一种基于网状模具的无支架三维心脏组织构建方法

摘要

本方案描述了一种基于网状模具的方法，用于构建具有满意结构完整性和同步搏动行为的三维无支架心肌组织。

摘要

本方案描述了一种基于新型简易网状模具的三维（3-D）心肌组织构建方法，无需额外的支架材料。分离人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CMs）、人心脏成纤维细胞（HCFs）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs），并制备成细胞悬液，其中含70% iPSC-CMs、15% HCFs和15% HUVECs。将细胞悬液置于超低吸附性的“悬滴”培养系统中进行共培养，该系统含有微孔结构，可同时浓缩数百个球形聚集体。细胞在共培养3天后自发聚集并形成具有搏动功能的球状体。收集球状体后接种至新型模具腔内，并在培养箱中置于摇床上继续培养。接种约7天后，球状体发育为成熟的、具有功能性的组织。所获得的多层组织由融合的球状体构成，具备良好的结构完整性和同步搏动特性。该新方法具有良好的可重复性和成本效益，未来有望成为治疗心力衰竭的工程化组织构建策略。

引言

目前心脏组织工程的目标是开发出能够替代或修复受损心肌组织结构与功能的治疗方法¹。构建具有天然心脏组织重要收缩性和电生理特性的三维心脏组织模型的方法正在迅速发展^2,3。已有多种策略被探索并应用于相关研究^4,5，这些方法包括使用特定的合成与天然生物活性水凝胶（如明胶、胶原蛋白、纤维蛋白和多肽）⁶，以及生物墨水沉积技术²和生物打印技术⁷。

已有研究表明，无支架方法能够产生与基于生物材料的方法相当的组织，同时避免了引入外源性支架材料所带来的缺点⁸。Oren Caspi et al. 证明，通过整合多种类型的细胞，可生成高度血管化的人工工程化心肌组织⁹。Chin et al. 开发了一种利用球状体进行心脏补片3D打印的方法，所获得的补片由心肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞按70:15:15的比例组成¹⁰。研究表明，球状体作为无支架心肌组织构建的“基本单元”具有显著效果，因其对缺氧具有较强耐受性，并具备足够的机械完整性以满足植入需求^11,12。先前的研究已报道了多种球状体的制备方法，包括悬滴法、旋转瓶培养¹³、微流控系统¹⁴，以及使用未包被或包被琼脂糖微模具的非黏附性培养表面¹⁵。在本实验方案中，我们采用悬滴装置，该装置含有微孔结构，可同时浓缩数百个球状体。

本研究提出了一种新颖且高效的无支架心肌组织构建方法，该方法包括将球状体手动接种至方形模具腔内，并在摇床中孵育以促进组织成熟。在常规静态培养条件下，氧气扩散仅限于组织结构的外层区域，导致中心部位发生坏死。然而，使用网状模具后，接种于模具内的所有球状体均浸没在培养基中，并处于持续的流体运动状态，从而增强了营养物质和氧气的扩散。此外，这种基于模具的方法能够以最少的人工操作同时制备不同尺寸的组织片，且所得组织可轻松从模具中取出。该创新方法实现了无支架、多层心肌补片的高效且可重复的构建。

方案

1. 心肌细胞的制备

1. 用基底膜基质包被6孔板，并按照先前所述方法培养人诱导多能干细胞（hiPSCs）¹⁷。
2. 使用先前所述方法将hiPSCs分化为hiPSC来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）¹⁸。
3. 在分化后16–18天，用2 mL不含钙和镁的1×磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗每孔，随后在室温下加入1 mL/孔胰蛋白酶或细胞解离试剂（见材料表），孵育5分钟，使心肌细胞悬浮。
4. 使用等体积的添加B-27的RPMI（Roswell Park Memorial Institute）细胞培养基（RPMI/B-27细胞培养基）中和胰蛋白酶或细胞解离试剂（见材料表），并通过移液吹打数次以松解贴壁细胞。
5. 用10 mL血清移液管收集悬浮的心肌细胞，并转移至50 mL锥形管中。
6. 在室温下以250 × g 离心5分钟，使细胞沉淀。
7. 用10 mL RPMI/B-27细胞培养基重悬细胞沉淀。
8. 取20 µL细胞悬液与等体积的0.4%台盼蓝溶液混合，轻轻混匀。
9. 使用手动血细胞计数板对细胞悬液进行计数，测定细胞浓度和细胞活力。

