本文介绍了一种通过自显影技术定位鲸类肝脏和肾脏组织中银（Ag）的实验方案。此外，还开发了一种名为鲸类组织学银检测法（cetacean histological Ag assay, CHAA）的新测定方法，用于估算这些组织中的银（Ag）浓度。
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摘要
摘要
银纳米颗粒（AgNPs）因其强效的抗菌作用，已被广泛应用于纺织品、化妆品和保健产品等商业产品中。它们也可能被释放到环境中，并在海洋中积累。因此，AgNPs已成为银（Ag）污染的主要来源，公众对银及其化合物环境毒性的关注日益增加。既往研究已证实银在生产者体内的生物累积作用以及在消费者/捕食者体内的生物放大作用。鲸类作为海洋食物链的顶级捕食者，可能已受到银/银化合物的负面影响。尽管可通过电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定鲸类组织中的银/银化合物浓度，但该方法受限于高昂的设备成本以及对组织储存和前处理的要求。因此，利用福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织样本，结合自显影（AMG）技术与图像定量分析，可作为辅助方法，用于定位银在器官亚结构水平的分布，并估算鲸类组织中的银浓度。AMG阳性信号主要表现为近端肾小管上皮细胞、肝细胞和库普弗细胞胞质内大小不一的棕至黑色颗粒。偶见部分无定形的金黄色至棕色AMG阳性信号出现在某些近端肾小管的管腔及基底膜区域。用于估算银浓度的检测方法称为鲸类组织学银检测法（CHAA），该方法是基于AMG图像定量分析数据与ICP-MS数据建立的回归模型。结合AMG与CHAA技术对重金属进行定位和半定量分析，为时空分布及跨物种研究提供了便捷的方法学支持。
引言
由于具有显著的抗菌效果，银纳米颗粒（AgNPs）已被广泛应用于纺织品、化妆品和保健品等商业产品中1,2。因此，AgNPs的产量以及含AgNPs产品的数量逐年增加3,4。然而，AgNPs可能释放到环境中，并在海洋中积累5,6。它们已成为银污染的主要来源，公众对银环境毒性的关注也日益增加。
AgNPs 和 Ag 在海洋环境中的状态复杂且不断变化。先前的研究表明，AgNPs 可以保持颗粒形态、发生聚集、溶解、与不同化学物质反应，或由 Ag+ 离子重新生成7,8。多种 Ag 化合物（如 AgCl）已在海洋沉积物中被发现，这些化合物可被底栖生物摄取并进入食物链9,10。根据此前在中国台湾西南部海岸七股潟湖区域开展的一项研究，海洋沉积物中 Ag 的浓度极低，接近地壳丰度，而鱼类肝脏组织中的 Ag 浓度通常低于检测限（< 0.025 μg/g 湿重/湿重）11。然而，其他国家的先前研究已表明，鲸类肝脏中的 Ag 浓度相对较高12,13。鲸类肝脏中 Ag 浓度具有年龄依赖性，提示其体内 Ag 的来源极有可能是其所摄食的猎物12。这些发现进一步表明 Ag 在较高营养级动物体内存在生物放大效应。作为海洋中的顶级捕食者，鲸类可能已受到 Ag/Ag 化合物带来的不利健康影响12,13,14。尤为重要的是，与鲸类相似，人类也是哺乳动物，Ag/Ag 化合物对鲸类造成的不良健康影响也可能在人类中发生。换句话说，鲸类可能可作为海洋环境和人类健康的哨兵动物。因此，Ag 在鲸类体内的健康效应、组织分布及其浓度备受关注。
尽管可以通过电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定鲸类组织中银/银化合物的浓度，但ICP-MS的应用受限于其高昂的设备购置与维护成本，以及对组织储存和前处理的要求12,15。此外，由于后勤困难、人力不足以及相关资源缺乏，在大多数搁浅鲸类的调查中通常难以全面采集组织样本12。用于ICP-MS分析的冷冻组织样本因冷藏空间有限而难以长期保存，且可能因制冷设备故障而导致样本丢失12。上述种种限制因素阻碍了利用冷冻组织样本通过ICP-MS分析来开展鲸类组织中污染物水平的研究。相比之下，在对搁浅死亡的鲸类进行尸检时，更容易采集福尔马林固定的组织样本。因此，有必要开发一种简便且低成本的方法，用于检测和测定福尔马林固定组织样本中的重金属含量。
