通过下一代16S rRNA扩增子测序对蜱微生物组进行表征

摘要

本文介绍一种用于16S rRNA测序的下一代测序方案，可实现对媒介生物内微生物群落的鉴定与特征分析。该方法包括DNA提取、通过PCR对样本进行扩增和加标签、在流动池上进行测序，以及利用生物信息学将测序数据与系统发育信息进行比对。

摘要

近几十年来，媒介传播疾病以惊人的速度重新出现并不断扩散，导致全球范围内的发病率和死亡率显著上升。目前，大多数此类疾病缺乏有效且广泛可及的疫苗，因此亟需开发新的疾病防控策略。在此背景下，一种有前景的疾病控制途径是靶向媒介微生物组，即定殖于媒介体内的微生物群落。媒介微生物组在病原体动态变化中发挥关键作用，对微生物组的干预已成功减少了多种媒介传播疾病的媒介数量或病原体传播能力。然而，要将这些研究成果转化为实际的疾病控制应用，必须深入理解媒介微生物生态学，而这一领域的发展长期受限于技术手段的不足。新一代测序技术的出现使得对多种微生物群落进行快速、高通量的测序成为可能。通过靶向高度保守的16S rRNA基因，研究人员能够在不同生态和实验条件下对媒介体内存在的微生物进行表征。该技术包括扩增16S rRNA基因、通过PCR对样本进行条形码标记、将样本加载到流动池中进行测序，以及利用生物信息学方法将测序数据与系统发育信息进行比对。该方法通常可实现对大量重复样本在物种或属水平上的鉴定，从而克服了传统培养、显微镜检查或组织学染色技术在检测灵敏度、分辨率和输出效率方面的局限性。因此，该方法非常适合在多种条件下对媒介微生物进行表征，但目前尚无法提供有关微生物功能、其在媒介体内的定位或对抗生素治疗反应的信息。总体而言，16S新一代测序是一种有力的技术手段，有助于更深入地理解媒介微生物的种类及其在疾病传播动态中的作用。

引言

近几十年来，虫媒传播疾病的再次出现和扩散对全球人类及野生动物健康构成了严重威胁。目前大多数此类疾病缺乏有效的疫苗，且由于传播媒介及其与宿主相互作用的生物学复杂性，防控工作受到阻碍。深入了解媒介体内微生物相互作用在病原体传播中的作用，有助于开发出克服这些挑战的新策略。特别是，媒介相关微生物中的共生菌、互利共生菌与病原体之间的相互作用（统称为微生物组）可能对病原体的传播能力产生重要影响。现有大量证据支持这一观点，已有研究实例表明媒介微生物组与疟疾、寨卡病毒病和莱姆病等疾病的传播能力之间存在关联^1,2,3。然而，要将这些发现转化为疾病控制策略，还需更深入地了解媒介微生物组的结构、功能及其来源。在不同生态和实验条件下识别并表征媒介微生物群落，是推动该领域发展的关键方向。

本文通过利用莱姆病病原体 Borrelia burgdorferi 的传播媒介——西方黑腿蜱 Ixodes pacificus，提供了一种鉴定病原体传播媒介中微生物群落成员的方法。尽管蜱类携带的人类病原体种类超过任何其他节肢动物，但目前对蜱类微生物组的生物学及其群落生态学的了解仍然相对有限⁴。已有研究表明，蜱类体内栖居着多种多样的病毒、细菌、真菌和原....

方案

1. 蜱虫采集与表面消毒

1. 通过在蜱虫相关生境中拖曳1 m²的白色布料采集蜱虫，或从宿主物种身上移除附着的蜱虫，或在实验室中饲养蜱虫^15,16。使用精细镊子操作蜱虫，并将其储存于-80 °C。
2. 将蜱虫放入各自的PCR管中，依次用500 μL过氧化氢（H₂O₂）、70%乙醇和ddH₂O涡旋振荡15秒，以去除表面污染物。
3. 将蜱虫转移至新的PCR管中，使其自然风干。
4. 在该管中，通过研钵和研杵（本研究中使用的方法）、使用珠击打器中的小珠或用解剖刀切开蜱虫，机械破坏蜱虫组织。

2. DNA 纯化

1. 按照市售DNA提取试剂盒提供的说明，从单个蜱虫中纯化DNA。最终洗脱体积为100 μL。
   注：有关步骤2.2–2.8的概览，请参见图1。替代的提取方法包括苯酚-氯仿提取法^17,18、乙醇沉淀法¹⁹或使用螯合材料进行提取

结果

共处理了来自三个独立卵块和两个土壤暴露时间（0周和2周）的42只蜱虫样本，用于微生物组测序。每个处理组定义为一个卵块与一个暴露时间的组合，包含6–8个重复的蜱虫样本。这些处理后的蜱虫提取物被加载到新一代测序仪上，共获得12,885,713条通过过滤的成对末端序列。本次测序运行中还包括3个提取过程的阴性对照，共产生211,214条序列（已计入前述总数）。各项测序运行质量指标及其对应的最佳值详见表2。稀疏曲线（反映测序努力程度与每样本操作分类单元OTU数量之间的关系）表明，当测序深度（即每个样本的唯一序列读长数）达到2,129条时，足以充分捕获微生物群落的多样性（图2）。稀疏水平会因样本类型而异，需针对每次测序运行单独确定。在将数据稀疏化至该深度后，所有样本中共鉴定出1,714个OTU，平均每样本含有93.3 ± 4.3个OTU。为避免稀疏矩阵带来的下游分析问题并去除潜在污染物，所有在至少一个样本中相对丰度低于1%的OTU均被归入一个稀有通用类别。此外，使用R语言中的decontam.......

讨论

16S rRNA 的新一代测序已成为微生物鉴定的标准方法，并推动了媒介微生物组对病原体传播影响的研究。本文所述方案详细介绍了利用该方法研究莱姆病传播媒介物种 I. pacificus 中微生物群落的组装过程；然而，该方法也可轻松应用于其他蜱类或节肢动物媒介物种的研究。

事实上，用于微生物组分析的16S rRNA测序已被广泛应用于研究包括蚊子、木虱和采采蝇在内的媒介生物的微生物组^29,30,31。其他可用于媒介生物内微生物鉴定的方法包括显微镜检查、培养和组织学染色。如果目标是鉴定和描述一种新的微生物（显微镜检查）、评估抗菌药物的效果（培养）或定位媒介生物体内特定且已知的微生物（组织学染色），这些方法可能比测序更为合适。然而，这些方法在特异性、检测灵敏度和可扩展性方面存在不足，因此在鉴定媒介生物体内完整的微生物群落或在不同生态和实验条件下表征其微生物组时适用性较低。相反，16S rR.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
项目	材料/设备名称	公司	目录编号 #
1	DNeasy 血液 & 组织试剂盒	Qiagen	69504
2	Qubit 4 荧光仪	赛默飞世尔科技	Q3326
3	NanoDrop 8000 分光光度计	赛默飞世尔科技	ND-8000-GL
4	2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Kapa Biosystems	KK2501
5	AMPure XP 磁珠	Agen Court	A63880
6	磁力架	赛默飞世尔科技	MR02
6	TE缓冲液	Teknova	T0223
7	Nextera Index试剂盒	Illumina	FC-121-1011
8	KAPA文库定量试剂盒	罗氏	KK4824
9	MiSeq 系统	Illumina	SY-410-1003
10	MiSeq 试剂盒 v3	Illumina	MS-102-3001
11	含0.1% Tween 20的10 mM Tris-HCl	Teknova	T7724