本实验方案的目的是通过激光扫描显微镜对植入小鼠眼前房的胸腺组织中的胸腺细胞进行纵向活体实时追踪。由于角膜透明且移植物具有血管化特性，可连续记录前体细胞的招募过程以及成熟T细胞的迁出过程。
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摘要
摘要
本方法的目的是首次展示将新生小鼠胸腺移植到同基因型成年小鼠眼前房的过程 体内 对血管化胸腺节段内胸腺细胞动态进行纵向实时监测。移植后，通过角膜进行激光扫描显微成像（LSM）可实现 体内 在细胞分辨率水平上进行非侵入性重复成像。重要的是，该方法在以往活体T细胞成熟成像模型的基础上，增加了在同一动物体内持续记录前体细胞招募和成熟T细胞输出的可能性。该系统其他优势包括移植物区域的透明性，可实现对植入组织的宏观快速监测，以及植入部位的可及性，允许进行局部和全身性治疗。主要局限在于组织体积受限于眼腔的狭小空间，因此需要修剪胸腺叶。通过采用既往已证实能够支持成熟T细胞生成的功能性模式进行胸腺叶精细解剖，可最大程度保留器官完整性。该技术有望用于探究一系列与胸腺功能相关的医学重要问题，包括自身免疫、免疫缺陷和中枢耐受，这些过程的分子机制目前仍不明确。对指导胸腺细胞迁移、分化和选择机制的深入解析，将有助于开发靶向发育中T细胞的新型治疗策略。
引言
胸腺内T细胞分化及T细胞亚群选择是脊椎动物细胞介导免疫发育与维持的关键过程1。该过程涉及一系列高度有序的复杂事件，包括从血液中募集前体细胞、细胞增殖与迁移、膜蛋白的差异表达，以及为筛选特定亚群而发生的大量程序性细胞死亡。最终结果是释放出能够识别广泛外来抗原的成熟T细胞，同时对自身肽段的反应性降至最低，这些成熟T细胞随后定植于个体的外周淋巴器官2,3。αβTCR库的胸腺细胞选择异常可导致自身免疫性疾病或免疫失衡4，这主要源于阴性或阳性前体细胞选择过程中的缺陷 。
胸腺细胞在胸腺内的定向迁移贯穿T细胞成熟的各个阶段，被认为是由一系列同时或顺序发生的多种刺激所驱动，包括趋化因子、黏附性及去黏附性的细胞外基质（ECM）蛋白相互作用3,5。对固定组织的研究已提供了关键信息，揭示了在特定胸腺微环境中胸腺细胞迁移信号的表达模式5,6，而离体（ex vivo）研究则发现了胸腺细胞在器官两个组织学上不同区域中的两种主要迁移行....
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方案
根据IACUC指南，迈阿密大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准了所有实验。
1. 新生小鼠胸腺的分离与修剪
- 通过高压灭菌或其他方法准备所有试剂和仪器，确保无菌条件。
- 为尽量减少污染，所有手术操作均应在层流罩下进行。
- 在处死供体小鼠前，将60 mm无菌培养皿中加入无菌预冷的1×磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4），并置于冰上。该溶液将用于清洗和保存供体小鼠摘除的胸腺，直至移植前使用。
- 根据伦理指南，通过断头法处死新生供体小鼠。
- 将小鼠仰卧置于无菌吸水纸巾上，用70%乙醇喷洒其腹部，随后擦拭干净。
- 在下腹部水平做一浅表V形切口，然后使用10 cm直头解剖剪沿腹中线剪开皮肤，至胸部水平留出约0.5–1 cm的开口。将胸部两侧皮肤向两侧翻折，以暴露胸腔。
- 使用同种剪刀，在膈肌和肋骨处做两个更深的0.5–1 cm侧向切口，以进入前胸腔的上纵隔区域。胸腺应呈现为位于心脏上方的两个浅色叶状结构。
- 将一对弯头镊子置于胸腺下方，垂直向上提起，完整取出器官。用另一对镊子防止肋骨回弹。如需要，可在取出器官前使用精细镊子小心撕开包裹器官的结缔组织，但不得破坏其包膜。
注意：使用解剖显微镜可更方便地完成此步骤。 - 将分离出的胸腺立即浸入先前置于60 mm无菌培养皿中的冷无菌1×P....