尽管碱金属和碱土金属在福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）过程中其亚器官分布和浓度可能发生改变，但对过渡金属（如 Ag）的影响较小16。因此，FFPE 组织被认为是进行金属定位与定量的理想样本资源16,17。自显影技术（AMG）是一种组织化学方法，可在 FFPE 组织切片上将重金属放大为大小不一、呈金黄色至黑色的 AMG 阳性信号，这些被放大的重金属可在光学显微镜下观察到18,19,20,21。因此，AMG 方法可提供有关重金属在亚器官水平分布的信息。由于电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）仅能测定器官整体水平的重金属浓度，AMG 方法可为研究生物系统中重金属的代谢途径提供重要的补充信息18。此外，已有研究将 ImageJ 等数字图像分析软件应用于组织切片的定量分析22,23。FFPE 组织切片上大小不一的金黄色至黑色 AMG 阳性信号可通过图像定量分析进行量化，并用于估算重金属的浓度。尽管通过 AMG 方法结合图像定量分析无法直接测定 Ag 的绝对浓度，但可根据图像定量分析与 ICP-MS 所得数据建立回归模型进行估算，该方法称为鲸类组织学银测定法（cetacean histological Ag assay, CHAA）。考虑到大多数搁浅鲸类个体中通过 ICP-MS 测定 Ag 浓度存在困难，CHAA 成为一种有价值的辅助方法，可用于估算因缺乏冷冻组织样本而无法通过 ICP-MS 分析测定的鲸类组织中 Ag 的浓度。本文描述了一种组织化学技术（AMG 方法）的操作流程，用于在亚器官水平定位 Ag，以及一种名为 CHAA 的测定方法，用于估算鲸类肝脏和肾脏组织中 Ag 的浓度。
图1：鲸类组织银定量检测法（CHAA）建立与应用流程图，用于估算银浓度。 CHAA = 鲸类组织银定量检测法，FFPE = 甲醛固定、石蜡包埋，ICP-MS = 电感耦合等离子体质谱法。请点击此处查看此图的高清版本。
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方案
本研究遵循国际指南进行，鲸类组织样本的使用已获得中国台湾农业委员会的许可（研究许可证号 104-07.1-SB-62）。
1. 用于ICP-MS分析的组织样本制备
注意：肝脏和肾脏组织样本取自新鲜死亡且轻度自溶的搁浅鲸类动物24，共包括4个不同物种的6头搁浅鲸类，分别为1头银鲸（Grampus griseus，Gg）、2头小抹香鲸属（Kogia spp.，Ko）、2头 Hose 鲛鲸（Lagenodelphis hosei，Lh）和1头细斑原海豚（Stenella attenuata，Sa）。每头搁浅鲸类均有用于个体识别的野外编号。组织样本的制备按照 M.H. Chen 实验室建立的方法进行，ICP-MS 分析亦由 M.H. Chen 实验室完成11,13,25。
- 采集搁浅鲸类的肝脏和肾脏组织用于ICP-MS分析，并将组织样本储存于−20 °C，待后续使用。
- 从同一只搁浅鲸类个体中采集配对的肝脏和肾脏组织用于AMG分析（详见步骤2）。
- 使用不锈钢解剖刀切除用于ICP-MS分析的组织样本外层，将内部组织切成约1 cm3的小块，放入自封式塑料袋中。通常每袋装入10 g组织。
- 将装有组织样本的塑料袋在−20 °C下保存，以备后续操作使用。
- 将1 cm3的组织小块置于冷冻干燥系统中（−50 °C，真空泵抽速至少98 L/min，0.002 mBar），干燥至少72小时，直至通过称重确认质量恒定，完全干燥。
- 使用匀浆器将干燥后的组织块研磨成粉末，用于后续组织消解。
