本文介绍了一种在微型生物反应器系统中同时进行48个平行细胞培养并在不同条件下操作的详细方案。描述了细胞培养过程、收获以及后续的抗体滴度分析。
本文内容
摘要
摘要
自动化微型生物反应器（15 mL）可作为细胞培养工程师的有力工具。它们能够在最小化潜在工艺变异的同时，实现多种实验条件的并行操作。该方法的应用包括：克隆筛选、温度和pH值变化、 培养基和添加剂优化。此外，较小的反应器体积有利于开展大规模实验设计（Design of Experiments），以考察广泛的不同条件。这使得上游工艺可在放大前得到显著优化，而在放大阶段，由于时间和经济成本的限制，实验范围通常更为有限。相比传统的细胞培养小规模系统（如摇瓶或旋转瓶），自动化微型生物反应器系统具有多种优势。然而，在中试规模的工艺开发过程中 必须格外谨慎，以确保这些优势得以实现。若操作得当，该系统可实现高度自动化，能够编程运行包含更多变量的实验设计（DOE） ，并在与营养分析仪或细胞计数器联用时减少取样时间。将本文所提出的专家经验性指导原则与当前的自动化微型生物反应器实验相结合，可最大限度地避免影响结果有效性的常见问题。在极端情况下，若未能遵循本文所述原则，可能导致设备损坏，进而需要昂贵的维修。此外，微型生物反应器系统的培养体积较小 ，使得细胞培养条件的表征变得困难。在分批培养模式下，过程中可采集的样品数量和体积受到限制，因为操作体积不能低于10 mL。本文将讨论微型生物反应器系统的优点与局限性。
引言
单克隆抗体（mAbs）最早于1975年在小鼠杂交瘤细胞中制备成功1此后，为提高单克隆抗体的人源化程度，重组蛋白生产的研发显著增加 体内 安全性和有效性2,3,4大多数重组蛋白生产过程采用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，因其易于适应无血清培养基，并能够产生具有与天然人源蛋白相似翻译后修饰的蛋白质。 及其作为宿主细胞的可靠性5,6.
人们对更快地为更大患者群体提供高质量产品的需求日益增长。除了经济效益外，单克隆抗体（mAbs）可治疗的疾病谱也在不断扩大，目前已包括自身免疫性疾病、移植后并发症、关节炎以及癌症7。 现代商业化单克隆抗体生产系统的平均产量通常在5–6 g/L范围内，并且仍在持续提高5。这一进展部分得益于CHO细胞的工程化改造以及利用高通量生物反应器改进生产流程筛选8。然而，蛋白质产量的大多数提升主要归因于工艺改进，包括培养基优化、细胞培养条件改善以及强化补料策略的进步7,9,10。营养补充不仅对细胞正常生长至关重要，也对高效生产高质量蛋白具有关键作用。此外，细胞需要按化学计量比例添加特定营养物质，这就要求对补料策略的优化有更深入的理解6,11。传统的优化方法包括单一培养基组分滴定以及采用混料设计进行培养基混合。然而，这些方法耗时较长、劳动强度大，并存在人为误差带来的风险12,13。
以往的培养基优化研究主要依赖摇瓶和1-2 L的生物反应器 ，但这些方法在原材料和人力成本方面可能过于昂贵。微孔板也曾被用于此类研究 ，但这些方法的可放大性有限。此外，这些方法仍可能需要进行多次耗时的实验，从而引入批间差异 ，掩盖了由培养基成分和补料策略引起的质量关键属性（CQA）变异14,15,16。因此，对高通量且高度一致的平行生物反应器系统的需求应运而生17,18,19,20。
由于传统台式生物反应器（0.5–5 L）运行成本高昂，微型生物反应器为评估生物来源药物的生产提供了一种降低成本的替代方案。21 台式搅拌罐生物反应器性能可靠，并可通过传感器阵列提供高密度数据。反馈控制系统便于操作过程的监控。然而，其组装、校准、清洗、人工成本、底物成本以及灭菌要求均使其运行费用昂贵且劳动密集。摇瓶和微孔板虽可部分缓解大规模生物反应器带来的成本和人工问题，但这些替代方法对工艺条件的控制能力较弱，且产生的数据密度低，通常仅能提供终点测量结果。22
