方法文章

综合评估胎盘靶向药物递送的有效性与安全性的三种互补方法

DOI：

10.3791/58219

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2018年9月10日

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1Laboratory for Reproductive Health, Institute of Biomedicine and Biotechnology, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, 2College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University, 3Key Laboratory of Chemical Engineering Process and Technology for High-efficiency Conversion, College of Chemistry and Material Sciences, Heilongjiang University, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Wayne State University School of Medicine

本文内容

摘要

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我们介绍一种利用三种方法评估靶向胎盘药物递送安全性和有效性的系统：体内成像用于监测纳米颗粒的聚集，高频超声用于监测胎盘和胎儿发育，高效液相色谱法（HPLC）用于定量组织中的药物递送量。

摘要

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目前尚无针对胎盘相关妊娠并发症的有效治疗方法，而开发能够将药物靶向递送至胎盘、同时尽量减少对胎儿和母体副作用的策略仍面临挑战。靶向纳米颗粒载体为治疗胎盘疾病提供了新的机遇。我们近期证明，一种合成的胎盘硫酸软骨素A结合肽（plCSA-BP）可用于引导纳米颗粒将药物递送至胎盘。在本实验方案中，我们详细描述了一种评估plCSA-BP介导药物向胎盘递送效率的系统，该系统联合使用三种独立方法：体内成像、高频超声（HFUS）和高效液相色谱法（HPLC）。通过体内成像技术，可在活体动物胎盘中观察到plCSA-BP引导的纳米颗粒；而HFUS和HPLC结果表明，与plCSA-BP偶联的纳米颗粒能够高效且特异性地将甲氨蝶呤递送至胎盘。因此，这三种方法的联合应用可作为实现药物靶向递送至胎盘的有效工具，并有助于开发多种妊娠并发症的新型治疗策略。

引言

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胎盘介导的妊娠并发症，包括子痫前期、妊娠丢失、胎盘早剥和小于胎龄儿（SGA），较为常见，并导致显著的胎儿和孕产妇发病率和死亡率1,2,3，而目前仅有极少数药物被证实对治疗妊娠相关疾病有效4,5。在现代药物治疗中，开发更具选择性和安全性的靶向胎盘药物递送策略仍面临挑战。

近年来，多项研究聚焦于通过用肽或抗体包被纳米颗粒作为靶向胎盘的工具，实现药物向子宫胎盘组织的靶向递送。这些工具包括抗表皮生长因子受体（EGFR）6抗体、肿瘤归巢肽（CGKRK和iRGD）7、胎盘靶向肽8、胎盘血管靶向肽9以及抗催产素受体抗体10。

在此，我们证明了一种合成的胎盘硫酸软骨素A结合肽（plCSA-BP）可用于将纳米颗粒及其药物有效载荷靶向递送至胎盘11。plCS....

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方案

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所有小鼠实验均严格遵循中国科学院深圳先进技术研究院动物护理和使用委员会批准的方案（SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232）。

1. 靶向胎盘硫酸软骨素A的脂质-聚合物纳米颗粒的合成

  1. 按照文献中详细描述的方法，合成载有MTX和ICG的脂质-聚合物纳米颗粒（分别为MNPs和INPs）以及plCSA-BP偶联的纳米颗粒（plCSA-MNPs和plCSA-INPs）18。

2. 体内 荧光成像

  1. 孕鼠的准备
    1. 将雌性CD-1小鼠（8–12周龄）与同品系的可育雄鼠按1:2的比例（雄:雌）于下午放入同一笼中，次日清晨检查阴道栓。若观察到阴道栓，则将该小鼠定义为胚胎发育第0.5天（E0.5）。
    2. 将怀孕小鼠单独饲养于无病原体动物房中，保持14小时光照/10小时黑暗的循环条件，并自由摄食和饮水，直至E14.5。
  2. 纳米颗粒的静脉注射
    1. 操作前，通过0.22 μm注射器滤器过滤对纳米颗粒进行灭菌。在E11.5时称量孕鼠体重，以确定纳米颗粒注射的剂量和体积。
      注意：纳米颗粒注射体积应小于孕鼠体重的1%（体积....

