方法文章

利用 Cas9 Ribonucleoproteins 生成人 NK 细胞的研究

DOI：

10.3791/58237

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2018年6月14日

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1Center for Childhood Cancer and Blood Disease, Nationwide Children's Hospital, 2Nuffield Division of Clinical Laboratory Sciences, Radcliffe Department of Medicine, University of Oxford, 3Center for Clinical and Translational Research, Nationwide Children's Hospital Research Institute

本文内容

摘要

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在这里, 我们提出了一个协议, 基因改造主要或扩大人类自然杀手 (NK) 细胞使用Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs)。通过使用该协议, 我们生成的人 NK 细胞缺乏转化生长 factor–b 受体 2 (TGFBR2) 和嘌呤 phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1)。

摘要

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CRISPR/Cas9 技术正在加速许多细胞类型的基因组工程, 但到目前为止, 基因传递和稳定的基因修饰在原 NK 细胞中具有挑战性。例如, 使用慢病毒载体或逆转录病毒转导的转基因分娩导致转基因 nk 细胞的产量有限, 这是由于大量程序相关的 nk 细胞凋亡所致。我们这里描述了一个无 DNA 的方法, 基因组编辑的人原发性和扩大 NK 细胞使用 Cas9 ribonucleoprotein 配合物 (Cas9/RNPs)。这种方法可以有效地剔除 NK 细胞中的 TGFBR2和HPRT1 基因。rt-pcr 数据显示, 基因表达水平显著下降, 一个代表性细胞产品的细胞毒性试验表明, RNP 修饰 NK 细胞对 TGFβ的敏感性较低。经辐照 mbIL21-expressing 馈线细胞刺激后, 基因修饰细胞可扩大电穿孔。

引言

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癌症免疫治疗近年来取得了进展。基因修饰的嵌合体抗原受体 (车载) T 细胞是成功地应用于癌症免疫治疗的工程免疫细胞的一个很好的例子。这些细胞最近被 FDA 批准用于治疗 CD19 + B 细胞恶性肿瘤, 但迄今为止成功仅限于携带少量多弹头抗原的疾病, 而针对这种有限的抗原曲目容易发生免疫逃逸的失败。此外, 由于异基因 t 细胞引起的移植物抗宿主病的风险, 汽车 t 细胞一直关注自体 t 细胞的使用。相反, NK 细胞能够以抗原无关的方式杀死肿瘤靶点, 不会引起 GvHD, 这使他们成为癌症免疫治疗6、7、8、9的好候选者。

CRISPR/Cas9 技术最近在工程免疫细胞中得到了应用, 但用质粒对 NK 细胞进行基因重组一直是很有挑战性的。这是由于在 DNA 依赖的情况下, 转基因分娩的困难, 如慢病毒载体和逆转录病毒转导导致大量程序相关的 nk 细胞凋亡和有限的基因工程 nk 细胞的生产4,9。

许多先天免疫细胞表达了与病原体相关的分子模式的高水平的受....

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方案

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健康捐赠者巴菲外套被获取了作为来源材料从中央俄亥俄区域美国红十字。本研究决定由全国儿童医院机构审查委员会进行豁免研究。

1. 人类 NK 细胞的纯化和扩展

  1. 隔离 PBMCs 从巴菲大衣12。
    1. 35毫升的巴菲涂层样品在15毫升的 Ficoll-Paque。
    2. 离心机在 400 x g 20 分钟没有刹车和收集 PBMC 从接口。
    3. 通过增加至少一个同等体积的 PBS, 离心5分钟, 并吸去中国人民银行的洗涤, 清洗恢复的 PBMCs 三次。NK 细胞可以在这个阶段被 RosettesSep13隔离。
  2. 在0、7和14天, 用辐照的 10 x 106 mbIL21-expressing 馈线细胞刺激 NK 细胞。用新鲜的 RPMI 替换介质, 每隔一天 IL-2 10% 只血清、1% 谷氨酰胺、1% 青霉素链霉素和100毫升/mL。