此外，微生物反应器利用较小的工作体积，为细胞系和上游工艺开发提供了一种缩小规模的研究方法。由于微生物反应器实验规模较小，可通过降低能源、底物、人力、空间和公用设施的消耗，显著减少运行成本。23 微生物反应器与摇瓶类似，因其体积小而易于操作，但同时通过在线反馈控制pH、温度、溶解氧以及酸/碱消耗量 ，并实时输出包括尾气成分在内的质量参数数据，保留了传统台式生物反应器的优势。微生物反应器的规模支持高通量筛选，有助于克隆筛选和工艺开发。24
高级微尺度生物反应器已被证明是CHO细胞培养工艺表征与开发的有效工具18. 此处介绍一种由48个平行微型生物反应器组成的自动化ambr15系统，该系统 在放大研究中已显示出与传统的搅拌釜式反应器相当的性能，25 以类似于先前优化表达模型嵌合IgG1的CHO-DG44细胞系培养基成分的研究方式使用6比较并分析了不同培养基条件对生长和滴度的影响。本文介绍了一种运行微型生物反应器系统及分析粗制培养基样品的通用指南。
方案
1. 种子扩增培养
注意：本实验方案使用储存密度约为 3 × 107 个细胞/mL 的1 mL重组DG44 CHO细胞冻存液。不同CHO细胞系的稀释比例和培养时间可能有所不同。在实验前应预先测定所用细胞系的生长曲线，并据此进行相应调整。细胞最初在摇瓶中复苏，随后转移至旋转培养瓶中。根据将要运行的微生物反应器数量及目标接种密度，确定实验所需的摇瓶和旋转培养瓶数量。
- 迅速将CHO细胞冻存管浸入37 °C水浴中，直至仅剩少量冰晶时立即取出。用70%乙醇溶液和无尘纸擦拭管壁外表面以去污染，随后转移至生物安全柜中。
- 通过重悬细胞 轻柔地 通过反复吹打混匀，将1 mL细胞悬液转移至含有29 mL预热培养基的无菌125 mL通气摇瓶中，培养基中添加有8 mM L-谷氨酰胺和1×青霉素/链霉素。
注意： 除非另有说明，否则术语 "培养基" 在此方案中，此后将定义为 OptiCHO 培养基。 - 将摇瓶置于37 °C、8% CO₂的培养箱中2使用轨道摇床以130 rpm的速度振荡细胞。
- 每天使用自动细胞计数仪或使用血细胞计数板和台盼蓝染色法手动检测活细胞密度（VCD）。接种后72小时，将细胞传代（稀释）至新鲜培养基中（每次向细胞中添加培养基前均需预热至37 °C），最终体积为100 mL，置于125 mL的旋转培养瓶中。旋转培养物的培养条件与摇瓶培养相同，转速为70 rpm。
注意： 传代培养后，细胞密度应为 0.7–1 × 106 细胞/mL。确保最终密度不低于 0.5 x 106 细胞/mL。若在旋转培养瓶中接种的目标细胞密度无法在96小时内达到，则在此之后进行传代培养。 - 第三天（接种物制备前一日），向旋转烧瓶中加入新鲜的预热培养基，以维持细胞存活率≥90%。总体积不得超过125 mL。6
2. 运行自动化微型生物反应器系统
先决条件：用户必须接受过制造商提供的适当培训，并且必须熟悉该系统的安全和操作条件。
- 初始化并连接细胞计数仪
- 启动系统操作软件。在打开软件之前，请确保细胞计数仪（参见 材料表) 正在与相应的软件同步运行。细胞计数器已集成于该系统中。
- 在打开软件之前，请先连接到细胞计数仪的远程连接。单击远程桌面图标，然后单击 "连接。" 远程桌面连接成功后，打开细胞计数仪软件。安装新的试剂盒，清空台盼蓝废液，并对系统进行引液。
- 最小化远程连接，并使用现有实验作为模板打开微型生物反应器软件以创建新实验。命名并保存该实验。确保在软件的状态选项卡中自动细胞计数器已连接。也可在细胞计数器软件中检查其状态。
- 定义培养板与装载容器
注意： 请参阅 图1 用于确定耗材和试剂在培养站和操作台上的放置方向。夹紧板在使用前应采用重力循环模式（用于固体材料）进行高压灭菌。- 在开始运行前，于软件的mimic部分定义运行中所用的培养板。为每块培养板命名，并将其指定至微生物反应器培养系统中的相应板位。
- 使用24孔板进行培养基加样，并将其放置在培养工作站指定的板位上。按照图示将1 mL和4 mL移液器吸头盒分别放入相应区域 图1.
