通过下一代16S rRNA扩增子测序对蜱微生物组进行表征

摘要

本文介绍一种用于16S rRNA测序的下一代测序方案，可实现对媒介生物内微生物群落的鉴定与特征分析。该方法包括DNA提取、通过PCR对样本进行扩增和加标签、在流动池上进行测序，以及利用生物信息学将测序数据与系统发育信息进行比对。

摘要

近几十年来，媒介传播疾病以惊人的速度重新出现并不断扩散，导致全球范围内的发病率和死亡率显著上升。目前，大多数此类疾病缺乏有效且广泛可及的疫苗，因此亟需开发新的疾病防控策略。在此背景下，一种有前景的疾病控制途径是靶向媒介微生物组，即定殖于媒介体内的微生物群落。媒介微生物组在病原体动态变化中发挥关键作用，对微生物组的干预已成功减少了多种媒介传播疾病的媒介数量或病原体传播能力。然而，要将这些研究成果转化为实际的疾病控制应用，必须深入理解媒介微生物生态学，而这一领域的发展长期受限于技术手段的不足。新一代测序技术的出现使得对多种微生物群落进行快速、高通量的测序成为可能。通过靶向高度保守的16S rRNA基因，研究人员能够在不同生态和实验条件下对媒介体内存在的微生物进行表征。该技术包括扩增16S rRNA基因、通过PCR对样本进行条形码标记、将样本加载到流动池中进行测序，以及利用生物信息学方法将测序数据与系统发育信息进行比对。该方法通常可实现对大量重复样本在物种或属水平上的鉴定，从而克服了传统培养、显微镜检查或组织学染色技术在检测灵敏度、分辨率和输出效率方面的局限性。因此，该方法非常适合在多种条件下对媒介微生物进行表征，但目前尚无法提供有关微生物功能、其在媒介体内的定位或对抗生素治疗反应的信息。总体而言，16S新一代测序是一种有力的技术手段，有助于更深入地理解媒介微生物的种类及其在疾病传播动态中的作用。

引言

近几十年来，虫媒传播疾病的再次出现和扩散对全球人类及野生动物健康构成了严重威胁。目前大多数此类疾病缺乏有效的疫苗，且由于传播媒介及其与宿主相互作用的生物学复杂性，防控工作受到阻碍。深入了解媒介体内微生物相互作用在病原体传播中的作用，有助于开发出克服这些挑战的新策略。特别是，媒介相关微生物中的共生菌、互利共生菌与病原体之间的相互作用（统称为微生物组）可能对病原体的传播能力产生重要影响。现有大量证据支持这一观点，已有研究实例表明媒介微生物组与疟疾、寨卡病毒病和莱姆病等疾病的传播能力之间存在关联^1,2,3。然而，要将这些发现转化为疾病控制策略，还需更深入地了解媒介微生物组的结构、功能及其来源。在不同生态和实验条件下识别并表征媒介微生物群落，是推动该领域发展的关键方向。

本文通过利用莱姆病病原体 Borrelia burgdorferi 的传播媒介——西方黑腿蜱 Ixodes pacificus，提供了一种鉴定病原体传播媒介中微生物群落成员的方法。尽管蜱类携带的人类病原体种类超过任何其他节肢动物，但目前对蜱类微生物组的生物学及其群落生态学的了解仍然相对有限⁴。已有研究表明，蜱类体内栖居着多种多样的病毒、细菌、真菌和原生生物，其中包括共生菌、内共生体以及短暂定植的微生物成员^5,4。先前的研究已证实，Ixodes 属蜱类的微生物组在地理分布、物种、性别、生活阶段以及血液来源等方面均表现出显著差异^6,7,8。然而，导致这些差异的机制尚不清楚，亟需对这些微生物群落的来源及其组装过程进行更深入的研究。蜱类可通过垂直传播、与宿主接触，以及通过气门、口器和肛孔从环境中摄取等方式获得微生物⁹。明确影响蜱类微生物组初始形成与发育的因素，特别是垂直传播与环境传播的相对贡献，对于理解蜱类微生物组多样性在自然状态下的分布模式与变异规律，以及这些微生物群落在病原体传播过程中如何相互作用具有重要意义，并可能为疾病防控或媒介控制提供潜在应用价值。

