综合评估胎盘靶向药物递送的有效性与安全性的三种互补方法

摘要

我们介绍一种利用三种方法评估靶向胎盘药物递送安全性和有效性的系统：体内成像用于监测纳米颗粒的聚集，高频超声用于监测胎盘和胎儿发育，高效液相色谱法（HPLC）用于定量组织中的药物递送量。

摘要

目前尚无针对胎盘相关妊娠并发症的有效治疗方法，而开发能够将药物靶向递送至胎盘、同时尽量减少对胎儿和母体副作用的策略仍面临挑战。靶向纳米颗粒载体为治疗胎盘疾病提供了新的机遇。我们近期证明，一种合成的胎盘硫酸软骨素A结合肽（plCSA-BP）可用于引导纳米颗粒将药物递送至胎盘。在本实验方案中，我们详细描述了一种评估plCSA-BP介导药物向胎盘递送效率的系统，该系统联合使用三种独立方法：体内成像、高频超声（HFUS）和高效液相色谱法（HPLC）。通过体内成像技术，可在活体动物胎盘中观察到plCSA-BP引导的纳米颗粒；而HFUS和HPLC结果表明，与plCSA-BP偶联的纳米颗粒能够高效且特异性地将甲氨蝶呤递送至胎盘。因此，这三种方法的联合应用可作为实现药物靶向递送至胎盘的有效工具，并有助于开发多种妊娠并发症的新型治疗策略。

引言

胎盘介导的妊娠并发症，包括子痫前期、妊娠丢失、胎盘早剥和小于胎龄儿（SGA），较为常见，并导致显著的胎儿和孕产妇发病率和死亡率^1,2,3，而目前仅有极少数药物被证实对治疗妊娠相关疾病有效^4,5。在现代药物治疗中，开发更具选择性和安全性的靶向胎盘药物递送策略仍面临挑战。

近年来，多项研究聚焦于通过用肽或抗体包被纳米颗粒作为靶向胎盘的工具，实现药物向子宫胎盘组织的靶向递送。这些工具包括抗表皮生长因子受体（EGFR）⁶抗体、肿瘤归巢肽（CGKRK和iRGD）⁷、胎盘靶向肽⁸、胎盘血管靶向肽⁹以及抗催产素受体抗体¹⁰。

在此，我们证明了一种合成的胎盘硫酸软骨素A结合肽（plCSA-BP）可用于将纳米颗粒及其药物有效载荷靶向递送至胎盘¹¹。plCS....

方案

所有小鼠实验均严格遵循中国科学院深圳先进技术研究院动物护理和使用委员会批准的方案（SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232）。

1. 靶向胎盘硫酸软骨素A的脂质-聚合物纳米颗粒的合成

1. 按照文献中详细描述的方法，合成载有MTX和ICG的脂质-聚合物纳米颗粒（分别为MNPs和INPs）以及plCSA-BP偶联的纳米颗粒（plCSA-MNPs和plCSA-INPs）¹⁸。

2. 体内 荧光成像

1. 孕鼠的准备
   1. 将雌性CD-1小鼠（8–12周龄）与同品系的可育雄鼠按1:2的比例（雄:雌）于下午放入同一笼中，次日清晨检查阴道栓。若观察到阴道栓，则将该小鼠定义为胚胎发育第0.5天（E0.5）。
   2. 将怀孕小鼠单独饲养于无病原体动物房中，保持14小时光照/10小时黑暗的循环条件，并自由摄食和饮水，直至E14.5。
2. 纳米颗粒的静脉注射
   1. 操作前，通过0.22 μm注射器滤器过滤对纳米颗粒进行灭菌。在E11.5时称量孕鼠体重，以确定纳米颗粒注射的剂量和体积。
      注意：纳米颗粒注射体积应小于孕鼠体重的1%（体积....

