使用开放式膜片钳移液管测量非搅动边界层中的离子浓度：流体流动对离子通道调控的意义

摘要

机械敏感性离子通道通常通过膜片钳记录技术，以流体流动/剪切力敏感性进行研究。然而，根据实验方案的不同，流体流动对离子通道调控的研究结果可能会出现误差。本文提供了预防和纠正此类误差的方法，并给出了相应的理论依据。

摘要

液流是一种重要的环境刺激，可调控多种生理与病理过程，例如液流诱导的血管舒张。尽管目前对细胞响应液流/剪切力的分子机制尚未完全阐明，但液流介导的离子通道门控调节可能在其中发挥关键作用。因此，研究人员已采用膜片钳技术来研究离子通道对液流/剪切力的敏感性。然而，实验结果及其数据解读可能因实验方案的不同而出现误差。本文提供了与液流相关的误差的实验与理论证据，并提出估算、预防和纠正这些误差的方法。我们使用充满3 M KCl的敞口微电极测量了Ag/AgCl参比电极与灌流液之间液接电位的变化。结果表明，液流可使液/金属界面的液接电位发生约7 mV的偏移。反之，通过测量液流引起的电压偏移，可估算静止边界层中的离子浓度。在静态条件下，靠近Ag/AgCl参比电极或细胞膜表面离子通道入口处的实际离子浓度可降至流动状态下的约30%。在灌流液与参比电极之间放置琼脂糖3 M KCl盐桥可能有助于避免液接电位偏移的问题。然而，细胞膜表面附近未搅拌层效应无法通过此方法解决。本文提供了一种利用敞口膜片钳微电极测量未搅拌边界层中实际离子浓度的方法，并强调在研究液流诱导的离子电流调节时使用琼脂糖盐桥的重要性。因此，这一考虑了未搅拌边界层中离子实际浓度的新方法，可能为涉及液流剪切应力调控离子通道的相关实验设计与数据解读提供有价值的参考。

引言

液体流动是一种重要的环境信号，可调控多种生理和病理过程，例如由液体流动诱导的血管舒张以及依赖于流体剪切力的血管重塑与发育^1,2,3,4,5。尽管生物体对流体流动剪切力产生反应的分子机制尚未完全阐明，但普遍认为，流体流动介导的离子通道门控调节可能在流体流动诱导的反应中发挥关键作用^5,6,7,8。例如，流体流动引起Ca²⁺内流后，内皮细胞内向整流钾通道Kir2.1和Ca²⁺激活的K⁺通道（K_Ca2.3, KCNN3）的激活被认为有助于流体流动诱导的血管舒张^6,7,8。因此，许多离子通道，尤....

方案

所有实验均按照韩国建国大学的机构指南进行。

1. 浴液与 Ag/AgCl 参比电极之间的琼脂糖盐桥

注意：琼脂糖 3M KCl 盐桥的制备方法与之前所述¹²略有不同。

1. 桥的形成
   1. 将火抛光玻璃毛细管适当弯曲成U形。毛细管的内径应足够大，以在记录大离子电流时降低串联电阻。通常内径为2-5 mm的毛细管即可满足要求。
2. 3 M KCl 琼脂糖溶液的制备
   1. 配制100 mL 3 M KCl溶液（1 M或2 M也可接受）。
   2. 称取3 克琼脂糖
   3. 将琼脂糖溶于100 mL KCl中（即， 在90至100 °C的加热板上加热3%琼脂糖。
3. 用 3 M KCl 琼脂糖填充桥梁
   1. 为便于加载，将U形玻璃桥浸入琼脂糖-KCl溶液中。
      注意：如果琼脂糖-KCl 溶液盛放在浅而宽的容器中，则很容易挖出玻璃桥。
   2. 在室温（RT）下静置过夜，使琼脂糖凝固并硬化。
   3. 小心地从凝固的琼脂糖-盐中挖出载有琼脂糖-KCl的玻璃桥。
4. 储存桥体

结果

全细胞电压依赖性L型Ca²⁺ 电压门控钙通道（VDCC）_L) 电流记录在经酶法分离的大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞中进行，方法如前所述¹¹在无双价阳离子灌流液中，采用富含Cs+的移液管溶液和制霉菌素穿孔膜片钳配置，对动脉平滑肌细胞进行透析，以促进电流经由电压依赖性钙通道（VDCC）流动。_L^11,16在 -70 mV 的钳制电位下施加短暂的去极化电压斜坡或电压阶跃，以诱发电压依赖性钙通道电流（VDCC）_L 电流。典型的电流-电压（I电压依赖性钙通道（VDCC）中的电压-电流（V-I）关系_L 在无流动和有流动（5 mL/min 或约 0.004 m/s）条件下，使用琼脂糖 KCl 桥记录的结果如图所示 图2A流体流动轻微增加了电压依赖.......

讨论

本研究中，我们通过使用充满高浓度KCl的开放式膜片钳移液管测定液-金属结电位，展示了一种测量Ag/AgCl参比电极附近非搅拌层中真实Cl^-浓度的方法。当从静态条件切换到流体流动条件时，边界层中Cl^-浓度的变化可能导致结电位发生偏移。在参比电极与灌流液之间简单地使用琼脂糖KCl桥，即可防止膜片钳记录过程中由Cl^-浓度引起的相关误差或伪影。

除了强调琼脂或琼脂糖盐桥的重要性之外，该方法在估算静止边界层中实际离子浓度方面的另一个应用如下。由于质膜离子通道可发挥类似于离子选择性电极的作用（正如Ag/AgCl电极的作用类似于Cl^-电极），在细胞膜表面通道入口附近静止边界层中的实际离子浓度可能与主体溶液中的平均离子浓度不同。主体溶液与紧邻细胞膜的静止层之间存在的这种离子浓度差异，是临床条件下的真实情况，应与流体流动/剪切力对通道门控的生物学调节作用加以区分。遗憾的是，与Ag/AgCl参比电极和浴液之间存在的静止层效应不同，在研究流体流动/剪切力对离子通道的调控时，我们无法固定细胞膜表面附近的静止层效应。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RC-11 开放式浴槽室	Warner Instruments, USA	W4 64-0307
Ag/AgCl 电极颗粒	World Precision Instruments, USA	EP1
琼脂糖	Sigma-Aldrich, USA	A9793
电压钳放大器	HEKA, Germany	EPC8
电压钳放大器	Molecular Devices, USA	Axopatch 200B
液体泵	KNF Flodos, Switzerland	FEM08