使用开放式膜片钳移液管测量非搅动边界层中的离子浓度：流体流动对离子通道调控的意义

摘要

机械敏感性离子通道通常通过膜片钳记录技术，以流体流动/剪切力敏感性进行研究。然而，根据实验方案的不同，流体流动对离子通道调控的研究结果可能会出现误差。本文提供了预防和纠正此类误差的方法，并给出了相应的理论依据。

摘要

液流是一种重要的环境刺激，可调控多种生理与病理过程，例如液流诱导的血管舒张。尽管目前对细胞响应液流/剪切力的分子机制尚未完全阐明，但液流介导的离子通道门控调节可能在其中发挥关键作用。因此，研究人员已采用膜片钳技术来研究离子通道对液流/剪切力的敏感性。然而，实验结果及其数据解读可能因实验方案的不同而出现误差。本文提供了与液流相关的误差的实验与理论证据，并提出估算、预防和纠正这些误差的方法。我们使用充满3 M KCl的敞口微电极测量了Ag/AgCl参比电极与灌流液之间液接电位的变化。结果表明，液流可使液/金属界面的液接电位发生约7 mV的偏移。反之，通过测量液流引起的电压偏移，可估算静止边界层中的离子浓度。在静态条件下，靠近Ag/AgCl参比电极或细胞膜表面离子通道入口处的实际离子浓度可降至流动状态下的约30%。在灌流液与参比电极之间放置琼脂糖3 M KCl盐桥可能有助于避免液接电位偏移的问题。然而，细胞膜表面附近未搅拌层效应无法通过此方法解决。本文提供了一种利用敞口膜片钳微电极测量未搅拌边界层中实际离子浓度的方法，并强调在研究液流诱导的离子电流调节时使用琼脂糖盐桥的重要性。因此，这一考虑了未搅拌边界层中离子实际浓度的新方法，可能为涉及液流剪切应力调控离子通道的相关实验设计与数据解读提供有价值的参考。

引言

液体流动是一种重要的环境信号，可调控多种生理和病理过程，例如由液体流动诱导的血管舒张以及依赖于流体剪切力的血管重塑与发育^1,2,3,4,5。尽管生物体对流体流动剪切力产生反应的分子机制尚未完全阐明，但普遍认为，流体流动介导的离子通道门控调节可能在流体流动诱导的反应中发挥关键作用^5,6,7,8。例如，流体流动引起Ca²⁺内流后，内皮细胞内向整流钾通道Kir2.1和Ca²⁺激活的K⁺通道（K_Ca2.3, KCNN3）的激活被认为有助于流体流动诱导的血管舒张^6,7,8。因此，许多离子通道，尤其是机械激活或机械抑制型通道，已通过膜片钳技术被广泛研究其对液体流动/剪切力的敏感性^6,9,10,11。然而，膜片钳记录过程中所采用的实验方案若有所不同，可能会导致关于流体流动调控离子通道的数据结果出现偏差或解释错误^10,11。

在膜片钳记录中，流体流动诱导的伪迹来源之一是浴液与Ag/AgCl参比电极之间的液接电位¹¹。通常认为，当浴液中Cl^-浓度保持恒定时，浴液与Ag/AgCl电极之间的液-金属接点电位是恒定的，这基于浴液与Ag/AgCl电极之间的化学反应如下：

Ag + Cl^- ↔ AgCl + 电子 (e^-)           (方程 1)

然而，当浸泡溶液与 Ag/AgCl 参比电极之间的整体电化学反应（方程 1）从左向右进行时，若未确保足够的对流传质，则靠近 Ag/AgCl 参比电极的浸泡液（非搅拌边界层^12,13,14,15）中 Cl^- 的浓度可能远低于主体浸泡溶液中的浓度。使用老化或非理想状态的 Ag/AgCl 电极（其银的氯化不充分）可能会增加此类风险。事实上，通过在浸泡液与参比电极之间放置一个常规的琼脂糖-盐桥，即可消除这种与液体流动相关的伪影，因为该伪影源于 Ag/AgCl 电极附近实际 Cl^- 浓度的变化¹¹。本研究中所述的实验方案描述了如何防止与流动相关的液接电位变化，并测量非搅拌边界层中的真实离子浓度。