- 将一个24孔接种板放置于培养工作站相应的板位上。将单孔1倍磷酸盐缓冲液（PBS）板放置于1号板位，将单孔1 M NaOH板放置于2号板位，将24孔消泡剂板放置于7号板位（位置如图所示） 图1）。甲板编号在下方示意图中显示 "模拟" 软件中的标签页
- 在生物安全柜内拆开培养容器（配备曝气器），每个培养工作站放置十二个无菌培养容器。放置 高压灭菌处理 将夹具板固定在容器顶部。确保搅拌器插入孔的方向一致，以便于安装。
注意： 使用永久性标记笔在将培养容器放入培养站之前进行分类标记，以节省时间并避免收获时混淆。 - O形圈是夹板在反复高压灭菌后最先磨损的部件，因此建议在每次实验前高压灭菌前仔细检查。建议备用一个无菌夹板，以防O形圈失效。
- 将搅拌板放置在夹紧板上方，确保每个销钉均已牢固插入。使用提供的螺丝和旋钮固定夹紧板，将旋钮拧至手拧紧即可。为使夹紧板均匀就位，请交替拧紧左侧和右侧旋钮。
注意： 如果夹具未紧贴表面，或夹具板末端的螺丝未均匀拧紧，会导致溶氧（DO）控制出现问题。如果进行上述调整后仍无法解决溶氧问题，应检查O型圈，因板件密封不完全可能导致培养气体交换效率降低。
- 运行自动微型生物反应器软件
注意： 使用 "步骤" 按 Tab 键以编辑或创建新步骤。每个步骤需单独编程以启动和停止任何流程。点击 "插入步骤" 在“操作步骤”选项卡下点击按钮以创建新步骤，或双击现有步骤以进行编辑。程序步骤分为十个主要部分：启动、培养基加注、消泡剂添加、溶氧/ pH 控制、背景碱液添加、暂停 pH、接种、5倍细胞计数、10倍细胞计数、营养分析仪取样以及培养站关机。在批处理模式下运行时，通常运行时间为7至9天。- 系统启动并检测相应容器的存在。扫描培养容器附带的条形码。相同的条形码可用于装有空容器或未使用容器的培养工作站。
- 在检查溶解氧控制、通气及其他连接无误后，系统将启动预设程序。
注意： 即使出现错误，用户也可继续运行程序，但须自行承担风险，且仅在继续操作不会损害系统或干扰实验的前提下进行。例如，可关闭实验中未使用的某些容器的供气 这将显示为错误，但可跳过。
- 启动与培养基加注
- 系统首次搭建或培养基加样日被定为培养时间的第0天。
- 在启动部分，首先按照程序加载移液吸头，包括 1 mL 和 4 mL 吸头。若吸头已放置完毕，点击继续。将培养基板、1X PBS、1 M NaOH、消泡剂板、培养基加样板和接种板放置于指定的板位上；若已放置完毕，则按继续进入下一步。
- 作为启动程序的一部分，开始温度控制并将温度设定为 37 °C。开启搅拌，转速设为 1000 rpm，同时启动溶氧/pH 监测仪。
- 接下来，运行培养基加样程序。自动化微型生物反应器系统的液体处理装置将根据程序设定，将培养基从培养基板转移至培养容器中。所添加的培养基为OptiCHO，且具有不同的工艺条件。
注意： 一个24孔板中的两个孔足以将一个培养容器（13 mL）完全装满，因为每个孔最多只能容纳8 mL培养基。为防止液体处理仪在加样前混合培养基时吸入空气，每个孔使用7–8 mL培养基。 - 培养基补液完成后，将从消泡剂板中向培养容器加入 35 µL Ex-Cell 消泡剂。 静置30分钟，使培养基充分混匀，并使光学溶氧/pH传感器充分水化。
注意： 当培养过程中出现泡沫时，间歇性地添加与之前等体积的消泡剂。6 通过目视检测发泡情况，每天检查反应器容器是否存在发泡。一旦发现发泡，立即加入消泡剂。 - 开启溶氧（DO）/pH 控制，开始监测并记录培养基中的溶氧和 pH 值。使溶氧达到设定值 50%，此过程至少需要 2 h。
- 溶氧平衡后，开启背景碱液添加，使所有培养容器的pH值达到7.1设定点。让溶氧和pH值过夜平衡，并确保充分水化。
