方法文章

使用自显影金属染色法定位并半定量鲸类组织中的银

DOI：

10.3791/58232

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2018年10月4日

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1Graduate Institute of Molecular and Comparative Pathobiology, National Taiwan University, 2School of Veterinary Medicine, National Taiwan University, 3Department of Oceanography and Asia-Pacific Ocean Research Center, National Sun Yat-sen University, 4Graduate Institute of Veterinary Pathobiology, National Chung Hsing University

本文内容

摘要

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本文介绍了一种通过自显影技术定位鲸类肝脏和肾脏组织中银（Ag）的实验方案。此外，还开发了一种名为鲸类组织学银检测法（cetacean histological Ag assay, CHAA）的新测定方法，用于估算这些组织中的银（Ag）浓度。

摘要

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银纳米颗粒（AgNPs）因其强效的抗菌作用，已被广泛应用于纺织品、化妆品和保健产品等商业产品中。它们也可能被释放到环境中，并在海洋中积累。因此，AgNPs已成为银（Ag）污染的主要来源，公众对银及其化合物环境毒性的关注日益增加。既往研究已证实银在生产者体内的生物累积作用以及在消费者/捕食者体内的生物放大作用。鲸类作为海洋食物链的顶级捕食者，可能已受到银/银化合物的负面影响。尽管可通过电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定鲸类组织中的银/银化合物浓度，但该方法受限于高昂的设备成本以及对组织储存和前处理的要求。因此，利用福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织样本，结合自显影（AMG）技术与图像定量分析，可作为辅助方法，用于定位银在器官亚结构水平的分布，并估算鲸类组织中的银浓度。AMG阳性信号主要表现为近端肾小管上皮细胞、肝细胞和库普弗细胞胞质内大小不一的棕至黑色颗粒。偶见部分无定形的金黄色至棕色AMG阳性信号出现在某些近端肾小管的管腔及基底膜区域。用于估算银浓度的检测方法称为鲸类组织学银检测法（CHAA），该方法是基于AMG图像定量分析数据与ICP-MS数据建立的回归模型。结合AMG与CHAA技术对重金属进行定位和半定量分析，为时空分布及跨物种研究提供了便捷的方法学支持。

引言

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银纳米颗粒（AgNPs）因其优异的抗菌效果，已被广泛应用于纺织品、化妆品和保健产品等商业产品中1,2。因此，AgNPs的产量以及含AgNPs产品的数量随时间持续增加3,4。然而，AgNPs可能释放到环境中，并在海洋中积累5,6。它们已成为银污染的主要来源，公众对银环境毒性的关注也日益增加。

银纳米颗粒（AgNPs）和银（Ag）在海洋环境中的状态复杂且持续变化。先前的研究表明，AgNPs 可以保持颗粒形态、发生聚集、溶解、与不同化学物质反应，或由 Ag+ 离子重新生成7,8。已在海洋沉积物中发现多种银化合物，例如 AgCl，这些化合物可被底栖生物摄取并进入食物链9,10。根据此前在中国台湾西南部七股潟湖区域开展的一项研究，海洋沉积物中的银含量极低，接近地壳丰度，而鱼类肝脏组织中....

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方案

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本研究遵循国际指南进行，鲸类组织样本的使用已获得中国台湾行政院农业委员会的许可（研究许可证号：104-07.1-SB-62）。

1. 用于ICP-MS分析的组织样品制备

注意：肝脏和肾脏组织取自新近死亡且轻度自溶的搁浅鲸类动物24，共包括4个不同物种的6头搁浅鲸类，分别为1头灰海豚（Grampus griseus，Gg）、2头小抹香鲸属（Kogia spp.，Ko）、2头 Hose 海豚（Lagenodelphis hosei，Lh）和1头细吻海豚（Stenella attenuata，Sa）。每头搁浅鲸类均有野外编号以供个体识别。组织样本的制备用于ICP-MS分析，采用M.H. Chen实验室建立的方法，并由该实验室完成ICP-MS分析11,13,25。

  1. 从搁浅的鲸类动物中采集肝脏和肾脏组织用于ICP-MS分析，并在−20 °C下保存至使用。
  2. 从同一只搁浅鲸类动物中采集配对的肝脏和肾脏组织用于AMG分析（详见步骤2）。
  3. 使用不锈钢解剖刀切除用于ICP-M....

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结果

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图5展示了鲸类肝脏和肾脏组织中银增强显色（AMG）阳性信号的代表性图像。图5中可见的AMG阳性信号表现为大小不一的棕至黑色颗粒，分布于近端肾小管上皮细胞、肝细胞和库普弗细胞的胞质中。偶尔在部分近端肾小管的管腔及基底膜处可见无定形的金黄色至棕色AMG阳性信号。肝脏和肾脏组织中ICP-MS检测结果与AMG阳性信号值之间存在正相关关系，根据额外平方和F检验及AIC12,26,27分析，优选通过原点的线性回归模型。在准确度测试中，肝脏和肾脏组织CHAA检测的平均标准差（SD）分别为3.24和0.16；在精密度测试中，肝脏和肾脏组织CHAA检测的平均标准差（SD）分别为2.8和0.35。准确度与精密度测试的原始数据汇总于表1。这六例搁浅鲸类个体的肝脏和肾脏组织中AMG阳性信号值、CHAA估算的银浓度以及I.......

