基于网模的无支架三维心脏组织创建方法

摘要

本协议描述了一种基于净模的方法来创建三维无支架的心脏组织, 结构完整性和同步跳动行为令人满意。

摘要

该协议描述了一种新的和简单的基于网络模型的方法, 以创建三维 (3 维) 心脏组织没有额外的支架材料。人诱导的多潜能干细胞衍生心肌细胞 (iPSC cms), 人心脏成纤维细胞 (HCFs) 和人脐静脉内皮干细胞 (血管内皮细胞) 被隔离, 并用于产生细胞悬浮与 70% iPSC CMs, 15% HCFs, 15% 血管内皮细胞。他们是共同培养的超低附件 "悬挂下降" 系统, 其中包含孔, 以凝聚数以百计的球体一次。在共培养3天后, 细胞聚集并自发形成跳动球体。球体的收获, 种子成一个新的模具腔, 并培养在一个振动筛在孵化器。球体成为成熟的功能组织大约7天后播种。所合成的多层组织包括融合球体, 结构完整性良好, 同步跳动行为。这种新方法具有很好的潜力, 可以作为一种重现性和成本效益高的方法, 为将来的心力衰竭治疗创造出工程组织。

引言

目前心脏组织工程的目的是开发一种替代或修复损伤心肌组织的结构和功能的治疗方法¹。方法建立3维心脏组织模型, 显示本机心脏组织的重要收缩和电生理特性, 迅速扩大^2,3。在研究^4、5中探索和使用了各种战略。这些方法包括使用特定的合成和天然生物活性水凝胶, 如明胶, 胶原蛋白, 纤维蛋白和肽⁶, 生物墨水沉积技术²和生物打印技术⁷。

研究表明, 无支架的方法可以产生可比的组织作为生物材料的方法, 而不存在的缺点, 纳入外国脚手架材料⁸。奥伦 Caspi等人证明, 结合各种类型的细胞, 使生成高血管化的人类工程心脏组织⁹。下巴等人开发了一种3维印刷方法的心脏补丁创建从球体。所产生的斑块由心肌细胞、纤维细胞和内皮干细胞组成, 比例为 70:15:15.¹⁰。球体已被证明是有效的 "积木" 的无支架的心脏组织创建, 因为他们耐缺氧, 并拥有足够的机械完整性, 植入^11,12。以前的研究已经展示了几种制造球体的方法, 包括使用吊滴法、微调烧瓶¹³、微流控系统¹⁴和非粘附的培养表面, 不涂或涂有琼脂糖微模¹⁵。在本协议中, 我们使用悬挂放置装置, 其中包含孔, 以凝聚数以百计的球体一次。

本研究提出了一种新的、高效的无支架的心脏组织创建方法, 包括将球体人工播种到方形模腔中, 并在振动筛上孵化组织以进行成熟。在通常的静态培养条件下, 氧扩散仅限于组织结构的外部, 导致中心坏死。然而, 随着网模, 所有的球体种子进入模具都沉浸在介质中, 不断的射流运动, 使养分和氧气的扩散增加。此外, 这种基于模具的方法允许同时创建不同大小的组织补丁, 用最少的人工努力, 由此产生的组织可以很容易地从模具中删除。这种新的方法允许有效和可重复的创建无支架, 多层心脏补丁。

方案

1. 心肌细胞的制备

1. 用基底膜基质和培养人诱导的多能干细胞 (hiPSCs) 6 井板, 如前所述的¹⁷。
2. 使用以前描述的方法¹⁸将 hiPSCs 区分为 hiPSC CMs。
3. 在 16-18 d 的分化后, 通过冲洗每个井与2毫升的1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS), 不含钙或镁, 然后孵化与1毫升/井的胰蛋白酶或细胞离解试剂 (见表材料) 室温下5分钟。
4. 与胰蛋白酶或细胞离解试剂 (参见材料表) 使用同样数量的罗斯威尔公园纪念协会 (RPMI) 细胞媒介补充与 B-27 (RPMI/B-27 细胞媒介)。吸管向上和向下松开任何粘附细胞。
5. 用10毫升血清学吸管收集悬浮心肌细胞, 将其转移到50毫升圆锥管。
6. 离心细胞悬浮在 250 x g 5 分钟室温下获得细胞颗粒。
7. 并用重悬10毫升 RPMI/B-27 细胞培养基中的颗粒。
8. 将20µL 的细胞悬架与同等数量的0.4% 台盼蓝溶液结合, 轻轻搅拌。
9. 使用手动 hemocytometer 计数和获得细胞悬浮液的浓度和细胞活性。