- 暂停pH - 第1天pH偏移
- 第二天（记为第1天），执行暂停的pH步骤，分析选定的培养容器并确定pH校正偏移量。
注意： 用于校正pH的反应容器取样数量由用户自行确定。如果能够充分代表生物反应器群体，则不一定需要从每个反应器容器中取样。 - 将样本管架板放置在指定的托盘位置上，并将微型离心管打开管盖后置于其旁边。液体处理系统将根据程序设定，向离心管中加入 600 µL 细胞培养液。
- 立即 取出样品，并在已正确校准且已完成质控（QC）检测的营养物生物分析仪上测定pH值（见下文， "每日营养物质与代谢物分析").
注意： 样本需在采集后立即单独检测，以避免因接触空气导致 CO₂ 逸出而引起的 pH 变化。2 样品中的物质可能导致pH值变化。 - 命中 "继续" 每次样品处理后均需执行此步骤，否则下一步将无法进行。
- 在软件中输入来自外部 FLEX 的 pH 值， "编译" 自动校正采样容器的偏移量。手动计算样本容器所得偏移量的平均值，并将该数值输入至标签页中“用户pH偏移量”列下方 "血管数据"然后将平均偏移量应用于所有培养容器。让pH平衡至少2-3小时，之后即可接种培养容器。
- 第二天（记为第1天），执行暂停的pH步骤，分析选定的培养容器并确定pH校正偏移量。
- 接种
- 测量VCD后，将旋转烧瓶中的全部内容物转移至无菌的250 mL锥形离心管中，在室温下以140 × g离心10分钟，使细胞沉淀。弃去旧培养基，用足量新鲜培养基重悬细胞，使最终密度为1×10⁶ cells/mL。6 细胞/mL，即在将接种物加入培养容器后。
- 将悬浮的细胞加入无菌带盖24孔板的指定孔中。每孔加入3 mL接种物，其中2 mL将被移出，作为每个培养容器的接种物。
- 将接种平板放置在生物安全柜内指定的台面上。在将带盖的接种平板放入生物安全柜之前，务必用70%酒精喷洒其外部表面。
- 使用自动细胞计数器进行细胞计数
- 接种后，将培养容器平衡至少一小时。一小时后，执行程序中的5X细胞计数步骤。5X表示用于读取细胞浓度的稀释倍数。
注意： 细胞处于迟滞期时，初始使用5倍细胞计数；当细胞进入对数生长期后，则使用10倍细胞计数。根据样本体积与稀释液体积，仪器会自动校正稀释因子，并相应调整最终结果。 - 液体处理仪首先向细胞计数杯中加入 480 µL 的 1X PBS，随后加入 120 µL 培养容器中的细胞培养液。然后使用自动细胞计数仪读取细胞数量。对所有培养容器重复此步骤。
- 细胞计数是培养第一天的最后一步。软件每天会记录细胞计数数据（活细胞密度和细胞活力），同时记录溶氧（DO）和pH数据。
注意： 在运行过程中，使用70%异丙醇至少清洗细胞计数杯两次，以防止管路堵塞。每次细胞计数后，管路和流动池会自动清洗。
- 接种后，将培养容器平衡至少一小时。一小时后，执行程序中的5X细胞计数步骤。5X表示用于读取细胞浓度的稀释倍数。
- 暂停pH - 第2天pH偏移
- 在培养的第2天，重复以下步骤 "暂停的 pH" 使用除初始暂停pH步骤中采样所用以外的其他培养容器进行下一步。
注意： 对更多血管群体进行暂停pH采样将为pH校正提供更佳的偏移值。因此，不要采样前一日已用于暂停pH测量的相同血管。
- 在培养的第2天，重复以下步骤 "暂停的 pH" 使用除初始暂停pH步骤中采样所用以外的其他培养容器进行下一步。
- 每日营养物质与代谢物分析
- 从培养第2天开始至实验结束，将采集样品进行营养成分分析，并使用营养生物分析仪进行检测。
- 将样本管架板放置在指定的托盘位置上，并将微型离心管打开管盖后置于其旁边。液体处理系统将根据程序设定，将细胞培养液分配至各离心管中。
