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方法文章

实时 体内 通过激光扫描显微镜追踪眼前房中的胸腺细胞

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DOI：

10.3791/58236

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2018年10月2日

 , 
1School of Medicine and Dentistry, Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir, 2Unidad Mixta CIPF-UCV, Centro de Investigación Príncipe Felipe, 3Department of Medicine, University of Miami

本文内容

摘要

本实验方案的目的是通过激光扫描显微镜对植入小鼠眼前房的胸腺组织中的胸腺细胞进行纵向活体实时追踪。由于角膜透明且移植物具有血管化特性，可连续记录前体细胞的招募过程以及成熟T细胞的迁出过程。

摘要

本方法的目的是首次展示将新生小鼠胸腺移植到同基因型成年小鼠眼前房的过程 体内 对血管化胸腺节段内胸腺细胞动态进行纵向实时监测。移植后，通过角膜进行激光扫描显微成像（LSM）可实现 体内 在细胞分辨率水平上进行非侵入性重复成像。重要的是，该方法在以往活体T细胞成熟成像模型的基础上，增加了在同一动物体内持续记录前体细胞招募和成熟T细胞输出的可能性。该系统其他优势包括移植物区域的透明性，可实现对植入组织的宏观快速监测，以及植入部位的可及性，允许进行局部和全身性治疗。主要局限在于组织体积受限于眼腔的狭小空间，因此需要修剪胸腺叶。通过采用既往已证实能够支持成熟T细胞生成的功能性模式进行胸腺叶精细解剖，可最大程度保留器官完整性。该技术有望用于探究一系列与胸腺功能相关的医学重要问题，包括自身免疫、免疫缺陷和中枢耐受，这些过程的分子机制目前仍不明确。对指导胸腺细胞迁移、分化和选择机制的深入解析，将有助于开发靶向发育中T细胞的新型治疗策略。

引言

胸腺内T细胞分化及T细胞亚群选择是脊椎动物细胞介导免疫发育与维持的关键过程1。该过程涉及一系列高度有序的复杂事件，包括从血液中募集前体细胞、细胞增殖与迁移、膜蛋白的差异表达，以及为筛选特定亚群而发生的大量程序性细胞死亡。最终结果是释放出能够识别广泛外来抗原的成熟T细胞，同时对自身肽段的反应性降至最低，这些成熟T细胞随后定植于个体的外周淋巴器官2,3。αβTCR库的胸腺细胞选择异常可导致自身免疫性疾病或免疫失衡4，这主要源于阴性或阳性前体细胞选择过程中的缺陷 。

胸腺细胞在胸腺内的定向迁移贯穿T细胞成熟的各个阶段，被认为是由一系列同时或顺序发生的多种刺激所驱动，包括趋化因子、黏附性及去黏附性的细胞外基质（ECM）蛋白相互作用3,5。对固定组织的研究已提供了关键信息，揭示了在特定胸腺微环境中胸腺细胞迁移信号的表达模式5,6，而离体（ex vivo）研究则发现了胸腺细胞在器官两个组织学上不同区域中的两种主要迁移行为：在皮质区表现为缓慢的随机运动，在髓质区则表现为快速且受限的运动7,8,9,10,11,12,13。迁移速率的增加与胸腺阳性选择相关13，而阴性选择则与爬行样行为相关，支持了“胸腺内迁移动力学决定胸腺细胞正常成熟”的假说。尽管这些发现具有重要意义，但在T细胞成熟过程中，胸腺细胞与基质细胞相互作用的空间拓扑结构以及胸腺细胞在不同器官微环境中的迁移动态仍不明确。

迄今为止开展的大多数ex vivo研究均采用胎儿胸腺或再聚集胸腺器官培养14,15、胸腺组织切片或完整的胸腺叶外植体，其中胸腺细胞的运动通过双光子激光扫描显微镜（TPLSM）8进行可视化观察。TPLSM是一种活体成像技术，其最大工作距离和成像深度受限，针对所检测组织通常不超过1 mm16。与依赖长时间孵育以形成三维结构、操作繁琐的胸腺器官培养相比，胸腺切片技术和完整的胸腺叶方法均可在保持天然组织结构的环境中，可控地引入特定预标记的胸腺细胞亚群。然而，由于这些模型中缺乏血流，因此在研究胸腺定植前体细胞（TSPs）向胸腺实质归巢的过程，或成熟T细胞从胸腺输出的动力学方面存在明显局限性。