2. 成纤维细胞的制备

1. 启动一个人心脏成纤维细胞 (HCF) (成人心室类型) 单元格线的培养, 如前所述¹⁶。
2. 在室温¹⁶下, 用适当数量的胰蛋白酶或细胞离解试剂 (见材料表) 将 HCFs 悬浮在5分钟内。对于 T175 瓶, 使用10毫升的胰蛋白酶或细胞离解试剂。
3. 用同等体积的培养基中和胰蛋白酶或细胞离解试剂 (见材料表), 然后将样品转移到50毫升锥形管中, 离心机在室温下以 250 x g为5分钟的细胞悬浮液, 以获得颗粒。
4. 并用重悬10毫升成纤维细胞生长介质中的颗粒 (见材料表)。
5. 将 HCF 细胞悬浮液的20µL 与同等量的0.4% 台盼蓝溶液结合, 轻轻搅拌。
6. 使用自动单元格计数器或手动 hemocytometer 计数并获得新细胞悬浮液的浓度和细胞活力。

3. 内皮细胞的制备

1. 启动人类脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 线的培养, 如前所述¹⁷。在室温¹⁷下, 用适当数量的胰蛋白酶或细胞离解试剂 (见材料表) 将血管内皮细胞悬浮在3分钟内。中和胰蛋白酶或细胞离解试剂 (见材料表) 使用同等体积的介质, 然后转移到一个50毫升圆锥管和离心机的细胞悬浮在 250 x g 5 分钟在室温下获得颗粒。
   注: 对于 T175 瓶, 使用10毫升的胰蛋白酶或细胞离解试剂。
2. 并用重悬10毫升内皮细胞生长培养基中的颗粒 (见材料表)。
3. 结合20µL 的 HUVEC 悬浮液, 并将其与同等数量的0.4% 台盼蓝溶液进行染色, 并轻轻搅拌。
4. 使用自动单元格计数器或手动 hemocytometer 计数和获得细胞悬浮液的浓度和细胞活力。

4. 创建吊滴球体

1. 将包含850孔 (每个直径350µm) 的悬挂放置装置放入无菌6井板中。
2. 隔离上述三种类型的细胞: hiPSC-CMs、HCFs 和血管内皮细胞。将它们与 70% iPSC CMs、15% HCFs 和15% 血管内皮细胞的比例结合在一个50毫升圆锥管中, RPMI/B-27 细胞介质的浓度为每毫升247.5万个细胞。
3. 将4毫升的细胞悬浮液 (每毫升247.5万个细胞) 分配给一个超低附着物悬挂系统的每一个井 (其中微孔直径为350µm), 坐在6井板上。
4. 球体将自发地在12小时内将细胞悬浮液放入吊滴装置中。继续养殖为共 72 h (3 d) 在37°c, 5% CO₂, 和95% 湿气为成熟的球体。
5. 经过72小时的养殖, 通过将设备放入介质中, 并轻轻旋转, 将球体从悬挂装置中释放出来, 在悬挂系统底部的毛孔中收获球体。

5. 使用新颖的网模创建3维补丁

1. 将底座、底板、底网和10层侧网组装起来, 用一副无菌钳来制造新型模具。首先, 使用拐角柱堆叠并对齐底座、底方板和底部网。然后, 堆叠和层10侧网在交替的方向, 以创建一个良好的不锈钢齿网。
2. 用 PBS 或介质冲洗填充底座, 以减少表面张力, 然后将装配模转移到填充底座上。
3. 用同一方法将网模腔与 PBS 或介质一起湿。将球体慢慢填入所需尺寸的预设腔体 (2 x 2 x 1 毫米, 4 x 4 x 1 毫米, 或 6 x 6 x 1 毫米)。
   注: 确保球体的预期体积的120% 被送入腔内, 使细胞聚集紧密连接并保持静止。
4. 将顶部网和顶方板装配到拐角的柱子上, 并确保塞子和保温管的安全, 防止球体的冲刷。
5. 将填充的网模系统转移到6井板上, 6 毫升的 RPMI/B-27 细胞介质, 或进入一个无菌容器, 有足够的介质覆盖整个组装模具。
6. 在 7-10 天, 在 3000-4000 x g上, 在摆动的振动筛上孵化6井板, 并装满模具系统。
   注意: 孵化的持续时间取决于心脏斑块的大小。随着斑块的增大, 心脏斑块成熟时需要增加潜伏期。