注意： 在最初几天（第2至第4天），从培养容器中取出的样品量为300 µL。使用液体处理仪加入300 µL的1×PBS进行稀释。此操作旨在维持培养液体积，防止液面低于10 mL。此外，经过稀释后，最初几天的营养物浓度仍处于仪器检测范围之内。 - 将样品放入分析仪样品盘中，进行营养成分分析。
注意： 将不需当天分析的样品进行冷冻保存。
- 系统关闭
- 终止运行时，首先关闭温度控制，然后关闭搅拌；其次，停止溶氧/pH 控制及背景碱液添加；接着，停止所有其他控制；最后，停止系统监控。
- 拧开夹具和搅拌板，取出培养容器。使用无绒布清洁培养工作站内部。将干燥板放置在培养工作站上并拧紧固定。
注意： 干燥循环仅适用于该系统的冷却版本，标准版本无需此步骤。 - 执行程序中的2小时干燥循环。使用超纯水清洁夹紧板，随后用70%异丙醇（IPA）冲洗，以去除管路中可能凝结的液体。用空气冲洗，以去除任何残留液体。
- 点击 "停止" 在生物反应器软件中，干燥循环结束后。
3. 细胞培养物收获
- 将反应器中的细胞培养液转移，并在室温下以 1,962 × g 离心 5 分钟，收集细胞沉淀。
- 弃去上清液。使用 0.22 µm PVDF 滤膜对倒出的细胞培养液进行无菌过滤。
- 将无菌细胞培养液每份 1 mL 分装至 1.5 mL 离心管中用于滴度分析。将分装的 1 mL 样品管保存于 -20 °C。其余收获的细胞培养液使用 快速蛋白液相色谱系统进行纯化。6
4. 测定IgG滴度
注意： 本文简要概述了使用 proteinA 生物传感器系统运行和分析样本的流程。所有检测参数（例如 温度、读取时间、转速（rpm）、等）必须针对每种样本类型通过实验经验确定。
- 打开系统并让光源预热 至少 1 小时。将样品从冷冻机中取出，使其解冻并平衡至室温。
- 在系统软件中，将板温度设置为 26 °C。将所需数量的 Protein A 提示头用样品基质预浸泡例如 细胞培养基）用于 至少 30分钟。
注意： 最佳温度需通过实验确定。本文采用26 °C，以尽量减少长时间分析过程中的样品蒸发，并使仪器能够维持稳定的温度（比环境温度高数度）。样品 必须 在测量前，将样品板置于样品台上孵育至少10分钟，使其预平衡至选定的检测温度。 - 使用相同抗体（浓度为10 mg/mL）构建蛋白标准曲线，并在样本基质中进行连续稀释即 在需要检测的范围内。
注意： 获得高浓度的抗体对于最大限度地减少因稀释引起的基质效应至关重要，但同样重要的是避免过度浓缩抗体而导致聚集。建议对每块样本板进行板内标准曲线测定。至少必须使用阳性对照，以校正不同移液枪尖之间以及不同板之间的变异。每次均应建立新的标准曲线 必须 每次使用新的蛋白A柱尖批次时，都应生成相应的验证数据。 - 设计样品板（示例请参见 图2）。在使用再生的蛋白A检测中，最多可分析80个样品，包括未知培养样品、标准品和对照品。每块待测微孔板使用一个蛋白A探针，依次测量板上最多10个样品（第1至第10列），每检测一个样品之间进行一次再生循环。
注意： 建议将整块板的第一行（A行）用作阴性对照和参考。在本实验中，B行和C行用于两种阳性对照，分别位于线性响应范围的下限和上限。这可确保每个探针在分析样本前均测量阴性与阳性对照。此设置也有助于在分析软件中简化参考值的扣除。其余孔则用于未知样本。若某一行中存在样本空缺，则该孔必须加入基质以防止探针干燥即 A2 至 G2 孔含有样品，而 H2 孔不含。确保 H2 孔中加入样品基质，以防止移液吸头在进行 H3 孔加样前干燥。最后，避免因使用同一套吸头分析多块微孔板而导致吸头耗尽。建议每块微孔板均使用全新的、未经再生的吸头套装。 - 准备样品以进行分析 轻柔地 混合，可通过倒置或移液操作，随后短暂离心以使样品聚集于离心管底部。对于高浓度样品，需使用样品基质进行适当稀释，制备稀释重复样本。