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结果

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在本研究中，将负载MTX（plCSA-MNPs）或ICG（plCSA-INPs）的plCSA-BP偶联纳米颗粒经尾静脉注射入妊娠小鼠体内。体内成像显示，注射plCSA-INPs后30分钟，子宫区域出现强烈的ICG信号。INPs主要分布于肝脏和脾脏区域（图1A）。注射plCSA-INPs 48小时后，处死妊娠小鼠，发现ICG信号仅存在于胎盘中，而在胎儿中未检测到任何信号（图1B）。

随后，我们采用高频超声（HFUS）监测静脉注射纳米颗粒后胚胎的发育情况。生物测量指标包括孕囊长度（GS）、胎儿顶臀长（CRL）、双顶径（BPD）、腹围（AC）、胎盘直径（PD）、胎盘厚度（PT）、脐动脉峰值流速（UA）和胎儿心率（HR）（视频1）。不同孕龄测得的形态学参数列于表2

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讨论

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在本文中，我们提出了一种三方法体系，用于确定plCSA-BP引导的纳米颗粒是否为将药物靶向递送至胎盘的有效工具。体内成像技术通过监测红外荧光ICG信号，证实了plCSA-BP具有胎盘靶向特异性。利用高频超声（HFUS）和高效液相色谱法（HPLC），我们证明了与plCSA-BP偶联的纳米颗粒能够将甲氨蝶呤（MTX）高效递送至胎盘细胞，而不会递送至胎儿。

在 在体内 荧光成像实验中，妊娠小鼠的孕龄至关重要。胎盘大约在E9.5开始形成21此外，考虑到成像仪的分辨率， 体内 成像实验应在E10.5之后进行。根据本方案在E11.5注射plCSA-INP后，在所述条件下成像仪未检测到荧光信号，这可能是由于皮肤和内脏组织阻碍了信号传递所致22为克服这一局限，可增加注射剂量或收集更多胎盘和胎儿样本 离体 必须使用成像技术。

高频超声成像的关键步骤之一是使用合适的换能器以获得高质.......

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披露

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X.F. 和 B.Z. 是中国科学院深圳先进技术研究院提交的专利申请 PCT/CN2017/108646 的发明人，该专利申请涵盖一种胎盘特异性药物递送方法及其应用。其他所有作者声明不存在利益冲突。

致谢

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本工作获得了国家自然科学基金（81771617）和广东省自然科学基金（2016A030313178）对 X.F. 的资助；深圳市基础研究基金（JCYJ20170413165233512）对 X.F. 的资助；以及尤妮斯·肯尼迪·施莱弗国家儿童健康与人类发育研究所 & 美国国立卫生研究院人类发展研究所资助编号 R01HD088549（本内容由作者全权负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点）至 N.N.

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CD-1 小鼠Beijing Vital River201雌性（8–12 周龄）
胰岛素注射器BD328421用于静脉注射
无水乙醇Sinopharm Chemical10009218用于纳米颗粒合成
大豆卵磷脂Avanti Polar Lipids441601用于纳米颗粒合成
DSPE-PEG-COOHAvanti Polar Lipids880125用于纳米颗粒合成
PLGASigma-Aldrich719897用于纳米颗粒合成
超声波处理器SonicsVCX130用于纳米颗粒合成
甲氨蝶呤（MTX）Sigma-AldrichV900324用于纳米颗粒合成
吲哚菁绿（ICG）Sigma-Aldrich1340009用于活体成像
磷酸盐缓冲液（PBS）HycloneSH30028.01
IVIS 光谱成像仪Perkin Elmer用于活体成像
超声耦合剂GuanggongZC4252418用于超声成像
异氟烷Lunan PharmaceuticalI0040用于维持麻醉
脱毛膏NairTMG001用于去除毛发
40 MHz 探头VisualSonicsMS550S用于超声成像
高频超声成像系统VisualSonicsVevo2100用于超声成像
戊氨基脲（Avertin）Sigma-AldrichT48402用于麻醉
注射泵MindraySK-500III用于心脏灌注
0.9% 生理盐水溶液MeilunbioMA0083用于心脏灌注
1.5 mL 聚丙烯管AXYGENMCT-150-C
-80 °C 冰箱Thermo Fisher Scientific88600V
离心机CenceH1650R
高氯酸Sigma-Aldrich311421用于蛋白质沉淀
组织匀浆器SCIENTZSCIENTZ-48用于组织匀浆
注射器滤器（0.45 μm）MilliporeSLHV033RS01
氢氧化钠Sinopharm Chemical10019763用于溶解 MTX
HPLC 小瓶Waters670650620用于 HPLC
磷酸氢二钾Sinopharm Chemical20032117用于 HPLC
乙腈JKchemical932537用于 HPLC
C18 色谱柱Waters186003966用于 HPLC
HPLC 系统Shimadzu用于 HPLC

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rodger, M. A., et al. The Association of Factor V Leiden and Prothrombin Gene Mutation and Placenta-Mediated Pregnancy Complications: A Systematic Review and Meta-analysis of Prospective Cohort Studies. PLOS Medicine. 7 (6), e1000292(2010).
  2. Rodger, M. A., et al.

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