6. 从新型网模中去除修补程序

1. 将模具系统从介质中取出, 并将其放在无菌的10厘米盘中灭菌处理垫上。
2. 卸下保温管、塞子、顶方板和顶网。小心地滑出分层的侧网一个一个用一对消毒钳。全麻拔管后, 在底部网上获得完整的心脏修补。
3. 用无菌钳把底网接上, 用5毫升的 RPMI/B27 介质将底网转移到35毫米的盘子里。在盘子里慢慢地旋转网, 或者用不育的细胞刮刀轻轻地松开底部网的补丁。从底网分离后, 可以用 RPMI/B27 培养基培养心脏组织。
4. 继续在35毫米的菜肴中孵化游离漂浮的3维心脏补丁。功能同步跳动可以观察早在24小时后, 从模具去除。
5. 从网模中去除修补后, 观察其形状保持完整性, 同步跳动强度随时间增加。
   注: 3 维网状模心片在全麻拔管后表现为 cardiospheres 元件的电集成。我们观察到每分钟60到80次的跳动频率, 持续时间超过60天。

结果

在我们的实验中, 我们利用细胞悬浮 70% iPSC CMs, 15% HCFs, 15% 血管内皮细胞在 RPMI/B-27 细胞介质中浓度247.5万细胞每毫升。在建立细胞悬浮液后, 我们将4毫升的细胞悬浮液分配给超低附着悬挂系统的每个井, 如协议步骤4.3 所述。在3天的文化在37°c、5% CO₂和95% 湿气以后, 使用垂悬的下落系统导致了数以百计的跳动的球体的自发形成。球体很容易被观察到在光显微镜下跳动4X 和10X 放大, 平均直径为350µm 后72小时的文化 (图 1)。

在该协议步骤6.5 的末尾, 在收获球体后, 该模具很容易被简单的吹打方法播种。霉菌的培养允许球体的融合;随后去除霉菌导致一个完整的心脏补丁与机械完整性。从霉菌和 24 h 的培养后, 观察到心脏组织的功能性和同步跳动, 确认球体的机械整合 (...

讨论

该方法的意义在于其重现性和结果多层心肌组织的有效性。在心脏组织工程领域, 目前的目标之一是确定一种方法来构建跳动, 多层和功能3维心脏补丁。我们报告了一个有效的和可重复的方法创建多层心脏组织的直接人工播种的球体, 由心肌细胞, 内皮干细胞, 成纤维形成一个新的网霉菌。本方法所用的网模有各种不同的尺寸, 可用于从 2 x 2 x 1 毫米到 6 x 6 x 1 毫米不等的组织的创建。我们所描述的技术也可以根据所需的组织几何对不同的模具形状和系统进行修改。所描述的细胞浓度和比值被优化以前的 hiPSC CMs, 和对不同的细胞类型的修改将需要额外的评估。

利用 bioprinter 技术对3维心脏组织的体外创造进行了探索, 希望能建立治疗和诊断模型。然而, 目前的生物打印方法是繁琐的, 需要大量的时间和使用辅助支撑结构, 如针或脚手架材料。这些辅助结构的存在减少了营养素和氧气的扩散¹⁸。因此, 中央坏死是目前3维心脏结构的主要关注, 由于缺乏毛细血管提供氧气和营养素¹⁹。坂...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人心脏成纤维细胞 （HCF）	Sciencell	6310
FM-2 由基础培养基组成	Sciencell	2331	HCF 培养基
脐静脉内皮细胞 （HUVEC）	Lonza	CC-2935
EGM+子弹套件	Lonza	CC5035	HUVEC 培养基
E8 培养基	Invitrogen	A1517001	HiPSC 培养基
Geltrex	Invitrogen	A1413202
TrypLE Express 酶 （1X）	Thermo Fisher	12604013	胰蛋白酶和细胞解离试剂
RPMI 培养基	Invitrogen	11875093	RPMI 培养基是 hiPSC-CM 培养基
B-27 补充剂 （50x）		含 B-27 补充剂的 Thermo Fisher 17504044 RPMI 培养基是 hiPSC-CM 培养基
台盼蓝溶液，0.4%	Thermo Fisher	15250061
新型网模	TissueByNet Co.，Ltd	NM25-1
悬挂式滴板	Kuraray Co.，Ltd	MPc350
6 孔板	Sigma-Aldrich	CLS-3516