注意： 抗体在蛋白A生物膜层干涉测量（BLI）中的线性结合范围会因抗体种类、检测条件和基质的不同而有所差异。应在实验前通过实证方法确定该范围，以确保使用适当的样品稀释度。 - 尽可能在接近检测时间时制备96孔样品板。 确保各孔中无任何气泡。 使用洁净的移液枪头或通过离心去除气泡。
- 将酶标板装入系统，并使用默认程序运行检测 "高灵敏度可再生检测方法" 在数据采集软件中进行分析。使用HT数据分析软件进行处理。
注意： 若因条件限制需提前制备平板，应使用封口膜密封，以防蒸发。根据预期滴度，可能需要调整采集速率和时间。请参考说明书以获取指导。 - 使用数据分析软件，通过标准曲线和初始斜率（IS）功能，采用线性点对点拟合方法进行参比扣除，并计算未知样品的浓度。
结果
在整个细胞培养过程的操作期间监测关键工艺参数及其他细胞培养参数是生物工艺中的一个重要方面。使用细胞计数仪和营养分析仪定量了表征细胞生长、营养物质消耗和副产物形成的五个属性。所有培养条件下的细胞计数均每日获取。平均活细胞密度及其活力，以及相应的±1标准差（SD）区间，如图3所示。营养物质和副产物的浓度变化曲线也展示了培养物在稳定期期间的±1 SD区间。该曲线的斜率代表了葡萄糖和谷氨酰胺的平均消耗速率以及乳酸的生成速率。总体而言，这些结果证明了在微型生物反应器系统中监测这些参数的可行性，同时也表明该微型生物反应器系统能够将这些参数维持在较窄的范围内。
使用蛋白A生物传感器系统对收获的细胞培养基（经0.22微米PVDF滤膜过滤后）进行检测，以量化细胞培养的总生产率。每个细胞的特异性生产率范围为0.87 pg/cell-d至1.15 pg/cell-d，如图所示 图4根据这些结果，可对多种条件进行研究，以选择最佳的培养基成分和补料策略，在最小化实验操作投入的同时，最大化目标蛋白的产量。
图 1： 微型生物反应器系统的布局，包含 4 个培养站（CS），每个培养站有 12 个反应容器。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2： 使用ProteinA生物传感器系统进行基本定量并包含再生实验的示例样品板设置。 第1行（红色“R”）保留用于参考样品（即不含分析物的基质）；第2行（蓝绿色）为一组标准品（浓度单位为 µg/mL）；第3和第4行（橙色）分别为低值和高值阳性对照组（分别标记为“PL”和“PH”）；第5至第10行（紫色）包含待测样品；第11和第12行（灰色）为程序默认的再生缓冲液（“R”）和中和缓冲液（“N”）位置。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3： a) 分批培养过程中平均活细胞密度和细胞活力的变化曲线。误差线表示±1个标准差（SD），以体现微型生物反应器系统对细胞生长的精确控制。b) 葡萄糖和谷氨酰胺的平均营养物变化曲线，以及乳酸的平均副产物变化曲线。误差线表示±1个标准差（SD），以体现微型生物反应器系统对培养基成分的严格控制。（N=3，所有条件均设三个重复）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4： 不同培养基条件下平均比生产率的代表性箱线图。 （N=3，所有条件均设三个重复） 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