- 准确称取0.3 g均质后的冻干样品，置于30 mL聚四氟乙烯（PTFE）瓶中，加入10 mL 65% w/w硝酸。
- 盖上PTFE瓶盖，但不要完全拧紧。
注意：此操作可使瓶内产生棕色烟雾并在瓶内回流，促进消解，直至棕色烟雾消失、液体变澄清。 - 将消解样品置于电热板上加热，从30 °C逐步升温至110/120 °C（根据棕色烟雾生成情况调整），持续2至3周，直至PTFE瓶中的褐色气体变为无色，瓶内液体变为透明的淡黄绿色或完全澄清。
注意：加热过程应在化学通风橱中进行。 - 在120 °C下继续加热消解样品，蒸发PTFE瓶中的硝酸，直至剩余体积为0.5–1 mL。
注意：加热过程应在化学通风橱中进行，并持续监测温度上升，确保无褐色气体从PTFE瓶盖处泄漏。 - 拧紧瓶盖，于室温下冷却约1小时。
- 在25 mL容量瓶上放置装有滤纸的漏斗，用1 M HNO3冲洗残留液体，定容至25 mL。
注意：需至少冲洗瓶子三次，瓶盖两次。 - 通过使用标准参考物质（包括DOLT-2（狗鲨肝脏）和DORM-2（狗鲨肌肉））验证ICP-MS分析的分析质量。
- 每个分析样品进行双份测定，标准参考物质进行三份测定。
- 计算每个分析样品银浓度的平均值，并以干重为基础表示数据（μg/g 干重）。
2. AMG 分析用组织样本制备
- 从搁浅的鲸目动物中采集配对的肝脏和肾脏组织用于自显影显微术（AMG）分析，并将其固定于10%中性缓冲甲醛溶液中，直至使用。
注意：将组织样本置于塑料瓶中，用10%中性缓冲甲醛溶液（NBF，pH 7.0）固定24至48小时。NBF的体积应至少为组织体积的10倍以上。 - 使用不锈钢一次性切片刀修整甲醛固定的肝脏和肾脏组织，并将修整后的组织块放入带标签的包埋盒中。
注意：每个组织块的尺寸应约为2 cm × 1 cm，厚度不应超过3 mm。将同一动物的肝脏和肾脏组织置于同一个包埋盒中。 - 使用组织处理机对修整后的组织块进行脱水处理，依次经过梯度乙醇（70% 1小时，80% 1小时，95% 1小时，95% 2小时，100% 1小时×2个染色缸，100% 2小时）、非二甲苯试剂（分别在不同染色缸中处理1小时和2小时），然后将脱水后的组织样本浸入石蜡中（分别在不同染色缸中处理1小时和2小时）。
- 将脱水后的组织样本置于钢制组织学模具底部，并用石蜡包埋。
- 将甲醛固定石蜡包埋（FFPE）的组织块置于冷台上冷却，直至石蜡完全凝固。使用切片机修整FFPE组织块，直至暴露出组织表面。
- 将FFPE组织块在−20 °C下冷却10分钟，然后用切片机以5 µm厚度进行切片。
- 在水浴锅中加入45 °C的重蒸水。使用镊子和刷子将组织切片带提起，并使其漂浮在温水表面。
- 用镊子将组织切片带分开，取一片置于显微镜载玻片上。
- 将载玻片置于玻片加热器上，在37 °C下过夜干燥。
- 将载玻片放入玻片架中，依次浸入三个盛有纯非二甲苯试剂（每缸约200至250 mL）的染色缸中，分别脱蜡8分钟、5分钟和3分钟。
- 将组织切片在玻片架中通过梯度乙醇溶液（100%乙醇两次，90%乙醇一次，80%乙醇一次，每次1分钟）进行水化处理，然后用重蒸水冲洗。
注意：各染色缸中溶液体积约为200至250 mL。每次洗涤30秒即可。 - 用含0.5% Triton X-100的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗组织切片，再用PBS洗涤数次，最后用重蒸水冲洗。
注意：各染色缸中溶液体积约为200至250 mL。每次洗涤30秒即可。 - 在避光条件下，取银增强试剂盒提供的三种组分（引发剂、调节剂和激活剂）等量混合，并充分混匀。
注意：调节剂和激活剂溶液具有黏性，建议使用宽口移液器吸头（或剪去吸头尖端以扩大开口）。每张载玻片通常需300 μL混合液（根据组织切片大小调整）。因此，若处理10张载玻片，则每种组分（引发剂、调节剂、激活剂）各需1000 μL（混合液总量为3000 μL，供10张载玻片使用）。 - 将组织切片在混合液中室温避光孵育15分钟，确保混合液完全覆盖载玻片上的组织切片。孵育时间过长可能导致假阳性AMG信号。