如今，诸如高通量测序等强大的分子技术可用于鉴定微生物群落，并可在不同环境或实验条件下用于表征媒介生物的微生物组。在这些高通量测序技术出现之前，微生物的鉴定主要依赖于显微镜观察和培养方法。尽管显微镜技术操作快速简便，但基于形态学的微生物鉴定方法本质上具有主观性和粗略性，且受限于较低的灵敏度和检测能力¹⁰。基于培养的方法被广泛用于微生物鉴定，并可用于确定微生物对药物治疗的敏感性¹¹。然而，该方法同样存在灵敏度低的问题，据估计，在实验室条件下能够成功培养的环境微生物少于2%¹²。组织学染色方法也被用于在媒介生物内检测和定位特定微生物，以探究不同分类群在蜱体内的分布情况，并研究有关微生物相互作用的假说。但该方法需要预先了解目标微生物的身份，以便选择合适的染色剂，因此不适用于未知微生物的鉴定与表征。此外，组织学染色过程耗时长、劳动强度大，难以适用于大样本量的研究。传统的分子方法（如Sanger测序）在检测复杂多样的微生物群落时，其灵敏度和检测能力也存在类似局限。

新一代测序技术能够快速从大量样本中鉴定微生物。标准标记基因的存在以及参考数据库的完善进一步提高了分类学分辨率，通常可达到属或种的水平。小亚基核糖体RNA常被用于实现这一目标，其中16S rRNA最为常用，因其基因内部含有保守区和可变区，便于设计通用引物，并为每种细菌产生独特的扩增子^13,14。本报告详细描述了通过16S rRNA新一代测序技术鉴定蜱类微生物组中分类单元的操作流程。特别地，本方案重点介绍了测序前的样品制备步骤。对于测序和生物信息学分析的相关步骤，仅提供较为通用的说明，因为目前存在多种测序平台和分析软件，且各自均有详尽的技术文档。本研究通过将该新一代测序方法应用于一种重要疾病传播媒介中的微生物群落组装机制探究，验证了该方法的整体可行性。

方案

1. 蜱虫采集与表面消毒

1. 通过在蜱虫相关生境中拖曳1 m²的白色布料采集蜱虫，或从宿主物种身上移除附着的蜱虫，或在实验室中饲养蜱虫^15,16。使用精细镊子操作蜱虫，并将其储存于-80 °C。
2. 将蜱虫放入各自的PCR管中，依次用500 μL过氧化氢（H₂O₂）、70%乙醇和ddH₂O涡旋振荡15秒，以去除表面污染物。
3. 将蜱虫转移至新的PCR管中，使其自然风干。
4. 在该管中，通过研钵和研杵（本研究中使用的方法）、使用珠击打器中的小珠或用解剖刀切开蜱虫，机械破坏蜱虫组织。

2. DNA 纯化

1. 按照市售DNA提取试剂盒提供的说明，从单个蜱虫中纯化DNA。最终洗脱体积为100 μL。
   注：有关步骤2.2–2.8的概览，请参见图1。替代的提取方法包括苯酚-氯仿提取法^17,18、乙醇沉淀法¹⁹或使用螯合材料进行提取^20,21。
2. 使用荧光计或分光光度计确认DNA纯化是否成功。进行荧光测定法时，在190 μL双链DNA检测体系中使用10 μL DNA模板。预期产量为0.1–1.0 ng/μL²²。进行分光光度法测定时，在核酸定量中使用1 μL DNA模板。预期A260/A280比值约为1.8²³。
3. 若不立即进行扩增，请将样品储存在-20 °C。

3. 16S rRNA 基因扩增

1. 在27.5 μL反应体系中进行扩增子PCR，体系包含：各5 μL浓度为1 μM的引物；12.5 μL市售PCR预混液；以及5 μL从单个蜱虫中提取的DNA（浓度为5 ng/μL）。
   注意：扩增16S rRNA基因的高变区V3-V4时使用以下引物¹³：
   5'--TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG--3'，
   5'--GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC--3'
2. 将PCR管转移至已编程的热循环仪中，程序设置如下：95 °C初始变性3 min；25个循环（每个循环包括：1）95 °C变性30 s，2）57 °C退火30 s，3）72 °C延伸30 s）；72 °C最终延伸5 min；最后在10 °C保存。
3. PCR完成后，取4–6 μL样品上样至1.5%琼脂糖凝胶，检测PCR产物。观察是否出现约460 bp的条带以确认扩增成功。
   注意：若样品浓度过低（< 10 ng），扩增产物可能在凝胶上不可见。低浓度样品中常出现引物二聚体。若存在其他非目标条带，可调整退火温度或减少循环次数。
4. 若不立即进行后续纯化步骤，应将样品保存在4 °C。