正确且高效地运行自动化微型生物反应器系统，需要及时执行多个自动化步骤。其中最重要的环节之一是软件编程。如果在编写程序时出现任何错误，实验中就可能发生严重问题，导致工艺过程、补料策略、取样策略或最终产品质量出现意外变化，从而影响研究结果的有效性。运行系统的另一个重要方面是正确安装并均匀拧紧夹紧板，以确保溶解氧（DO）控制正常。夹紧板未均匀拧紧最常见的表现是1、6、7和12号反应器（角落反应器）的DO测量值出现异常波动。整体DO不稳定通常表明夹紧板上的气体进气管路密封垫圈已松动，这种情况可能阻碍系统达到设定的DO目标值。在启动实验时另一个常见的误区是，在接种步骤中让细胞静置时间过长，导致细胞沉降。细胞静置时间越短，就越能减少按时间顺序向各反应器加入的接种细胞数量逐渐降低的风险，这种偏差可能无意中严重影响研究结果。因此，建议采用分阶段接种方式，即 依次对每个培养站进行接种，并在各次接种之间设置暂停步骤，确保细胞在接种板中静置时间不超过15分钟。
在日常使用中，保持无菌至关重要。尽管系统位于生物安全柜内，但由于频繁地将物品移入和移出操作台，无菌状态并不能得到保证。因此，所有进入操作台的物品都必须用70%异丙醇喷洒消毒。其次，必须确保培养过程中产生尽可能少的泡沫；培养基可能堵塞通气管路和排气管路，导致夹板甚至下方核心组件的损坏。在任何微型生物反应器的实验方案设计中，预防性添加消泡剂的步骤都极为关键。一旦发生"泡沫溢出"情况，遵循制造商提供的清洁规程将有助于避免夹板的永久性损坏。此外，在细胞密度较低或进行批次培养时，使用非鼓泡式反应器可能更为有利，因为较高的表面积与体积比即使在无鼓泡器的情况下也能实现有效的氧气交换。然而，对于高细胞密度培养或灌流培养，非鼓泡式反应器可能并不适用，因为其顶空体积不足以满足细胞不断增长的氧气消耗需求。
微生物反应器系统具有多种优势，因为它能够在小规模下并行运行多个受控培养，且控制程度优于摇瓶。17 因此，该系统有助于开展筛选研究、实验设计（DoE）、高通量克隆研究以及转染研究。自动化的液体处理还可减少操作人员之间的差异，同时最大限度地降低受过培训人员繁琐且耗时的工作负担。尽管该系统具备多项优势，但仍存在一些需要考虑的关键缺点。首先，15 mL的培养体积显著限制了过程取样和最终收获物的量，而目前已有多种其他可选的小型生物反应器（最大可达500 mL）上市。该系统的一项最新进展是将自动化的微尺度生物反应器与Nova Biomedical公司的BioProfile FLEX 2分析仪整合，从而通过减少细胞密度和营养分析所需的样品体积，缓解了过程取样受限的问题。该系统的优势可能包括快速设置以及几乎无需清洗，从而带来操作成本的节约；然而，在长期项目中应考虑一次性使用单元的成本，因为其购买成本可能高于可重复使用的传统系统。
本文讨论的方法主要适用于批次模式的细胞培养，但可根据用户需求进行修改。每个培养站可独立控制温度，而溶氧（DO）和pH可在单个反应器容器的水平上进行调节。Sartorius还提供专为微型生物反应器系统设计的实验设计（DoE）规划软件。利用制造商提供的新型DoE软件开展大规模的DoE研究，有助于培养基和添加剂的优化。尽管本文未使用，该微型生物反应器系统也支持补料分批培养研究。目前该系统尚未针对灌注式细胞培养进行优化。然而，已有少量研究和试验尝试在现有的微型生物反应器系统中模拟灌注式细胞培养操作。26 通过细胞沉降法，可对该方法进行修改以模拟高密度灌注培养。通过调节移液管插入反应器的深度并优化沉降时间，可实现培养基的去除与补充，从而模拟灌注模式的培养。在这一发展领域中，已有新型产品问世，若需进行灌注模式培养，这些产品可能比本文所述系统表现更优。
综上所述，本研究展示了利用自动化微型生物反应器及相关分析方法进行中国仓鼠卵巢（CHO）细胞培养操作，以生产并表征一种模型IgG1单克隆抗体。研究强调了小规模微型生物反应器在生物工艺制造中的作用，及其对细胞培养工艺开发和培养基筛选的影响。尽管使用自动化小规模系统具有诸多优势，但要充分实现其效益，必须具备对工艺的深入理解以及全面的分析表征能力。本研究为使用者提供了使用自动化微尺度反应器系统的操作指南，该系统可根据具体研究需求进一步开发与优化。