2. 成纤维细胞的制备

1. 按照先前所述方法启动人成人心室型心脏成纤维细胞（HCF）细胞系的培养¹⁶。
2. 在室温下用适量胰蛋白酶或细胞解离试剂（见材料表）孵育HCF细胞5分钟，使细胞悬浮。对于T175培养瓶，使用10 mL胰蛋白酶或细胞解离试剂¹⁶。
3. 用等体积的培养基中和胰蛋白酶或细胞解离试剂（见材料表），然后将样品转移至50 mL锥形管中，在室温下以250 × g离心5分钟，获得细胞沉淀。
4. 用10 mL成纤维细胞生长培养基重悬细胞沉淀（见材料表）。
5. 取20 µL HCF细胞悬液与等量0.4%台盼蓝溶液混合，轻轻混匀。
6. 使用自动细胞计数仪或手动血细胞计数板对新制备的细胞悬液进行计数，测定细胞浓度和细胞活力。

3. 内皮细胞的制备

1. 按照先前所述方法启动人脐静脉内皮细胞（HUVEC）系的培养¹⁷. 用适量的胰蛋白酶或细胞解离试剂孵育 HUVECs，使其悬浮（参见 材料表室温下孵育 3 分钟¹⁷. 用完全培养基中和胰蛋白酶或细胞解离试剂（参见 材料表) 使用等体积的培养基重悬，然后转移至50 mL锥形管中，在250 × g条件下离心细胞悬液 g 室温下离心5分钟以获得沉淀。
   注意：对于T175培养瓶，使用10 mL胰蛋白酶或细胞解离试剂。
2. 将沉淀物重悬于10 mL内皮细胞生长培养基中（参见 材料表).
3. 将20 µL HUVEC悬液与等体积的0.4%台盼蓝溶液混合染色，轻轻混匀。
4. 使用自动细胞计数器或手动血细胞计数板对细胞悬液进行计数，以获得细胞浓度和细胞活力。

4. 悬滴球状体的制备

1. 将含有850个微孔（每个微孔直径为350 µm）的悬滴装置放入无菌的6孔板中。
2. 按照上述方法分离三种细胞：hiPSC-CMs、HCFs和HUVECs。将它们以70% iPSC-CMs、15% HCFs和15% HUVECs的比例混合，加入RPMI/B-27细胞培养基，使细胞浓度达到每毫升2,475,000个细胞，置于50 mL锥形管中。
3. 向置于6孔板中的超低吸附悬滴系统（微孔直径为350 µm）的每孔中加入4 mL细胞悬液（每毫升含2,475,000个细胞）。
4. 细胞悬液加入悬滴装置后12小时内，类球体将自发形成。继续在37 °C、5% CO₂和95%湿度条件下培养，总培养时间为72小时（3天），以促进类球体的成熟。
5. 培养72小时后，将悬滴装置放入含有培养基的培养皿中，轻轻旋转以使类球体从装置底部的微孔中释放，从而收集类球体。

5. 使用新型网状模具制备三维细胞贴片

1. 使用无菌镊子辅助，将底座、底部方板、底部网片以及10层侧网组装，构建新型模具。首先，利用角柱将底座、底部方板和底部网片堆叠并对齐。然后，将10层侧网以交替方向逐层堆叠，形成由精细不锈钢针组成的网状结构。
2. 用PBS或培养基冲洗填充底座，以降低表面张力，随后将组装好的模具转移至填充底座上。
3. 采用相同方法用PBS或培养基润湿网状模具的腔体。缓慢将类球体填充至预设尺寸（2 × 2 × 1 mm、4 × 4 × 1 mm 或 6 × 6 × 1 mm）的腔体内。
   注意：确保填入腔体的类球体体积达到预期体积的120%，以保证细胞聚集体紧密连接并保持静止状态。
4. 将顶部网片和顶部方板安装到角柱上，并固定塞子和固定管，防止类球体被冲出。
5. 将装填完毕的网状模具系统转移至含有6 mL RPMI/B-27细胞培养基的6孔板中，或转移至无菌容器中，容器内需加入足量培养基以完全覆盖组装好的模具。
6. 将装有模具系统的6孔板置于摇床上，在3,000 – 4,000 × g 条件下孵育7 – 10天。
   注意：孵育时间由心肌补片的大小决定。对于较大的补片，需延长孵育时间以促进心肌补片的成熟。