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结果
按照本方案（步骤 1.1–1.9）所述，从小鼠 B6.Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/Jas 中分离出新生小鼠的胸腺组织。在这些转基因小鼠中，鸡β-肌动蛋白启动子在巨细胞病毒（CMV）早期增强子的作用下，驱动红色荧光蛋白变体 DsRed.MST 的表达，从而便于对移植组织进行示踪。
为防止组织排斥，选择基因型为 C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J 的同源个体作为宿主。在这些转基因小鼠中，人源泛素C启动子驱动增强型绿色荧光蛋白（GFP）在所有组织中的表达，从而能够清晰区分受体与供体组织。人源泛素C启动子的作用导致某些造血细胞类型中GFP表达模式的差异。特别是，T细胞的GFP表达水平比CD19+B220+ B细胞或其他外周血细胞高出2倍，这有助于通过流式细胞术等定量敏感技术进行识别，而无需额外标记。此外，这些小鼠在成年动物以及所有胚胎阶段.......
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讨论
由于T细胞成熟过程对个体免疫功能至关重要4，且前体细胞动态可能影响胸腺产生的成熟T细胞2,3，研究人员已投入大量努力，致力于开发经典固定组织切片快照方法的替代方案。
尽管组织切片和其他外植体在重现组织结构方面明显优于单层培养或聚集型胸腺器官培养14,15，但由于缺乏与脉管系统的连接，其应用受到限制，无法用于研究细胞进入或TSP（前体细胞穿越血管内皮细胞屏障）以及成熟T细胞从器官中移出（成熟T细胞穿越血管内皮细胞屏障）的过程。有假说认为，T细胞与其他细胞（包括胸腺基质细胞）之间的相互作用动态，以及其在皮质和髓质微环境中的迁移行为，决定了T细胞的分化状态以及亚群选择过程（阳性与阴性选择）2,3
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 R56DK084321（AC）、R01DK084321（AC）、R01DK111538（AC）、R01DK113093（AC）和 R21ES025673（AC），以及由西班牙瓦伦西亚自治区教育、文化与体育理事会（Consellería de Educació, cultura i esport, Generalitat valenciana, Valencia, Spain）资助的 BEST/2015/043 项目（EO）。作者感谢西班牙瓦伦西亚天主教大学圣维森特·马丁尔分校（Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir）的 SENT 团队，以及西班牙瓦伦西亚费利佩王子研究中心（Centro de Investigación Príncipe Felipe）的 Alberto Hernandez 在视频拍摄与编辑方面提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 异氟烷蒸发器及异氟烷 | Kent Scientific Corp | VetFlo-1215 | |
| 带光源的解剖显微镜 | Zeiss | Stemi 305 | |
| 精细解剖镊 | WPI | 500455 | |
| 中号解剖镊 | WPI | 501252 | |
| 弯头精细解剖镊 | WPI | 15917 | |
| Vannas 剪刀 | WPI | 503371 | |
| 解剖剪刀 | WPI | 503243 | |
| 手术刀 | WPI | 500353 | |
| 40 mm 18G 针头 | BD | 304622 | |
| 一次性移液管 | Thermofisher | 201C | |
| 加热垫和加热灯 | Kent Scientific Corp | Infrarred | |
| 70% 乙醇 | VWR | 83,813,360 | |
| 60 mm 无菌培养皿 | SIGMA | CLS430166 | |
| 无菌 1× PBS，pH(7.4) | Thermofisher | 10010023 | |
| 无菌擦拭巾 | Kimberly-Clark | LD004 | |
| 镇痛药物 | Sigma-Aldrich | A3035-1VL | |
| 生理盐水或 Viscotears | Novartis | N/A | |
| 体视显微镜 | Leica | MZ FLIII | |
| 头部固定适配器 | Narishige | SG-4N-S | |
| 气体麻醉面罩 | Narishige | GM-4_S | |
| 共聚焦显微镜 | Leica | TCS SP5 II | |
| 层流罩 | Telstar | BIO IIA |
参考文献
- Boehm, T., Hess, I., Swann, J. B. Evolution of lymphoid tissues. Trends in Immunology. 33, 315-321 (2012).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nature Reviews Immunology. 6 (2), 127-135 (2006). ....
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重印与许可