用于研究小鼠胸腺T细胞成熟生理学的体内模型包括将组织碎片或完整的胸腺叶移植至肾包膜下17或皮内18。尽管这些方法已证明可用于探究组织的全身功能性植入，但胸腺移植物位于动物体内较深位置或被不透明组织层覆盖，限制了其在双光子激光扫描显微镜（TPLSM）下对移植物进行体内观察的应用。

眼前房由于角膜各层的透明性，为直接监测任何移植组织提供了易于接近的空间。此外，由虹膜构成的眼前房基底部富含血管和自主神经末梢，有利于移植物快速实现再血管化和再神经支配。19,20Caicedo博士此前已成功利用这一解剖空间对胰岛进行长期维持和纵向研究。21在此，我们证明该策略不仅为研究胸腺细胞在天然器官结构内的动态行为提供了一种有效方法，而且还能独特地拓展 体内 对小鼠前体细胞招募和成熟T细胞迁移步骤的纵向记录研究。

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方案

根据IACUC指南，迈阿密大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准了所有实验。

1. 新生小鼠胸腺的分离与修剪

  1. 通过高压灭菌或其他方法准备所有试剂和仪器，确保无菌条件。
  2. 为尽量减少污染，所有手术操作均应在层流罩下进行。
  3. 在处死供体小鼠前，将60 mm无菌培养皿中加入无菌预冷的1×磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4），并置于冰上。该溶液将用于清洗和保存供体小鼠摘除的胸腺，直至移植前使用。
  4. 根据伦理指南，通过断头法处死新生供体小鼠。
  5. 将小鼠仰卧置于无菌吸水纸巾上，用70%乙醇喷洒其腹部，随后擦拭干净。
  6. 在下腹部水平做一浅表V形切口，然后使用10 cm直头解剖剪沿腹中线剪开皮肤，至胸部水平留出约0.5–1 cm的开口。将胸部两侧皮肤向两侧翻折，以暴露胸腔。
  7. 使用同种剪刀，在膈肌和肋骨处做两个更深的0.5–1 cm侧向切口，以进入前胸腔的上纵隔区域。胸腺应呈现为位于心脏上方的两个浅色叶状结构。
  8. 将一对弯头镊子置于胸腺下方，垂直向上提起，完整取出器官。用另一对镊子防止肋骨回弹。如需要，可在取出器官前使用精细镊子小心撕开包裹器官的结缔组织，但不得破坏其包膜。
    注意：使用解剖显微镜可更方便地完成此步骤。
  9. 将分离出的胸腺立即浸入先前置于60 mm无菌培养皿中的冷无菌1×PBS（pH 7.4）中，用手术刀切断连接两叶的结缔组织峡部，使胸腺叶分离。清除培养皿中的碎片，但避免损伤包膜。为尽量减少胸腺暴露时间，应在植入前立即修整胸腺叶。
    注意：每只新生小鼠分离出的胸腺通常可切成约6段，每段宽约1 mm；若双侧眼内均进行移植，则最多可供3只受体小鼠使用。
  10. 对每只供体小鼠重复步骤1.4–1.9。为尽量减少胸腺暴露时间，应逐只分离胸腺。