在将琼脂糖 KCl 桥置于灌流液与 Ag/AgCl 参比电极之间后，还需考虑另一个关键因素：正如参比 Ag/AgCl 电极的作用类似于 Cl⁻^- 电极，离子通道的功能也可类似于离子选择性电极。当离子通过膜上的离子通道在细胞外和细胞内溶液之间移动时，浴液与Ag/AgCl参比电极之间会形成一个未搅动的边界层。这意味着在解释流体流动对离子通道调控作用时应保持谨慎。正如我们在之前的研究中所讨论的¹¹，当溶液中存在电化学梯度时，离子可通过溶液发生移动 通过 三种不同的机制：扩散、迁移和对流，其中扩散是由浓度梯度引起的运动，迁移是由电场梯度驱动的运动，对流是通过流体流动实现的运动。在这三种传输机制中，对流模式对离子的移动贡献最大¹¹ (> 比在常规膜片钳设置下的扩散或迁移高1000倍）。这构成了浴液与Ag/AgCl参比电极之间液结电位在不同静态和流体流动条件下可能发生改变的理论基础。¹¹.

根据上述假设，流体流动对离子通道电流的促进作用可能源于膜表面通道入口附近真实离子浓度通过对流作用在静止边界层中的恢复¹⁰。在此情况下，流体流动对离子通道电流的影响仅仅来源于电化学事件，而非离子通道门控的调节。Barry 及其同事此前基于严格的理论分析和实验证据提出了类似观点^12,13,14,15，该观点也被称为静止层效应或迁移数效应。如果某些离子通道具有足够高的单通道电导和足够长的开放时间，从而能够提供足够的跨膜转运速率（即膜内的转运速率快于静止膜表面的扩散速率），则可能产生边界层效应。因此，依赖对流的物质转运可能有助于最终实现流体流动对离子电流的促进作用^{10,12,13,14,15}。

在本研究中，我们强调了在研究流体流动诱导的离子电流调控时使用琼脂或琼脂糖盐桥的重要性。同时，我们提供了一种用于测量紧邻 Ag/AgCl 参比电极及膜离子通道的非搅拌边界层中真实离子浓度的方法。此外，本文还对流体流动诱导的离子通道电流调制进行了理论解释（即， 对流假说或非搅拌层迁移数效应）可为设计和解读剪切力调控离子通道的研究提供有价值的见解。根据非搅拌边界层迁移数效应，我们预测，只要离子通道具有足够的单通道电导和较长的开放时间，流体流动即可促进所有类型膜离子通道的离子通道电流，而无需依赖这些离子通道对流体剪切力的生物学敏感性。较高的离子通道电流密度可能会增强细胞膜表面的非搅拌边界层效应。

方案

所有实验均按照韩国建国大学的机构指南进行。

1. 浴液与 Ag/AgCl 参比电极之间的琼脂糖盐桥

注意：琼脂糖 3M KCl 盐桥的制备方法与之前所述¹²略有不同。

1. 桥的形成
   1. 将火抛光玻璃毛细管适当弯曲成U形。毛细管的内径应足够大，以在记录大离子电流时降低串联电阻。通常内径为2-5 mm的毛细管即可满足要求。
2. 3 M KCl 琼脂糖溶液的制备
   1. 配制100 mL 3 M KCl溶液（1 M或2 M也可接受）。
   2. 称取3 克琼脂糖
   3. 将琼脂糖溶于100 mL KCl中（即， 在90至100 °C的加热板上加热3%琼脂糖。
3. 用 3 M KCl 琼脂糖填充桥梁
   1. 为便于加载，将U形玻璃桥浸入琼脂糖-KCl溶液中。
      注意：如果琼脂糖-KCl 溶液盛放在浅而宽的容器中，则很容易挖出玻璃桥。
   2. 在室温（RT）下静置过夜，使琼脂糖凝固并硬化。
   3. 小心地从凝固的琼脂糖-盐中挖出载有琼脂糖-KCl的玻璃桥。
4. 储存桥体
   1. 准备足够的体积（即， 在广口瓶中加入 500 mL 3 M KCl 溶液。
   2. 将制备好的琼脂糖-盐桥存放在瓶中，并置于冰箱中保存。

2. 在膜片钳电极腔室中对细胞施加流体流动剪切力

注意：图示为膜片钳实验装置的示意图 图1.

