在此，我们介绍一种利用基因修饰技术改造原代或扩增的人自然杀伤（NK）细胞的实验方案 Cas9 核糖核蛋白复合物 (Cas9/RNPs)。通过使用本方案，我们获得了人类自然杀伤细胞中特定基因缺陷的 转化生长因子-β受体2 （TGFBR2）和 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1 (HPRT1)
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本文内容
摘要
摘要
CRISPR/Cas9 技术正在加速多种细胞类型的基因组编辑，但迄今为止，在原代自然杀伤（NK）细胞中实现基因递送和稳定的基因修饰仍具有挑战性。例如，使用慢病毒或逆转录病毒转导进行转基因递送，由于程序相关的 NK 细胞大量凋亡，导致基因工程化 NK 细胞的产量有限。本文介绍了一种无需 DNA 的基因组编辑方法，利用 Cas9 核糖核蛋白复合物（Cas9/RNPs）对人原代及扩增后的 NK 细胞进行编辑。该方法可高效敲除 NK 细胞中的 TGFBR2 和 HPRT1 基因。RT-PCR 数据显示基因表达水平显著降低，对代表性细胞产品的细胞毒性检测表明，RNP 修饰后的 NK 细胞对 TGFβ 的敏感性降低。电穿孔后的基因修饰细胞可通过经辐照表达 mbIL21 的饲养细胞刺激进行扩增。
引言
近年来，癌症免疫治疗取得了显著进展。基因改造的嵌合抗原受体（CAR）T细胞是工程化免疫细胞成功应用于癌症免疫治疗的典型范例。这些细胞最近已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，用于治疗CD19阳性的B细胞恶性肿瘤。然而，目前的成功仅局限于少数具有可靶向抗原的疾病，而针对如此有限的抗原谱系容易因免疫逃逸而导致治疗失败。此外，由于异体T细胞可能引发移植物抗宿主病（GvHD），CAR T细胞治疗主要集中于自体T细胞的应用。相比之下，自然杀伤（NK）细胞能够以抗原非依赖的方式杀伤肿瘤靶细胞，且不会引起GvHD，因此成为癌症免疫治疗的理想候选细胞6,7,8,9。
CRISPR/Cas9 技术最近已被用于免疫细胞的工程化改造，但利用质粒对自然杀伤（NK）细胞进行基因重编程一直具有挑战性。这主要是由于以DNA依赖方式递送外源基因存在困难，例如慢病毒和逆转录病毒转导会导致明显的操作相关性NK细胞凋亡，且基因工程化NK细胞的产量有限4,9。
许多天然免疫细胞表达高水....
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方案
健康供体的血沉棕黄层由美国红十字会中俄亥俄地区中心提供作为源材料。该研究已由全美儿童医院机构审查委员会确定为豁免研究。
1. 人NK细胞的分离与扩增
- 从血沉棕黄层中分离外周血单个核细胞（PBMC）12。
- 将35 mL血沉棕黄层样本叠加在15 mL Ficoll-Paque上。
- 以400 × g离心20分钟（不启用刹车），从界面收集PBMC。
- 用至少等体积的PBS重悬回收的PBMC，400 × g离心5分钟，弃上清，重复洗涤三次。此阶段可通过RosettesSep13分离自然杀伤（NK）细胞。
- 在第0、7和14天，使用经照射的表达mbIL21的饲养细胞（10 × 106个）刺激NK细胞以实现扩增。每隔一天更换新鲜培养基，培养基为含10%胎牛血清（FBS）、1%谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素和100 IU/mL IL-2的RPMI完全培养基。
2. gRNA 设计与选择
- 使用在线工具选择特定的基因组位点进行靶向， 例如， NCBI，Ensemble
示例。
....