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讨论

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本研究的目的是建立一种辅助方法，用于在亚器官水平上评估银（Ag）的分布，并估算鲸类组织中的银浓度。当前的实验方案包括：1）通过电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定鲸类组织中的银浓度；2）对已知银浓度的配对组织样本进行银增强显微术（AMG）分析；3）建立回归模型（CHAA），利用AMG阳性信号值估算银浓度；4）评估CHAA模型的准确性和精确性；5）应用CHAA模型估算银浓度。

本研究中，ICP-MS 数据与 AMG 阳性值呈显著正相关，表明可通过 AMG 阳性值估算鲸类组织中的 Ag 浓度。因此，基于 AMG 阳性值及回归模型，已开发出 CHAA 方法，用于估算鲸类肝脏和肾脏组织中的 Ag 浓度。通常情况下，参数较多的回归模型即， 一个更复杂的回归模型可能与数据拟合得更好，但尚不确定该复杂模型实际上优于较简单的模型。因此，必须通过统计分析来选择最优的回归模型。26,27. 统计分析结果表明，该线性回归模型足以根据AMG阳性.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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我们感谢台湾鲸豚搁浅网络（Taiwan Cetacean Stranding Network）在样本采集与保存方面提供的支持，包括台北的台湾鲸豚协会、台湾大学生态学与演化生物学研究所鲸豚研究实验室（主持人：Lien-Siang Chou 教授）、台中市的国立自然科学博物馆（Yao Chiou-Ju 博士）以及海洋生物研究所 & 国立成功大学鲸类研究中心。我们还感谢台湾行政院农业委员会林务局提供的许可。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
HQ银增强试剂盒纳米探针#2012
Surgipath ParaplastLeica Biosystems39601006石蜡
100% 乙醇Muto Pure Chemical Co., Ltd4026
非二甲苯Muto Pure Chemical Co., Ltd4328
硅烷化载玻片Muto Pure Chemical Co., Ltd511614
盖玻片（25 x 50 mm）Muto Pure Chemical Co., Ltd24501
马林诺尔Muto Pure Chemical Co., Ltd20092
GM 苏木精染色Muto Pure Chemical Co., Ltd3008-1
10%中性缓冲福尔马林溶液Chin I Pao Co., Ltd---
提示（1000 μLMDBio, Inc.1000
PIPETMAN Classic P1000Gilson, Inc.F123602
15 ml 离心管GeneDireX, Inc.PC115-0500
狗鲨肝脏加拿大国家研究委员会DOLT-2
狗鲨肌肉加拿大国家研究委员会DORM-2
电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）PerkinElmer 公司PE-SCIEX ELAN 6100 DRC
FreeZone 6升冷冻干燥系统Labconco7752030用于冷冻干燥
BRAND® SILBERBRAND 比重瓶默克Z326283
30 mL 标准小瓶，内壁平整，带 33 mm 封口Savillex Corporation200-030-12用于消化
硝酸，超纯®, 65.0%默克1.00441用于消化
加热板/搅拌器康宁®PC-220用于消化
高剪切实验室混合器SilversonSL2T用于匀浆
无菌聚丙烯样品瓶（250 mL）赛默飞世尔科技™6186L05用于匀浆
数码相机尼康公司DS-Fi2
光学显微镜尼康公司ECLIPSE Ni-U
Shandon™ 精细操作™ 325 手动切片机赛默飞世尔科技™A78100001H
Accu-Cut® SRM™ 200 型旋转式切片机Sakura1429
切片机刀片 S35羽毛®207500000
染色缸及盖子脑科学研究实验室#3215
钢制染色架脑科学研究实验室#3003
Shandon 包埋中心赛默飞世尔科技™S-EC
Shandon Citadel® 组织处理仪赛默飞世尔科技™69800003
载玻片加热板Lab-Line Instruments26005
水浴锅Shandon Capshaw3964
滤纸默克1541-070
Prism 6.01 for windowsGraphPad Software统计软件
ImageJ美国国立卫生研究院
不锈钢组织包埋模具沈阳圆鳍贸易有限公司RD-TBM003用于石蜡包埋

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McGillicuddy, E., et al. Silver nanoparticles in the environment: Sources, detection and ecotoxicology. Science Total Environment. 575, 231-246 (2017).
  2. Yu, S. J., Yin, Y. G., Liu, J. F. Silver nanoparticles in the environment. Enviro....

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