4. 16S 扩增子纯化

1. 每个样本使用新的PCR管，将PCR产物与ddH₂O混合，总体积为60 μL。对于DNA浓度较低的样本，需进行三份平行扩增PCR以减少扩增偏差，并将样本合并浓缩。
2. 将磁性珠恢复至室温，使用前充分涡旋振荡。
3. 向60 μL样本中加入48 μL磁性珠，孵育5分钟。将管子置于磁力架上5分钟，直至溶液变澄清，吸除上清液。
   注意：该磁珠浓度旨在去除引物二聚体（< 60 bp）。如有需要，可调整磁珠浓度以去除其他非特异性条带。
4. 保持管子在磁力架上，加入500 μL新鲜配制的80%乙醇。在所有管子中加入乙醇后立即用移液器吸出液体，切勿移除磁珠。重复乙醇洗涤一次。
5. 将管子敞口置于磁力架上干燥5分钟，或直至磁珠表面出现细小裂纹，以去除残留乙醇。
6. 加入20 μL TE缓冲液，将样本从磁力架上取下，在室温下孵育5–10分钟。
7. 将管子重新放回磁力架上，待磁珠与液体分离后，将上清液转移至新管中，即得纯化后的PCR产物。
8. （可选）取4–6 μL/样本上样于1.5%琼脂糖凝胶，通过电泳观察产物，以确认扩增子纯化成功。应可见460 bp条带，且无引物二聚体。
9. 若不立即进行加接头索引PCR，可将样本保存于4 °C。

5. 样品加标签与纯化

1. 通过从商业化的文库索引试剂盒中选择正向或反向引物，或两者同时选择，为每个样本分配唯一的引物组合。
   注意：唯一标记样本可在测序后进行区分。试剂盒通常提供足够用于测序96至384个样本的引物。
2. 通过在25 μL反应体系中进行PCR，将双端引物（即索引）连接到样本上，反应体系包含每种引物（N7xx和S5xx）各2.5 μL、12.5 μL商业PCR预混液、5 μL ddH₂O以及2.5 μL纯化后的扩增子产物。
3. 将试管转移至已编程的热循环仪中，程序设置如下：95 °C初始变性3分钟；进行8-14个循环，每个循环包括：1）95 °C变性30秒，2）55 °C退火30秒，3）72 °C延伸30秒；72 °C最终延伸5分钟；最后在10 °C保存。
4. PCR完成后，取4-6 μL/样本上样至1.5%琼脂糖凝胶，观察PCR产物。在550 bp处观察到条带即可确认扩增成功。
   注意：根据电泳结果调整索引PCR的循环次数。若出现非特异性结合，可降低循环数；若条带不明显，可增加循环数以获得可见条带。
5. 重复步骤4中列出的纯化步骤。为避免纯化过程中的稀释，建议索引PCR设置重复反应，并在此处合并产物。
6. 若不立即进行文库定量与归一化，可将样本保存于4 °C。