披露
免责声明：本出版物反映的是作者的观点，不应被解释为代表美国食品药品监督管理局（FDA）的观点或政策。
致谢
作者感谢Scott Lute提供的分析支持。本工作的部分内部资金和支持由CDER关键路径计划（合同号：CA #1-13）提供。本项目部分得益于美国食品药品监督管理局生物技术产品办公室实习/研究参与计划的资助，该计划由橡树岭科学与教育研究所通过美国能源部与FDA之间的机构间协议进行管理。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CHO DG44 细胞系 | Invitrogen | A1100001 | |
| ambr 15 自动化微型生物反应系统 | Sartorius | 001-2804 | 自动化微型生物反应器 |
| ambr 15 细胞培养 24 孔一次性生物反应器 - 鼓泡式 | Sartorius | 001-2B80 | |
| 1 mL 一次性移液枪头，已灭菌 | Sartorius | A-0040 | |
| 5 mL 一次性移液枪头，已灭菌 | Sartorius | A-0039 | |
| 24 孔深孔板 | Sartorius | A-0038 | |
| 1 孔板 | Sartorius | A-0068 | |
| Vi-Cell XR 细胞计数仪 | Beckman Coulter | 731050 | 自动细胞计数器 |
| EX-CELL 抗泡剂（γ射线灭菌） | Sigma-Aldrich | 59920C-1B | |
| CD OptiCHO AGT 培养基 | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
| 200 mM L-谷氨酰胺 | Corning | 25-005-CV | |
| 100X 青霉素/链霉素 | Corning | 30-001-CI | |
| 125 mL F-底摇瓶（无菌，通气） | Fisher Scientific | PBV12-5 | |
| 125 mL 玻璃旋转瓶 | Corning Life Sciences Glass | 4500-125 | |
| 250 mL 聚丙烯锥形离心管（无菌） | Nalgene (Thermo Scientific) | 376814 | |
| TC20 自动细胞计数仪 | BioRad Laboratories, Inc. | 1450103 | |
| 台盼蓝 | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 10x PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BioProfile FLEX 分析仪 | Nova Biomedical | 49418 | 营养成分分析仪 |
| Octet Red 96 | Pall FortéBio | 99-0042 | Protein A 生物传感器 |
| Protein A 浸入式即读生物传感器 | Pall FortéBio | 18-5010 | |
| 聚丙烯 96 孔微孔板，F 型底，烟囱式，黑色 | Greiner Bio-One | 655209 |
参考文献
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