2. gRNA 设计与选型

  1. 使用在线工具,例如, NCBI, 合奏, 选择特定的基因组定位点。
    例子。
    说明: 转化生长因子β受体 2 (TGFBRR2) 胞外区

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结果

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电穿孔效率

为了优化 Cas9/RNPs 的电穿孔, 我们对16种不同的方案进行了实验, 将 GFP 非靶向 siRNA 和 DNA 质粒转导到 NK 细胞。流式细胞仪检测表明, EN-138的细胞活力和转导效率的百分比最高 (35% 活 GFP 阳性细胞) 为两个粒子 (图 1 &图 2)。有趣的是, 使用这个程序 Cas9/RNPs 电穿孔的效率较高, 因为我们看到了60% 降低 TGFBR2 mRNA 表达水平 (图 5)。此外, 转基因 NK 细胞可以生长和扩展30天, 并保存 (未显示数据)。

突变检测

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讨论

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对 NK 细胞的 DNA 依赖性修饰已经挑战了4,9。因此, 我们直接介绍了一个综合预制 ribonucleoprotein (RNPs) 复合体和 Cas9 蛋白作为纯化蛋白成初级和扩大 NK 细胞8。这种方法使我们能够消除由 RNA 聚合酶 II 开始的封盖、尾矿和其他转录和平移过程, 这可能会导致 NK 细胞凋亡与 DNA 相关的转导方法有关。

此外, 这里报告的方法使用纯化的 Cas9 蛋白复合为 Cas9/RNPs, 这是立即激活后, 电穿孔和迅速退化, 从而增加目标和减少非目标影响的现行协议5,6,7,16. 此外, 优化一种新的电穿孔方法, 以高效率的.......

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披露

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DAL 服务/已担任信使治疗, 黑曜石疗法, Intellia 疗法, 默克研究实验室和 Miltenyi Biotec 的顾问, 并在 CytoSen 疗法的公平/领导。

致谢

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我们感谢布赖恩. 西塞罗在编辑手稿方面的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RosetteSep™人 NK 细胞富集混合物STEMCELL Technologies15065玫瑰花丛Sep™人 NK 细胞富集混合物旨在通过阴性选择从全血中分离 NK 细胞。
Ficoll-Paque®PLUSGE Healthcare - 生命科学17-1440-02
Alt-R®CRISPR-Cas9 tracrRNA1072532 TracrRNA 的整合 DNA 技术，TracrRNA 包含专有的化学修饰，可赋予更高的核酸酶抗性。与 crRNA 杂交以激活 Cas9 酶
Alt-R®CRISPR-Cas9 crRNA整合 DNA 技术合成生产为 Alt-R®CRISPR-Cas9 crRNA，基于靶向 intrest
Alt-R® 基因的设计 gRNA 序列;基因组编辑检测试剂盒集成 DNA 技术1075931每个试剂盒包含 T7EI 核酸内切酶、T7EI 反应缓冲液和 T7EI 检测对照。
白金®Taq DNA 聚合酶高保真Invitrogen11304-011
4D-Nucleofector™系统：LonzaAAF-1002B
人重组 IL-2 蛋白Novartis65483-0116-07
P3 原代细胞 4D-核变器™X KitLonzaV4XP-3032包含 pmaxGFP™载体、核处理器和贸易;溶液、添加剂、16 孔比色皿条带
非靶向：定制 siRNA，标准 0.05 2mol ON-TARGETplusDharmaconCTM-360019
Alt-R® S.p. Cas9 核酸酶 3NLS1074181Cas9 核酸酶的整合 DNA 技术
血液 &组织手册Qiagen69504
RNeasy 迷你套件Qiagen74104
钙黄绿素 AMThermoFisherC3099
TGFβBiolegend580706
Alt-R®CRISPR-Cas9 对照试剂盒，人类整合 DNA 技术1072554包括 tracrRNA、HPRT 阳性对照 crRNA、阴性对照 crRNA#1、HPRT 引物混合物和无核酸酶双链缓冲液。
IDTE pH 7.5 （1X TE 溶液）集成 DNA 技术11-01-02-02
Alt-R®Cas9 电穿孔增强剂1075915Cas9 电穿孔增强剂的 DNA 集成技术
DNeasy®

参考文献

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  1. Guven, H., et al. Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction. Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).
  2. Alici, E., Sutlu, T., Sirac Dilber, M. Retroviral gene transfer i....

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TGFBR2 HPRT1 Nucleofector EN138 IL21

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