6. 文库定量与归一化

1. 使用荧光计或分光光度计（参见步骤 2.2）估算步骤 5.5 中获得的每种纯化后带条形码产物的浓度。用 TE 缓冲液稀释样品，使其浓度约为 1 pM。
   注意：文库定量对于达到测序平台推荐的上样浓度至关重要。文库定量通过 qPCR 实现，但在 qPCR 前先估算样品浓度可节省试剂和时间。建议使用 1 pM 的浓度以最大限度提高文库定量的准确性，因为这是定量试剂盒中提供的 qPCR 标准品的平均浓度²⁴。
2. 在 10 μL 反应体系中进行 qPCR，包含 6.0 μL qPCR 预混液（来自文库定量试剂盒）、2.0 μL ddH₂O 和 2.0 μL 样品或标准品。每个样品和标准品均设三个重复以提高准确性和精确性。每个样品应设置三个或更多稀释梯度（例如，根据预估起始浓度设置 0.1 pm、1 pm 和 10 pm），以确保定量结果准确。
   注意：所提供的引物和标准品的详细信息因所用定量试剂盒的不同而异，具体信息可参见产品技术数据表。请参阅本研究中所用定量试剂盒的材料表。
3. 将 qPCR 板或管转移至实时 PCR 仪，并设置程序如下：95 °C 预变性 5 分钟；35 个循环，每个循环包括 1）95 °C 变性 30 秒，2）60 °C 退火 45 秒；随后进行解离曲线分析，包括 1）95 °C 15 秒，2）60 °C 30 秒，3）95 °C 15 秒。
4. 根据 qPCR 结果获得的定量值以及所用样品的稀释梯度，计算每个样品的平均起始浓度。
   注意：例如，某样品稀释倍数为 1:100,000，其平均浓度为 2 pM，则其原始起始浓度为 200 nM。若某一特定样品的所有稀释梯度均未落在标准曲线范围内，则定量结果可能不准确；此时应调整稀释梯度并重新进行 qPCR。
5. 根据步骤 7.5 计算得到的平均浓度，将每种纯化后带条形码的样品用 TE 缓冲液稀释至 4 nM。
   注意：例如，若样品平均浓度为 200 nM，则将其用 TE 缓冲液按 1:50 稀释即可获得 4 nM 的浓度。最终所需精确样品浓度可能因所用测序系统和试剂盒不同而有所差异。请参考测序系统用户手册中推荐的浓度。
6. 通过向单个管中加入所有独立文库等体积（通常为 5–10 μL）的样品，构建混合文库。
   注意：由于所有样品浓度均为 4 nM，等体积混合可确保混合文库中各样品浓度相等。
7. 对混合文库重复执行步骤 6.2–6.4，以确认其浓度为 4 nM。
8. 计算混合文库的浓度，并根据需要使用 Tris 缓冲液对最终混合文库进行稀释或重新配制，使其浓度达到 4 nM。
9. 若不立即进行上样，应将样品储存于 -20 °C。建议在定量完成后尽快进行测序，以尽量减少储存过程中 DNA 浓度的损失或变化。

7. 文库变性与稀释及测序运行（需在同一天内完成）

1. 用 NaOH 变性第 6.9 步得到的 4 nM 混合文库。
   注意：这些最终文库制备步骤因测序系统而异。请参考测序系统用户指南以获取更详细和更新的方案。新用户可能需要接受测序平台使用的培训，或可将文库送至核心测序设施进行测序。
2. 使用测序试剂盒中提供的缓冲液（材料表）将变性后的文库稀释至所需的上样浓度。
   注意：最佳上样浓度因测序系统而异，通常范围为 1–250 pM²⁵。
3. 对测序对照进行变性并稀释。
   注意：添加测序对照可校正由低多样性文库引起的测序问题。使用 NaOH 对测序对照进行变性，并将其稀释至与文库相同的浓度。
4. 将文库与测序对照混合。
   注意：测序对照与混合文库的比例取决于所用文库的多样性和测序系统，但通常为 1:1²⁶。
5. 将混合后的文库与测序对照混合物上样至测序流动池中。

8. 扩增子序列分析

1. 通过查看与测序系统相对应的云计算环境中的运行指标，评估运行的整体成功率。
   注意：运行指标（如测序读段数量）将根据所使用的测序平台和试剂盒而有所不同。常见测序系统的靶标值列于 表1.
2. 下载原始测序数据和所需的生物信息学开源软件——微生物生态学定量分析工具（QIIME）²⁷ 或 Mothur²⁸.
   注意：QIAME 和 Mothur 均为开源软件，可免费下载。有关使用这些程序的详细说明可在线获取，内容充分详尽，适合初次使用者。以下步骤简要概述了在 QIIME 中进行的生物信息学分析流程。使用者无需具备 Python 使用经验，但掌握 Python 将有助于执行以下脚本。
3. 使用以下方法创建并验证映射文件 "validate_mapping_file.py" QIIME 中的脚本
   注意：该映射文件包含进行数据分析所需的所有元数据，包括样本编号、扩增子引物序列和样本描述。验证步骤用于检查是否已以正确格式输入所有必要数据。
4. 使用以下方法对序列进行解复用和过滤 "split_libraries.py" 脚本图1).
   注意：该脚本根据测序文件中输入的索引引物组合和样本编号，将带有条形码的测序读段分配给相应样本。同时，脚本还会根据用户设定的最低质量分数、序列长度和末端截除阈值，执行多项质量过滤步骤，以控制测序错误。
5. 使用以下方法将操作分类单元（OTUs）分配给序列 "pick_open_references_otus.py" 脚本
   注意：在此步骤中，序列将基于一定的序列相似性阈值（通常为97%）与参考序列集合进行比对聚类。未能匹配到参考序列集合的读长将相互之间进行聚类。尽管也可选择从头聚类（de novo）和封闭参考聚类（closed-reference）的OTU picking方法，但QIIME开发者推荐使用开放参考聚类（open-reference picking）方法。
6. 使用以下方法对OTU表进行标准化 "alpha_rarefaction.py" 或 "normalize_table.py" 脚本
   注意：此步骤用于校正因现代测序技术导致的列总和（即每个样本的总序列读长数）差异。标准化可通过传统稀疏法或替代方法（如累积和缩放）实现。
7. 同时进行多项α多样性、β多样性和分类组成多样性分析，使用 "core_diversity_analysis.py" 脚本
   注意：或者，可使用单独的脚本分别运行这些分析（例如， "alpha_diversity.py").