- 用重蒸水洗涤载玻片，然后用苏木精复染10秒。
- 用流动自来水冲洗载玻片，干燥后用封片剂封片。
- 在光学显微镜下观察载玻片。
- 使用连接数字相机的计算机成像软件，对每张组织切片随机采集10张40倍物镜下的组织学图像。
3. 组织学图像中AMG阳性值的半定量分析
注意：AMG 阳性值表示 AMG 阳性信号区域所占的百分比。
- 使用图像分析软件（ImageJ）分析组织学图像。
- 通过点击 文件 | 打开 打开组织学图像。
- 通过点击 图像 | 类型 | RGB 栈 将选定的图片拆分为三个颜色通道（红色、蓝色和绿色）。
- 使用蓝色通道定量 AMG 阳性信号。当使用苏木精染色作为细胞核复染时，蓝色通道通常可减少细胞核中的假阳性信号（图 2）。
- 使用阈值工具（图像 | 调整 | 阈值）测量每张组织学图像中 AMG 阳性信号所占的百分比面积。
- 根据细胞核和/或红细胞中是否存在假阳性区域，手动调整每张组织学图像的阈值截断值（从 90 到 110）。
注意：默认设置下，AMG 阳性信号应以红色高亮显示。 - 点击 分析 | 设置测量值，并勾选 面积分数 选项，以记录面积分数。
- 点击 分析 | 测量。每张组织学图像的阳性百分比面积将在 结果 窗口的 %面积 列中显示。
- 对每张组织切片的 10 张组织学图像的阳性百分比面积取平均值，并将该结果定义为该组织切片的 AMG 阳性值。
图2：在不同颜色通道下核假阳性信号的存在情况（复染剂：苏木精染色）。 典型的核假阳性信号由黄色箭头指示。PPA = 阳性区域百分比。 请点击此处查看该图的放大版本。
4. 通过回归模型建立鲸类组织学Ag检测法（CHAA）
注意：以下分析在 Windows 版 Prism 6.01 中进行。
- 评估ICP-MS结果与AMG阳性值之间的相关性。
- 打开软件，创建一个新的项目文件，并选择XY和相关性分析。
- 输入数据，包括ICP-MS结果和AMG阳性值。
- 点击分析，在XY分析类别下选择相关性，通过Pearson相关性分析评估ICP-MS结果与AMG阳性值之间的关联强度。
注意：ICP-MS结果与AMG阳性值必须彼此呈正相关；否则不应建立后续的回归模型。 - 通过统计软件12,26,27，对包括线性回归、二次回归、三次回归以及过原点线性回归在内的回归模型进行统计学比较。
注意：如果回归模型生成了不合理的银浓度，则应放弃该回归模型12。 - 返回数据表（左侧面板），在XY分析类别下点击分析 | 非线性回归（曲线拟合） | 确定。
- 在参数：非线性回归窗口中，在拟合页面选择不同的回归模型，然后在比较页面对不同回归模型进行比较。
- 在比较页面中，选择比较方法，包括额外平方和F检验和赤池信息准则（AIC）。根据比较方法的结果，在CHAA中选用相对合适的回归模型。
- 利用CHAA估算未知银浓度的鲸类肝脏和肾脏组织中的银浓度。
- 评估CHAA在肝脏和肾脏组织中的准确性和精密度。图3展示了精密度与准确性的区别。
- 准确性：根据已知银浓度与估算银浓度之间的差异，计算平均标准差（SD）。
- 精密度：对同一FFPE组织连续切片的AMG阳性值进行重复测量（至少三次重复），根据已知与估算银浓度之间的差异，计算肝脏或肾脏组织测量值的平均标准差（SD）。
注意：评估准确性和精密度的方法如图4所示。
图3：准确度与精确度的区别。 准确度指测量值与真实值的接近程度（即通过ICP-MS测定的Ag浓度）；精确度指测量的重复性（即三次重复组织切片中AMG阳性值重复测量结果之间的一致性）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：评估准确度与精密度方法的示意图。 CHAA = 鲸类组织学银检测法；FFPE = 甲醛固定、石蜡包埋；ICP-MS = 电感耦合等离子体质谱法；Ai = 每对匹配组织样本通过ICP-MS测定的各银浓度值；Bi = 每对匹配组织样本通过CHAA估算的各银浓度值；Ci、Di 和 Ei = 每对匹配组织样本中三个重复样本通过CHAA估算的各银浓度值；i = 1 至 n。准确度与精密度测试的原始数据请参见代表性结果部分。请点击此处查看该图的放大版本。