结果

在本研究中，将负载MTX（plCSA-MNPs）或ICG（plCSA-INPs）的plCSA-BP偶联纳米颗粒经尾静脉注射入妊娠小鼠体内。体内成像显示，注射plCSA-INPs后30分钟，子宫区域出现强烈的ICG信号。INPs主要分布于肝脏和脾脏区域（图1A）。注射plCSA-INPs 48小时后，处死妊娠小鼠，发现ICG信号仅存在于胎盘中，而在胎儿中未检测到任何信号（图1B）。

随后，我们采用高频超声（HFUS）监测静脉注射纳米颗粒后胚胎的发育情况。生物测量指标包括孕囊长度（GS）、胎儿顶臀长（CRL）、双顶径（BPD）、腹围（AC）、胎盘直径（PD）、胎盘厚度（PT）、脐动脉峰值流速（UA）和胎儿心率（HR）（视频 1）。不同孕龄测得的形态学参数列于表 2

讨论

在本文中，我们提出了一种三方法体系，用于确定plCSA-BP引导的纳米颗粒是否为将药物靶向递送至胎盘的有效工具。体内成像技术通过监测红外荧光ICG信号，证实了plCSA-BP具有胎盘靶向特异性。利用高频超声（HFUS）和高效液相色谱法（HPLC），我们证明了与plCSA-BP偶联的纳米颗粒能够将甲氨蝶呤（MTX）高效递送至胎盘细胞，而不会递送至胎儿。

在 在体内 荧光成像实验中，妊娠小鼠的孕龄至关重要。胎盘大约在E9.5开始形成²¹此外，考虑到成像仪的分辨率， 体内 成像实验应在E10.5之后进行。根据本方案在E11.5注射plCSA-INP后，在所述条件下成像仪未检测到荧光信号，这可能是由于皮肤和内脏组织阻碍了信号传递所致²²为克服这一局限，可增加注射剂量或收集更多胎盘和胎儿样本 离体 必须使用成像技术。

高频超声成像的关键步骤之一是使用合适的换能器以获得高质.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CD-1 小鼠	Beijing Vital River	201	雌性（8–12 周龄）
胰岛素注射器	BD	328421	用于静脉注射
无水乙醇	Sinopharm Chemical	10009218	用于纳米颗粒合成
大豆卵磷脂	Avanti Polar Lipids	441601	用于纳米颗粒合成
DSPE-PEG-COOH	Avanti Polar Lipids	880125	用于纳米颗粒合成
PLGA	Sigma-Aldrich	719897	用于纳米颗粒合成
超声波处理器	Sonics	VCX130	用于纳米颗粒合成
甲氨蝶呤（MTX）	Sigma-Aldrich	V900324	用于纳米颗粒合成
吲哚菁绿（ICG）	Sigma-Aldrich	1340009	用于活体成像
磷酸盐缓冲液（PBS）	Hyclone	SH30028.01
IVIS 光谱成像仪	Perkin Elmer		用于活体成像
超声耦合剂	Guanggong	ZC4252418	用于超声成像
异氟烷	Lunan Pharmaceutical	I0040	用于维持麻醉
脱毛膏	Nair	TMG001	用于去除毛发
40 MHz 探头	VisualSonics	MS550S	用于超声成像
高频超声成像系统	VisualSonics	Vevo2100	用于超声成像
戊氨基脲（Avertin）	Sigma-Aldrich	T48402	用于麻醉
注射泵	Mindray	SK-500III	用于心脏灌注
0.9% 生理盐水溶液	Meilunbio	MA0083	用于心脏灌注
1.5 mL 聚丙烯管	AXYGEN	MCT-150-C
-80 °C 冰箱	Thermo Fisher Scientific	88600V
离心机	Cence	H1650R
高氯酸	Sigma-Aldrich	311421	用于蛋白质沉淀
组织匀浆器	SCIENTZ	SCIENTZ-48	用于组织匀浆
注射器滤器（0.45 μm）	Millipore	SLHV033RS01
氢氧化钠	Sinopharm Chemical	10019763	用于溶解 MTX
HPLC 小瓶	Waters	670650620	用于 HPLC
磷酸氢二钾	Sinopharm Chemical	20032117	用于 HPLC
乙腈	JKchemical	932537	用于 HPLC
C18 色谱柱	Waters	186003966	用于 HPLC
HPLC 系统	Shimadzu		用于 HPLC