由于脂肪组织含有高含量的脂质，使用传统组织学方法对其进行可视化一直存在挑战。Adipo-Clear 是一种组织透明化技术，可实现对脂肪组织的稳定标记和高分辨率的三维荧光成像。本文中，我们描述了用于成像的样本制备、预处理、染色、透明化和封片等步骤的方法。
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本文内容
摘要
摘要
脂肪组织在能量稳态和体温调节中发挥核心作用，由多种类型的脂肪细胞以及脂肪细胞前体、免疫细胞、成纤维细胞、血管和神经突起共同构成。尽管关于细胞类型分化的分子调控机制及其相互作用的研究日益深入，但要更全面地理解这些驻留于脂肪组织中的细胞，仍需对它们在整个组织中的分布与空间结构进行可视化观察。目前用于分析脂肪组织组织学的免疫组织化学和免疫荧光技术主要依赖于石蜡包埋的薄切片。然而，薄切片仅能捕获组织的一小部分，因此分析结果可能因所选组织区域的不同而产生偏差。为此，我们开发了一种脂肪组织透明化技术——Adipo-Clear，以实现对完整脂肪组织中分子与细胞分布模式的三维全景可视化。Adipo-Clear 技术源自 iDISCO/iDISCO+ 方法，并进行了特定优化，可在充分去除组织内储存脂质的同时，有效保持组织原有的形态结构。结合光片荧光显微镜，本文展示了利用 Adipo-Clear 方法获取高分辨率三维体积图像的应用。 整个脂肪组织
引言
直到最近，脂肪组织一直被认为是一团无定形的脂肪细胞。在过去的几十年中，我们对脂肪组织的认识逐渐深入，现在已认识到脂肪组织是一个复杂的器官，包含不同类型的脂肪细胞，以及脂肪细胞前体、免疫细胞、成纤维细胞、血管系统和神经突起。这些驻留于脂肪组织中的细胞之间的相互作用，对脂肪组织乃至整个机体的生理和病理生理过程具有显著影响1。尽管新兴研究已揭示了某些细胞间相互作用背后的重要分子机制，但要获得更全面的理解，仍需要对整个组织进行可靠的三维（3D）结构解析。
目前对脂肪组织形态学的认识在很大程度上依赖于对薄切片（5 μm）进行相对高倍成像（超过10X）的组织学分析2,3。然而，这种方法存在若干显著局限性。首先，已知在脂肪组织功能中发挥重要作用的复杂丝状结构，如交感神经和血管系统4,5,6,7，难以通过薄切片进行有效评估。其次，由于脂肪组织外形看似无定形，且缺乏可用于聚焦的代表性结构单元，仅依靠切片染色难以全面理解其组织结构。第三，脂肪组织含有极高的脂质成分，这给获取适用于....
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方案
动物护理和实验操作均按照洛克菲勒大学机构动物护理和使用委员会批准的程序进行。
1. 组织制备
- 在4 °C条件下，使用约20 mL的1×磷酸盐缓冲液（PBS）进行标准的心内灌注，直至组织中的血液完全清除。
- 将灌注液更换为约20 mL的固定液（4%多聚甲醛（PFA）溶于1× PBS中），在4 °C条件下继续灌注，直至颈部和尾部明显变硬。
注意：PFA具有毒性，避免接触皮肤、眼睛和黏膜。配制溶液时应在通风橱内操作。 - 小心解剖目标脂肪垫，完整取出脂肪垫并避免损伤。使用钝头镊子以防止夹压或挤压组织。避免毛发污染所解剖的组织。
- 将组织在4% PFA的1× PBS溶液中于4 °C条件下后固定过夜。每个脂肪垫使用约10 mL固定液，置于15 mL锥形管中进行后固定。
- 在室温（RT）下用1× PBS洗涤组织3次，每次1小时。
- 短期保存（不超过2周）可将组织置于4 °C、避光的1× PBS中。如需长期保存（例如，1–2年），应更换为含0.05%叠氮化钠（作为防腐剂）的1× PBS缓冲液。
注意：叠氮化钠经口服或皮肤吸收后具有高毒性。浓度为5%或更高的叠氮化钠溶液应在通风橱内操作。
2. 去脂化与通透化
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结果
采用 Adipo-Clear 方法制备的完整脂肪垫可通过三维成像，以分析在瘦型和肥胖状态下组织形态及细胞间相互作用的变化。该方法可通过采集绿色通道中的组织自发荧光信号，简便地用于分析脂肪组织的一般结构。我们此前已证实，脂肪组织中的自发荧光信号与 perilipin 染色信号高度重叠，而 perilipin 是常用于标记成熟脂肪细胞的标志物12。例如，使用光片显微镜以低倍率（1.3X）扫描后侧皮下脂肪垫（psWAT），可清晰显示脂肪细胞的小叶状结构（图 1A 和 B）。通过更高倍率（4X）对感兴趣区域进行放大，可进一步揭示更详细的信息，例如脂肪细胞的大小（图 1C 和 D）。
Adipo-Clear 技术特别适用于可视化纤.......