5. 通过中子活化分析法估算银浓度。
- 采集搁浅鲸类的肝脏和肾脏组织，并用10%中性缓冲甲醛固定。
- 对甲醛固定的组织进行常规处理（详见步骤2）。
- 使用冷蒸气原子吸收光谱法（CHAA）测定银浓度未知的鲸类肝脏和肾脏组织中的银（Ag）浓度（详见步骤3和4）。
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结果
鲸类肝脏和肾脏组织中AMG阳性信号的代表性图像如图所示 图5AMG 阳性信号表现为近端肾小管上皮细胞、肝细胞和库普弗细胞胞质内大小不一的棕褐色至黑色颗粒。偶尔可在部分近端肾小管管腔及基底膜处观察到无定形的金黄色至棕色 AMG 阳性信号。肝脏和肾脏组织中 ICP-MS 检测结果与 AMG 阳性值之间存在正相关关系，根据剩余平方和 F 检验及 AIC 判断，优先采用过原点的线性回归分析。12,26,27在准确度测试中，肝脏和肾脏CHAA的平均标准差分别为3.24和0.16。在精密度测试中，肝脏和肾脏CHAA的平均标准差分别为2.8和0.35。准确度与精密度测试的原始数据汇总于 表1. 六头搁浅鲸类肝脏和肾脏组织中AMG阳性值、通过CHAA估算的Ag浓度以及通过ICP-MS测得的Ag浓度汇总于
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讨论
本研究的目的是建立一种辅助方法，用于在亚器官水平上评估银（Ag）的分布，并估算鲸类组织中的银浓度。当前的实验方案包括：1）通过电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定鲸类组织中的银浓度；2）对已知银浓度的配对组织样本进行银增强显微术（AMG）分析；3）建立回归模型（CHAA），利用AMG阳性信号值估算银浓度；4）评估CHAA模型的准确性和精确性；5）应用CHAA模型估算银浓度。
本研究中，ICP-MS 数据与 AMG 阳性值呈显著正相关，表明可通过 AMG 阳性值估算鲸类组织中的 Ag 浓度。因此，基于 AMG 阳性值及回归模型，已开发出 CHAA 方法，用于估算鲸类肝脏和肾脏组织中的 Ag 浓度。通常情况下，参数较多的回归模型即， 一个更复杂的回归模型可能与数据拟合得更好，但尚不确定该复杂模型实际上优于较简单的模型。因此，必须通过统计分析来选择最优的回归模型。26,27. 统计分析结果表明，该线性回归模型足以根据AMG阳性...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢台湾鲸豚搁浅网络（Taiwan Cetacean Stranding Network）在样本采集与保存方面提供的支持，包括台北的台湾鲸豚协会、台湾大学生态学与演化生物学研究所鲸豚研究实验室（主持人：Lien-Siang Chou 教授）、台中市的国立自然科学博物馆（Yao Chiou-Ju 博士）以及海洋生物研究所 & 国立成功大学鲸类研究中心。我们还感谢台湾行政院农业委员会林务局提供的许可。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| HQ银增强试剂盒 | 纳米探针 | #2012 | |
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems | 39601006 | 石蜡 |
| 100% 乙醇 | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4026 | |