1. 将装有灌流液的容器（体积和高度应已测量）放置在膜片钳记录槽上方。
2. 通过抽吸管路将灌流液注入膜片钳记录槽中。
3. 为停止液体流动，同时夹闭容器侧的管路以阻断液体流动，并夹闭抽吸侧的管路以终止抽吸。此为“静止”对照条件。
4. 若需施加流体剪切力，同时打开容器侧和抽吸侧的管路。
5. 在对细胞施加流体剪切力之前或之后，测量流速（单位：mL/min）。
6. 通过测量一定时间内液体体积的减少量来计算流速。
7. 根据测得的流速以及灌流槽的几何结构（形态），估算流体流动对细胞施加的剪切力（详见讨论部分）。
8. 或者，为精确控制流速（适用于步骤 2.3–2.6），可使用灌流泵。此时需注意确保流体为稳定流动，而非脉冲式流动。

3. 通过浴液与Ag/AgCl参比电极之间的液体流动测量液态金属结电位的变化（图3A）

1. 使用市售的Ag/AgCl电极或小球，无需琼脂糖盐桥。
2. 为灌流槽配制正常的生理盐水例如，143 mM NaCl，5.4 mM KCl，0.33 mM NaH₂PO₄，5 mM HEPES，0.5 mM MgCl₂，1.8 mM CaCl₂，11 mM D-葡萄糖；用 NaOH 调节 pH 至 7.4。
3. 将一支含有 3 M KCl 溶液的膜片电极置入记录室，以尽量减少电极液与灌流液之间的液接电位偏移。
4. 将电压钳制放大器设定为电流钳制模式（“I = 0” 或 “CC”）。
5. 在消除初始偏移电位后，测量不同流速引起的电压变化。
6. 为了验证电压变化是否为液/液或液/金属结电位，使用琼脂糖-盐桥连接浴液与Ag/AgCl电极，重新考察流体流动对结电位的影响。

4. 静态条件下紧邻Ag/AgCl电极的非搅拌层中真实Cl^-浓度的实验测定（图3B）

1. 根据步骤3的结果，绘制连接电位-流速关系曲线，并通过超流速估计连接电位变化的最大（饱和）值。
2. 配制不同浓度的 Cl 溶液 即， 50、99、147、195 和 288 mM 的 NaCl。
3. 通过改变 Cl^- 浴液中的浓度，绘制连接电位-[Cl^-] 关系。注意，流体流速应保持恒定且足够高（> 30 mL/min）以防止 Cl 的减少^- 浓度相对于相邻的Ag/AgCl参比电极。
4. 从两条关系曲线中估算 Cl 的变化情况^- 根据测得的结电位偏移量计算浓度。

结果

全细胞电压依赖性L型Ca²⁺ 电压门控钙通道（VDCC）_L) 电流记录在经酶法分离的大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞中进行，方法如前所述¹¹在无双价阳离子灌流液中，采用富含Cs+的移液管溶液和制霉菌素穿孔膜片钳配置，对动脉平滑肌细胞进行透析，以促进电流经由电压依赖性钙通道（VDCC）流动。_L^11,16在 -70 mV 的钳制电位下施加短暂的去极化电压斜坡或电压阶跃，以诱发电压依赖性钙通道电流（VDCC）_L 电流。典型的电流-电压（I电压依赖性钙通道（VDCC）中的电压-电流（V-I）关系_L 在无流动和有流动（5 mL/min 或约 0.004 m/s）条件下，使用琼脂糖 KCl 桥记录的结果如图所示 图2A流体流动轻微增加了电压依赖...

讨论

本研究中，我们通过使用充满高浓度KCl的开放式膜片钳移液管测定液-金属结电位，展示了一种测量Ag/AgCl参比电极附近非搅拌层中真实Cl^-浓度的方法。当从静态条件切换到流体流动条件时，边界层中Cl^-浓度的变化可能导致结电位发生偏移。在参比电极与灌流液之间简单地使用琼脂糖KCl桥，即可防止膜片钳记录过程中由Cl^-浓度引起的相关误差或伪影。

除了强调琼脂或琼脂糖盐桥的重要性之外，该方法在估算静止边界层中实际离子浓度方面的另一个应用如下。由于质膜离子通道可发挥类似于离子选择性电极的作用（正如Ag/AgCl电极的作用类似于Cl^-电极），在细胞膜表面通道入口附近静止边界层中的实际离子浓度可能与主体溶液中的平均离子浓度不同。主体溶液与紧邻细胞膜的静止层之间存在的这种离子浓度差异，是临床条件下的真实情况，应与流体流动/剪切力对通道门控的生物学调节作用加以区分。遗憾的是，与Ag/AgCl参比电极和浴液之间存在的静止层效应不同，在研究流体流动/剪切力对离子通道的调控时，我们无法固定细胞膜表面附近的静止层效应。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RC-11 开放式浴槽室	Warner Instruments, USA	W4 64-0307
Ag/AgCl 电极颗粒	World Precision Instruments, USA	EP1
琼脂糖	Sigma-Aldrich, USA	A9793
电压钳放大器	HEKA, Germany	EPC8
电压钳放大器	Molecular Devices, USA	Axopatch 200B
液体泵	KNF Flodos, Switzerland	FEM08