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讨论
Adipo-Clear 是一种简单且稳健的脂肪组织透明化方法，可在常规实验室条件下轻松实施。与 iDISCO/iDISCO+10,11,12 等其他基于溶剂的透明化方法相比，Adipo-Clear 特别针对脂肪组织及高脂含量组织的透明化进行了优化。去脂步骤可完全去除脂肪组织中的脂质，从而实现整个组织的免疫标记，并显著减少光散射，使得在不损失 XY 分辨率的情况下完成全程成像成为可能。除了可快速扫描大体积组织的光片荧光显微镜外，共聚焦显微镜和双光子显微镜也可用于获取更高分辨率和更丰富的细节。
基于甲醇/二氯甲烷（DCM）的脱脂是关键步骤。脱脂不充分可能导致图像模糊，尤其是组织核心区域。应通过观察脂肪样本是否沉入DCM中来确保脂质完全去除。含有多种组织类型的样本（例如，附着附睾和睾丸的附睾脂肪）即使延长DCM孵育时间也可能无法完全下沉。然而，将这些样本在DCM中孵育过夜通常可实现完全.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢洛克菲勒大学生物成像资源中心的Christina Pyrgaki、Tao Tong和Alison North提供的协助与支持。我们还感谢Xiphias Ge Zhu在视频剪辑方面的帮助。本工作由人类前沿科学计划组织（PC）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1× 磷酸盐缓冲液 | Corning | 21-040-CV | |
| 多聚甲醛 | Sigma Aldrich | P6148-1KG | |
| 甲醇 | Fisher Scientific | A412SK-4 | |
| 吐温 X-100 | Sigma Aldrich | X100-500ML | |
| 吐温 20 | Sigma Aldrich | P2287-500ML | |
| 肝素 | Sigma Aldrich | H3393-100KU | |
| 二氯甲烷 | Sigma Aldrich | 270991 | |
| 30% 过氧化氢 | Fisher Scientific | 325-100 | |
| 苯甲醚 | Sigma Aldrich | 108014 | |
| 琼脂糖 | Invitrogen | 16500500 | |
| 叠氮化钠 | Sigma Aldrich | 71289-5G | |
| 甘氨酸 | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| 兔多克隆抗酪氨酸羟化酶抗体 | Millipore | AB152 | 1:200 稀释 |
| 山羊多克隆抗 CD31/PECAM-1 抗体 | R&D Systems | AF3628 | 终浓度为 2 µg/mL |
| 大鼠单克隆抗 CD68 抗体，克隆 FA-11 | Bio-Rad | MCA1957 | 终浓度为 2 µg/mL |
| 驴抗兔 IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | 终浓度为 5–10 µg/mL |
| 驴抗山羊 IgG (H+L) Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | 终浓度为 5–10 µg/mL |
| 驴抗大鼠 IgG (H+L) Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | 终浓度为 5–10 µg/mL |
| 成像腔室 | ibidi | 80287 | |
| 光片显微镜 | LaVision BioTec | Ultramicroscope II | |
| 成像软件 | LaVision BioTec | Imspector software | |
| 显微成像可视化软件 | Bitplane | Imaris |
参考文献
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What We Talk About When We Talk About Fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown ....
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重印与许可