2. 将胸腺植入眼的前房

  1. 移植前，标记并称量每只受体小鼠。
  2. 使用1-2%的异氟烷蒸气剂量麻醉受体小鼠。在开始手术前，通过夹捏脚趾无反射反应来确认麻醉效果充分。
  3. 按以下步骤进行胸腺组织片段移植：
    1. 将小鼠置于侧卧位，使其一只眼睛朝上，正对解剖显微镜的物镜。
    2. 在盛有冰冷1×PBS（pH 7.4）的60 mm培养皿中，使用Vannas剪刀将分离的胸腺叶切成宽度不超过1 mm的组织块用于移植。按照图1A所示的锯齿状切割方式，确保每个片段均包含胸腺皮质和髓质。根据图示指南使用Vannas剪刀进行修剪。
      注意：胸腺修剪应在移植前立即进行，以优化组织移植效果。
    3. 从角膜基底部（对应手术区域）开始，将40 mm G18针头的尖端插入，于角膜外层制造一个小切口，以便引入解剖剪刀的尖端。
    4. 使用Vannas剪刀在角膜基底部周围制作一个5-10 mm的侧向切口，同时牢固地撑开角膜切口以防止其闭合。使用平头镊子以避免组织损伤。
    5. 用平头镊子夹住被切开的角膜上皮，撑开切口，同时将胸腺组织片段推入切口内。在操作过程中，根据需要使用无菌1×PBS（pH 7.4）或人工泪液润湿眼睛，以防止组织干燥。
    6. 轻压眼球表面，使植入的组织片段相对于瞳孔向侧方滑动，以保留眼睛功能。确保移植物位于角膜切口的对侧位置，以避免成像时因浑浊造成干扰。
    7. 借助平头镊子，将角膜切口的两侧紧密按压约3-5秒，以促进其自行闭合。该手术无需缝合或使用钉合装置。
  4. 若需对双眼进行移植，将小鼠翻转至另一侧卧位，使第二只眼睛直接暴露于解剖显微镜物镜下，并重复步骤2.3.2-2.3.7。
  5. 手术完成后，将小鼠放回预先用加热灯预热的空笼中。
  6. 确保每只移植小鼠在放入与其他动物共用的笼子前，已完全恢复活动能力和意识。此过程通常在手术后1小时内完成。
  7. 移植后根据需要给予小鼠镇痛药物，并在饮水中添加浓度为1.6 mg/mL的对乙酰氨基酚。
  8. 对每只受体小鼠重复步骤2.2-2.9。
  9. 监测术后动物的活动情况以及移植眼的外观，以发现可能的健康并发症。

3. 使用三维单光子荧光共聚焦显微镜对移植胸腺进行共聚焦成像

  1. 使用浓度为1-2%的异氟烷蒸气对受体小鼠进行麻醉。在开始成像操作前，通过夹捏脚趾无反应来确认小鼠已充分麻醉。
  2. 将小鼠以侧卧位固定在显微镜的固定平台上，使一只眼睛朝上。在显微镜平台上放置加热垫，以确保记录期间小鼠体温恒定。
    注意：详见补充图1。
  3. 将小鼠头部插入立体定位头架中，并调节旋钮，使头部固定于侧向位置，以便显微镜物镜可直接接触携带胸腺移植物的眼睛。
  4. 将小鼠鼻部插入气体麻醉面罩，以在整个操作过程中维持麻醉状态。此装置可根据需要调节异氟烷蒸气浓度。
  5. 为在记录期间稳定眼球并避免眼睑回缩，使用镊子夹住角膜边缘并轻轻拉开眼睑，镊子尖端需包裹聚乙烯管，并连接至UST-2型固体万向节。该装置可实现头部和眼球的稳定固定，同时提供灵活性，且不会影响眼部血流，如先前所述22。
    注意：补充图1B、C展示了完整装配结构。
  6. 在将显微镜物镜置于小鼠眼睛之前，于角膜与物镜之间滴加数滴无菌生理盐水或人工泪液作为浸没液。
    注意：操作过程中可根据需要随时补充液体，以保持光路清晰并防止角膜干燥。
  7. 首先使用低倍物镜（5X）在视野中定位胸腺组织，随后切换至高分辨率（10、20 和 40X）长工作距离水浸式物镜。为避免激光扫描显微镜（LSM）对胸腺移植物造成光损伤和荧光淬灭，应尽可能使用最低激光功率并缩短扫描时间。可通过使用显微镜的共振扫描器实现此目的。
    注意：我们使用的共聚焦显微镜配备共振扫描镜，可实现每秒25帧的图像采集速度。其他品牌的显微镜也具备各自的共振扫描系统。
  8. 通过显微镜软件选择采集模式并启动共振扫描模式，然后选择XYZT成像模式，并按以下方式配置采集参数：
    1. 打开氩离子激光器，并将激光功率调节至30%，用于荧光激发。
    2. 选择激发激光波长，并设置声光分光器（AOBS）以对应不同发射波长。此外，为检测背向散射光并清晰显示组织结构，需同时启用反射光检测。
      注意：当选择一组激发波长（如GFP和RFP）后，AOBS将自动编程，将这些激发光引导至样本，并在两者之间传输发射光。例如，对于GFP和RFP，我们分别使用围绕488 nm和561 nm的窄带反射激发光，从而为荧光发射光子的收集保留宽波段，减少所需激光功率和采集时间。在反射模式下，AOBS作为50/50分光器，用于采集远离荧光发射检测波长的反射光。
    3. 在选定波长下收集发射光信号，设置分辨率为512×512像素，点击实时成像按钮开始实时预览，并根据需要调节增益水平（典型增益约为600 V）。
    4. 通过聚焦于胸腺移植物顶部确定Z轴堆栈的起始位置，点击开始；然后移动至植入胸腺中最后一个可聚焦的层面，点击结束。Z轴步进设为5 µm。软件将自动计算共聚焦层面的数量。
    5. 设定每个Z轴堆栈的采集时间间隔（通常为1.5至2秒），并选择持续采集直至停止选项以进行连续成像。
  9. 点击开始按钮以启动采集。
  10. 通过重复步骤3.1–3.9，可在不同时间点对同一动物的移植物进行多次成像。
    注意：若动物双眼均携带移植物，可在翻转小鼠头部朝上侧后，重复步骤3.2–3.9 ，以对另一只眼进行记录。