结果

共处理了来自三个独立卵块和两个土壤暴露期（0周和2周）的42只蜱虫样本，用于微生物组测序。每个处理组定义为一个卵块与一个暴露时间的组合，包含6至8个重复蜱虫样本。这些处理后的蜱虫提取物被加载到新一代测序仪上，共获得12,885,713条通过过滤的双端测序读长。本次测序运行中还包括3个提取步骤的阴性对照，共产生211,214条读长（已计入前述总数）。进一步的测序质量指标及各项指标的最佳值详见表2。稀疏曲线（反映测序努力程度与每样本操作分类单元OTU数量之间的关系）表明，每样本2,129条读长的测序深度（即每样本唯一的序列读长数量）足以充分捕获微生物群落的多样性（图2）。稀疏水平会因样本类型而异，需针对每次测序运行单独确定。在将数据稀疏化至该深度后，所有样本中共鉴定出1,714个OTU，平均每样本含有93.3 ± 4.3个OTU。为避免稀疏矩阵带来的下游分析问题并去除潜在污染物，所有在至少一个样本中相对丰度低于1%的OTU均被归入一个稀有通用类别。此外，使用R语言中的decontam...

讨论

16S rRNA 的新一代测序已成为微生物鉴定的标准方法，并推动了媒介微生物组对病原体传播影响的研究。本文所述方案详细介绍了利用该方法研究莱姆病传播媒介物种 I. pacificus 中微生物群落的组装过程；然而，该方法也可轻松应用于其他蜱类或节肢动物媒介物种的研究。

事实上，用于微生物组分析的16S rRNA测序已被广泛应用于研究包括蚊子、木虱和采采蝇在内的媒介生物的微生物组^29,30,31。其他可用于媒介生物内微生物鉴定的方法包括显微镜检查、培养和组织学染色。如果目标是鉴定和描述一种新的微生物（显微镜检查）、评估抗菌药物的效果（培养）或定位媒介生物体内特定且已知的微生物（组织学染色），这些方法可能比测序更为合适。然而，这些方法在特异性、检测灵敏度和可扩展性方面存在不足，因此在鉴定媒介生物体内完整的微生物群落或在不同生态和实验条件下表征其微生物组时适用性较低。相反，16S rR...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
项目	材料/设备名称	公司	目录编号 #
1	DNeasy 血液 & 组织试剂盒	Qiagen	69504
2	Qubit 4 荧光仪	赛默飞世尔科技	Q3326
3	NanoDrop 8000 分光光度计	赛默飞世尔科技	ND-8000-GL
4	2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Kapa Biosystems	KK2501
5	AMPure XP 磁珠	Agen Court	A63880
6	磁力架	赛默飞世尔科技	MR02
6	TE缓冲液	Teknova	T0223
7	Nextera Index试剂盒	Illumina	FC-121-1011
8	KAPA文库定量试剂盒	罗氏	KK4824
9	MiSeq 系统	Illumina	SY-410-1003
10	MiSeq 试剂盒 v3	Illumina	MS-102-3001
11	含0.1% Tween 20的10 mM Tris-HCl	Teknova	T7724