6. 从新型网状模具上移除贴片

1. 将模具系统从培养基中取出，放置在无菌10 cm培养皿内的灭菌操作垫上。
2. 移除固定管、塞子、顶部方形板和顶部网片。使用无菌镊子逐一小心地滑出层叠的侧网片。脱模后，完整的心肌补片即位于底部网片上。
3. 用无菌镊子夹起带有补片的底部网片，将其转移至含有5 mL RPMI/B27培养基的35 mm培养皿中。通过在培养皿中缓慢旋转网片，或使用无菌细胞刮棒，轻轻将补片从底部网片上松解。脱离底部网片后，心肌组织可在RPMI/B27培养基中继续培养。
4. 将游离的三维心肌补片继续在35 mm培养皿中孵育。自脱模后约24小时起，即可观察到功能性同步搏动。
5. 将补片从网状模具取出后，观察其形态是否保持完整，并可见同步搏动强度随时间逐渐增强。
   注意：基于三维网状模具制备的心肌补片在脱模后表现出组分心肌球之间的电整合性。我们观察到搏动频率在每分钟60至80次之间，并可持续超过60天。

结果

在我们的实验中，我们使用了含有70% iPSC-CMs、15% HCFs和15% HUVECs的细胞悬液，培养基为RPMI/B-27，细胞浓度为每毫升2,475,000个细胞。制备细胞悬液后，按照方案第4.3步所述，将4 mL细胞悬液加入超低吸附悬挂液滴系统的每个孔中。在37 °C、5% CO₂和95%湿度条件下培养3天后，悬挂液滴系统可自发形成数百个跳动的球状体。培养72小时后，在4倍和10倍光学显微镜下可轻松观察到球状体的搏动，其平均直径为350 µm（图1）。

在实验方案第6.5步结束时，收集类球体后，可通过简单的移液方法轻松将类球体接种至模具中。培养过程中类球体在模具内发生融合；随后移除模具，即可获得具有机械完整性的完整心肌组织片。从模具中取出并继续培养24小时后，可观察到心肌组织出现功能性且同步的搏动，证实了类球体之间的机械整合（

讨论

该方法的重要性在于其可重复性以及所获得的多层心肌组织的有效性。在心肌组织工程领域，当前目标之一是找到一种构建能够搏动、具有多层结构且功能完整的三维心肌补片的方法。我们报道了一种高效且可重复的多层心肌组织构建方法，即通过将由心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞组成的球状体直接手动接种到一种新型网状模具中来实现。本方法所使用的网状模具具有多种不同尺寸，可用于制备大小从 2 × 2 × 1 mm 到 6 × 6 × 1 mm 不等的组织。我们所描述的技术也可根据所需组织几何形状的不同，调整用于其他形状或系统的模具。文中所述的细胞浓度和比例此前已针对人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）进行了优化，若更换为其他细胞类型，则需进一步评估和调整。

的 体外 利用生物打印技术构建三维心脏组织的研究已开展，旨在开发治疗和诊断模型。然而，现有的生物打印方法较为繁琐，需要耗费大量时间，并依赖针头或支架材料等辅助支撑结构。这些辅助支撑结构的存在会降低营养物质和氧气的扩散效率¹⁸因此，由于缺乏为组织供氧和营养的毛细血管，中心坏死是当...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人源心脏成纤维细胞（HCF）	Sciencell	6310
FM-2 含基础培养基	Sciencell	2331	HCF 培养基
人脐静脉内皮细胞（HUVEC）	Lonza	CC-2935
EGM+Bullet Kit	Lonza	CC5035	HUVEC 培养基
E8 培养基	Invitrogen	A1517001	HiPSC 培养基
Geltrex	Invitrogen	A1413202
TrypLE Express 酶（1X）	Thermo Fisher	12604013	胰蛋白酶及细胞解离试剂
RPMI 培养基	Invitrogen	11875093	添加 B-27 补充剂的 RPMI 培养基为 hiPSC-CM 培养基
B-27 补充剂（50x）	Thermo Fisher	17504044	添加 B-27 补充剂的 RPMI 培养基为 hiPSC-CM 培养基
台盼蓝溶液，0.4%	Thermo Fisher	15250061
新型网状模具	TissueByNet Co.,Ltd	NM25-1
悬滴培养板	Kuraray Co.,Ltd	MPc350
6 孔板	Sigma-Aldrich	CLS-3516