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结果
电穿孔效率
为了优化Cas9/RNP对NK细胞的电穿孔转染效果，我们测试了16种不同的电穿孔程序，分别将GFP非靶向siRNA和DNA质粒导入NK细胞。流式细胞术检测结果显示，程序EN-138在细胞存活率和转染效率方面均表现最佳，两种颗粒的活细胞中GFP阳性细胞比例均达到35%（图1 ＆ 图2）。有趣的是，使用该程序进行Cas9/RNP电穿孔时，转染效率更高，TGFBR2 mRNA表达水平降低了60%（图5）。此外，基因修饰后的NK细胞可培养扩增达30天，并可进行冷冻保存（数据未显示）。
突变检测实验
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讨论
依赖DNA的NK细胞修饰一直具有挑战性4,9。因此，我们直接将体外合成的核糖核蛋白（RNPs）复合物以及纯化的Cas9蛋白以蛋白质形式导入原代和扩增后的NK细胞中8。该方法使我们能够避免由RNA聚合酶II启动的加帽、加尾以及其他转录和翻译过程，从而减少与依赖DNA的转导方法相关的NK细胞凋亡。
此外，本文报道的方法采用纯化的 Cas9 蛋白形成 Cas9/RNP 复合物，该复合物在电转染后立即具有活性，并且可快速降解，从而相较于现有方案显著提高靶向效率并降低脱靶效应5,6,7,16。进一步地，本文引入了一种优化的新型电转染方法，可高效转导 Cas9/RNP 复合物，.......
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披露
DAL 曾担任 Courier Therapeutics、Obsidian Therapeutics、Intellia Therapeutics、Merck Research Laboratories 和 Miltenyi Biotec 的顾问，并在 CytoSen Therapeutics 拥有股权/担任领导职务。
致谢
我们感谢 Brian Tullius 在编辑手稿过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RosetteSep™ 人自然杀伤细胞富集试剂盒 | STEMCELL Technologies | 15065 | RosetteSep™ 人NK细胞富集混合液旨在通过阴性选择法从全血中分离NK细胞。 |
| Ficoll-Paque® PLUS | GE Healthcare - 生命科学 | 17-1440-02 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072532 | 含有专有化学修饰的tracrRNA，可增强核酸酶抗性；与crRNA杂交以激活Cas9酶 |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies | 人工合成的 Alt-R® 靶向目的基因的CRISPR-Cas9 crRNA，基于设计的gRNA序列 | |
| Alt-R® 基因组编辑检测试剂盒 | Integrated DNA Technologies | 1075931 | 每个试剂盒包含T7EI内切酶、T7EI反应缓冲液和T7EI检测对照品。 |
| 铂® 高保真Taq DNA聚合酶 | Invitrogen | 11304-011 | |
| 4D-Nucleofector™ 系统 | Lonza | AAF-1002B | |
| 人重组IL-2蛋白 | 诺华 | 65483-0116-07 | |
| P3 原代细胞 4D-电转染仪™ X试剂盒 | Lonza | V4XP-3032 | 含有 pmaxGFP™ 载体，核转染器™ 溶液，补充剂，16孔核电穿孔杯™ 条带 |
| 非靶向：定制 siRNA，标准 0.05 2mol ON-TARGETplus | Dharmacon | CTM-360019 | |
| Alt-R® S.p. Cas9 核酸酶 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1074181 | Cas9核酸酶 |
| DNeasy® 血液 &与组织手册 | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Calcein AM | 赛默飞世尔科技 | C3099 | |
| TGFβ | Biolegend | 580706 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 对照试剂盒，人源 | Integrated DNA Technologies | 1072554 | 包含tracrRNA、HPRT阳性对照crRNA、阴性对照crRNA#1、HPRT引物混合液和无核酸酶双链缓冲液。 |
| IDTE pH 7.5（1X TE 溶液） | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| Alt-R® Cas9 电穿孔增强剂 | Integrated DNA Technologies | 1075915 | Cas9 电穿孔增强剂 |
参考文献
- Guven, H., et al. Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction. Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).
- Alici, E., Sutlu, T., Sirac Dilber, M. Retroviral gene transfer i....
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