光度检测器（313 nm）和 C18 色谱柱（250×4.6 mm，5 μm 粒径）的 HPLC 系统上进行分析。
   1. 开启 HPLC 脱气装置，以去除系统中的空气。开启流动相流速，用流动相平衡色谱柱 30 分钟，以降低基线噪声。
   2. 将色谱柱温度设置为 25 °C，以 1 mL/min 的流速进样 20 μL 样品体积，并点击 运行方法 开始分析。
   3. 运行结束后，手动将流动相更换为 HPLC 级乙腈，继续运行约 15 分钟以保护系统。
      注意：若未在推荐的运行时间后执行此步骤，可能导致色谱柱损坏。
   4. 进行定量分析时，使用 HPLC 系统软件计算目标标准甲氨蝶呤（MTX）峰的峰面积。

结果

在本研究中，将负载MTX（plCSA-MNPs）或ICG（plCSA-INPs）的plCSA-BP偶联纳米颗粒经尾静脉注射入妊娠小鼠体内。体内成像显示，注射plCSA-INPs后30分钟，子宫区域出现强烈的ICG信号。INPs主要分布于肝脏和脾脏区域（图1A）。注射plCSA-INPs 48小时后，处死妊娠小鼠，发现ICG信号仅存在于胎盘中，而在胎儿中未检测到任何信号（图1B）。

随后，我们采用高频超声（HFUS）监测静脉注射纳米颗粒后胚胎的发育情况。生物测量指标包括孕囊长度（GS）、胎儿顶臀长（CRL）、双顶径（BPD）、腹围（AC）、胎盘直径（PD）、胎盘厚度（PT）、脐动脉峰值流速（UA）和胎儿心率（HR）（视频1）。不同孕龄测得的形态学参数列于表2

讨论

在本文中，我们提出了一种三方法体系，用于确定plCSA-BP引导的纳米颗粒是否为将药物靶向递送至胎盘的有效工具。体内成像技术通过监测红外荧光ICG信号，证实了plCSA-BP具有胎盘靶向特异性。利用高频超声（HFUS）和高效液相色谱法（HPLC），我们证明了与plCSA-BP偶联的纳米颗粒能够将甲氨蝶呤（MTX）高效递送至胎盘细胞，而不会递送至胎儿。

在 在体内 荧光成像实验中，妊娠小鼠的孕龄至关重要。胎盘大约在E9.5开始形成²¹此外，考虑到成像仪的分辨率， 体内 成像实验应在E10.5之后进行。根据本方案在E11.5注射plCSA-INP后，在所述条件下成像仪未检测到荧光信号，这可能是由于皮肤和内脏组织阻碍了信号传递所致²²为克服这一局限，可增加注射剂量或收集更多胎盘和胎儿样本 离体 必须使用成像技术。

高频超声成像的关键步骤之一是使用合适的换能器以获得高质...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CD-1 小鼠	Beijing Vital River	201	雌性（8–12 周龄）
胰岛素注射器	BD	328421	用于静脉注射
无水乙醇	Sinopharm Chemical	10009218	用于纳米颗粒合成
大豆卵磷脂	Avanti Polar Lipids	441601	用于纳米颗粒合成
DSPE-PEG-COOH	Avanti Polar Lipids	880125	用于纳米颗粒合成
PLGA	Sigma-Aldrich	719897	用于纳米颗粒合成
超声波处理器	Sonics	VCX130	用于纳米颗粒合成
甲氨蝶呤（MTX）	Sigma-Aldrich	V900324	用于纳米颗粒合成
吲哚菁绿（ICG）	Sigma-Aldrich	1340009	用于活体成像
磷酸盐缓冲液（PBS）	Hyclone	SH30028.01
IVIS 光谱成像仪	Perkin Elmer		用于活体成像
超声耦合剂	Guanggong	ZC4252418	用于超声成像
异氟烷	Lunan Pharmaceutical	I0040	用于维持麻醉
脱毛膏	Nair	TMG001	用于去除毛发
40 MHz 探头	VisualSonics	MS550S	用于超声成像
高频超声成像系统	VisualSonics	Vevo2100	用于超声成像
戊氨基脲（Avertin）	Sigma-Aldrich	T48402	用于麻醉
注射泵	Mindray	SK-500III	用于心脏灌注
0.9% 生理盐水溶液	Meilunbio	MA0083	用于心脏灌注
1.5 mL 聚丙烯管	AXYGEN	MCT-150-C
-80 °C 冰箱	Thermo Fisher Scientific	88600V
离心机	Cence	H1650R
高氯酸	Sigma-Aldrich	311421	用于蛋白质沉淀
组织匀浆器	SCIENTZ	SCIENTZ-48	用于组织匀浆
注射器滤器（0.45 μm）	Millipore	SLHV033RS01
氢氧化钠	Sinopharm Chemical	10019763	用于溶解 MTX
HPLC 小瓶	Waters	670650620	用于 HPLC
磷酸氢二钾	Sinopharm Chemical	20032117	用于 HPLC
乙腈	JKchemical	932537	用于 HPLC
C18 色谱柱	Waters	186003966	用于 HPLC
HPLC 系统	Shimadzu		用于 HPLC