| 非二甲苯 | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 4328 | |
| 硅烷化载玻片 | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 511614 | |
| 盖玻片（25 x 50 mm） | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 24501 | |
| 马林诺尔 | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 20092 | |
| GM 苏木精染色 | Muto Pure Chemical Co., Ltd | 3008-1 | |
| 10%中性缓冲福尔马林溶液 | Chin I Pao Co., Ltd | --- | |
| 提示（1000 μL | MDBio, Inc. | 1000 | |
| PIPETMAN Classic P1000 | Gilson, Inc. | F123602 | |
| 15 ml 离心管 | GeneDireX, Inc. | PC115-0500 | |
| 狗鲨肝脏 | 加拿大国家研究委员会 | DOLT-2 | |
| 狗鲨肌肉 | 加拿大国家研究委员会 | DORM-2 | |
| 电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS） | PerkinElmer 公司 | PE-SCIEX ELAN 6100 DRC | |
| FreeZone 6升冷冻干燥系统 | Labconco | 7752030 | 用于冷冻干燥 |
| BRAND® SILBERBRAND 比重瓶 | 默克 | Z326283 | |
| 30 mL 标准小瓶，内壁平整，带 33 mm 封口 | Savillex Corporation | 200-030-12 | 用于消化 |
| 硝酸，超纯®, 65.0% | 默克 | 1.00441 | 用于消化 |
| 加热板/搅拌器 | 康宁® | PC-220 | 用于消化 |
| 高剪切实验室混合器 | Silverson | SL2T | 用于匀浆 |
| 无菌聚丙烯样品瓶（250 mL） | 赛默飞世尔科技™ | 6186L05 | 用于匀浆 |
| 数码相机 | 尼康公司 | DS-Fi2 | |
| 光学显微镜 | 尼康公司 | ECLIPSE Ni-U | |
| Shandon™ 精细操作™ 325 手动切片机 | 赛默飞世尔科技™ | A78100001H | |
| Accu-Cut® SRM™ 200 型旋转式切片机 | Sakura | 1429 | |
| 切片机刀片 S35 | 羽毛® | 207500000 | |
| 染色缸及盖子 | 脑科学研究实验室 | #3215 | |
| 钢制染色架 | 脑科学研究实验室 | #3003 | |
| Shandon 包埋中心 | 赛默飞世尔科技™ | S-EC | |
| Shandon Citadel® 组织处理仪 | 赛默飞世尔科技™ | 69800003 | |
| 载玻片加热板 | Lab-Line Instruments | 26005 | |
| 水浴锅 | Shandon Capshaw | 3964 | |
| 滤纸 | 默克 | 1541-070 | |
| Prism 6.01 for windows | GraphPad Software | 统计软件 | |
| ImageJ | 美国国立卫生研究院 | ||
| 不锈钢组织包埋模具 | 沈阳圆鳍贸易有限公司 | RD-TBM003 | 用于石蜡包埋 |
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