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结果

按照本方案（步骤 1.1–1.9）所述，从小鼠 B6.Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/Jas 中分离出新生小鼠的胸腺组织。在这些转基因小鼠中，鸡β-肌动蛋白启动子在巨细胞病毒（CMV）早期增强子的作用下，驱动红色荧光蛋白变体 DsRed.MST 的表达，从而便于对移植组织进行示踪。

为防止组织排斥，选择基因型为 C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J 的同源个体作为宿主。在这些转基因小鼠中，人源泛素C启动子驱动增强型绿色荧光蛋白（GFP）在所有组织中的表达，从而能够清晰区分受体与供体组织。人源泛素C启动子的作用导致某些造血细胞类型中GFP表达模式的差异。特别是，T细胞的GFP表达水平比CD19+B220+ B细胞或其他外周血细胞高出2倍，这有助于通过流式细胞术等定量敏感技术进行识别，而无需额外标记。此外，这些小鼠在成年动物以及所有胚胎阶段...

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讨论

由于T细胞成熟过程对个体免疫功能至关重要4，且前体细胞动态可能影响胸腺产生的成熟T细胞2,3，研究人员已投入大量努力，致力于开发经典固定组织切片快照方法的替代方案。

尽管组织切片和其他外植体在重现组织结构方面明显优于单层培养或聚集型胸腺器官培养14,15，但由于缺乏与脉管系统的连接，其应用受到限制，无法用于研究细胞进入或TSP（前体细胞穿越血管内皮细胞屏障）以及成熟T细胞从器官中移出（成熟T细胞穿越血管内皮细胞屏障）的过程。有假说认为，T细胞与其他细胞（包括胸腺基质细胞）之间的相互作用动态，以及其在皮质和髓质微环境中的迁移行为，决定了T细胞的分化状态以及亚群选择过程（阳性与阴性选择）2,3

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 R56DK084321（AC）、R01DK084321（AC）、R01DK111538（AC）、R01DK113093（AC）和 R21ES025673（AC），以及由西班牙瓦伦西亚自治区教育、文化与体育理事会（Consellería de Educació, cultura i esport, Generalitat valenciana, Valencia, Spain）资助的 BEST/2015/043 项目（EO）。作者感谢西班牙瓦伦西亚天主教大学圣维森特·马丁尔分校（Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir）的 SENT 团队，以及西班牙瓦伦西亚费利佩王子研究中心（Centro de Investigación Príncipe Felipe）的 Alberto Hernandez 在视频拍摄与编辑方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
异氟烷蒸发器及异氟烷Kent Scientific CorpVetFlo-1215
带光源的解剖显微镜ZeissStemi 305
精细解剖镊WPI500455
中号解剖镊WPI501252
弯头精细解剖镊WPI15917
Vannas 剪刀WPI503371
解剖剪刀WPI503243
手术刀WPI500353
40 mm 18G 针头BD304622
一次性移液管Thermofisher201C
加热垫和加热灯Kent Scientific CorpInfrarred
70% 乙醇VWR83,813,360
60 mm 无菌培养皿SIGMACLS430166
无菌 1× PBS，pH(7.4)Thermofisher10010023
无菌擦拭巾Kimberly-ClarkLD004
镇痛药物Sigma-AldrichA3035-1VL
生理盐水或 ViscotearsNovartisN/A
体视显微镜LeicaMZ FLIII
头部固定适配器NarishigeSG-4N-S
气体麻醉面罩NarishigeGM-4_S
共聚焦显微镜LeicaTCS SP5 II
层流罩TelstarBIO IIA

参考文献

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