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方法文章

Adipo-Clear：一种用于脂肪组织三维成像的组织透明化方法

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DOI：

10.3791/58271

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2018年7月28日

 ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Metabolism, The Rockefeller University, 2Laboratory of Brain Development and Repair, The Rockefeller University, 3Laboratory of Molecular Genetics, The Rockefeller University

本文内容

摘要

由于脂肪组织含有高含量的脂质，使用传统组织学方法对其进行可视化一直存在挑战。Adipo-Clear 是一种组织透明化技术，可实现对脂肪组织的稳定标记和高分辨率的三维荧光成像。本文中，我们描述了用于成像的样本制备、预处理、染色、透明化和封片等步骤的方法。

摘要

脂肪组织在能量稳态和体温调节中发挥核心作用，由多种类型的脂肪细胞以及脂肪细胞前体、免疫细胞、成纤维细胞、血管和神经突起共同构成。尽管关于细胞类型分化的分子调控机制及其相互作用的研究日益深入，但要更全面地理解这些驻留于脂肪组织中的细胞，仍需对它们在整个组织中的分布与空间结构进行可视化观察。目前用于分析脂肪组织组织学的免疫组织化学和免疫荧光技术主要依赖于石蜡包埋的薄切片。然而，薄切片仅能捕获组织的一小部分，因此分析结果可能因所选组织区域的不同而产生偏差。为此，我们开发了一种脂肪组织透明化技术——Adipo-Clear，以实现对完整脂肪组织中分子与细胞分布模式的三维全景可视化。Adipo-Clear 技术源自 iDISCO/iDISCO+ 方法，并进行了特定优化，可在充分去除组织内储存脂质的同时，有效保持组织原有的形态结构。结合光片荧光显微镜，本文展示了利用 Adipo-Clear 方法获取高分辨率三维体积图像的应用。 整个脂肪组织

引言

直到最近，脂肪组织一直被认为是一团无定形的脂肪细胞。在过去的几十年中，我们对脂肪组织的认识逐渐深入，现在已认识到脂肪组织是一个复杂的器官，包含不同类型的脂肪细胞，以及脂肪细胞前体、免疫细胞、成纤维细胞、血管系统和神经突起。这些驻留于脂肪组织中的细胞之间的相互作用，对脂肪组织乃至整个机体的生理和病理生理过程具有显著影响1。尽管新兴研究已揭示了某些细胞间相互作用背后的重要分子机制，但要获得更全面的理解，仍需要对整个组织进行可靠的三维（3D）结构解析。

目前对脂肪组织形态学的认识在很大程度上依赖于对薄切片（5 μm）进行相对高倍成像（超过10X）的组织学分析2,3。然而，这种方法存在若干显著局限性。首先，已知在脂肪组织功能中发挥重要作用的复杂丝状结构，如交感神经和血管系统4,5,6,7，难以通过薄切片进行有效评估。其次，由于脂肪组织外形看似无定形，且缺乏可用于聚焦的代表性结构单元，仅依靠切片染色难以全面理解其组织结构。第三，脂肪组织含有极高的脂质成分，这给获取适用于三维解剖重建的连续切片带来了挑战；而三维解剖重建是研究全脑形态的常规方法8。鉴于上述因素，迫切需要一种整体染色方法，能够在实现细胞分辨率的同时，对整个脂肪组织库进行三维可视化观察。

对整个器官进行三维体积成像由于光散射的遮蔽效应而具有挑战性。生物组织中光散射的主要来源之一是脂质-水界面。尽管通过去除脂质来消除散射的努力已持续了一个多世纪，但近年来出现了大量创新9。其中一种新近开发的组织透明化方法是溶剂清除器官的免疫标记辅助三维成像（iDISCO/iDISCO+）10,11。然而，脂肪组织因其富含脂质而构成特殊挑战，因此需要对iDISCO/iDISCO+方案进行额外修改，以在防止组织塌陷的同时充分提取脂质。我们开发的这一改进方案现称为Adipo-Clear，采用基于甲醇/二氯甲烷的脂肪组织去脂化方法，实现适合高分辨率体积成像的最佳透明度12。由于去脂步骤会显著淬灭内源性表达的荧光蛋白（如GFP和RFP），此类蛋白的可视化必须通过免疫标记来实现。总体而言，这一简单且稳健的方案可用于研究脂肪组织中定居细胞的组织水平结构、脂肪细胞前体细胞的谱系示踪以及发育过程中的脂肪组织形态发生。

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方案

动物护理和实验操作均按照洛克菲勒大学机构动物护理和使用委员会批准的程序进行。

1. 组织制备

  1. 在4 °C条件下，使用约20 mL的1×磷酸盐缓冲液（PBS）进行标准的心内灌注，直至组织中的血液完全清除。
  2. 将灌注液更换为约20 mL的固定液（4%多聚甲醛（PFA）溶于1× PBS中），在4 °C条件下继续灌注，直至颈部和尾部明显变硬。
    注意：PFA具有毒性，避免接触皮肤、眼睛和黏膜。配制溶液时应在通风橱内操作。
  3. 小心解剖目标脂肪垫，完整取出脂肪垫并避免损伤。使用钝头镊子以防止夹压或挤压组织。避免毛发污染所解剖的组织。
  4. 将组织在4% PFA的1× PBS溶液中于4 °C条件下后固定过夜。每个脂肪垫使用约10 mL固定液，置于15 mL锥形管中进行后固定。
  5. 在室温（RT）下用1× PBS洗涤组织3次，每次1小时。
  6. 短期保存（不超过2周）可将组织置于4 °C、避光的1× PBS中。如需长期保存（例如，1–2年），应更换为含0.05%叠氮化钠（作为防腐剂）的1× PBS缓冲液。
    注意：叠氮化钠经口服或皮肤吸收后具有高毒性。浓度为5%或更高的叠氮化钠溶液应在通风橱内操作。

2. 去脂化与通透化

时间：1-2 天

  1. 使用B1n缓冲液配制20%、40%、60%和80%的甲醇梯度表1)（体积比）， 例如，对于20%甲醇/B1n缓冲液，将20 mL甲醇与80 mL B1n缓冲液混合。所有缓冲液均储存于4 °C。由于达到饱和，60%和80%甲醇/B1n缓冲液中会析出甘氨酸晶体。请勿去除晶体；后续洗涤步骤使用上清液即可。
    警告：甲醇具有挥发性、刺激性，且易燃。避免接触皮肤或眼睛。
  2. 在解剖显微镜下轻轻去除样品上的毛发。附着在样品上的任何毛发、绒毛或碎屑都将在成像过程中产生阴影。将清洁后的样品转移至新管中。
  3. 所有后续步骤均需在冰上或4 °C下进行，除非另有说明。对于小样本（例如，取自年轻瘦小鼠的后部皮下/近睾脂肪垫），使用含1.6 mL溶液的2 mL微量离心管。对于较大的样本或高脂含量样本（例如，肥胖小鼠的脂肪垫），使用5 mL离心管并加入4 mL溶液。
    1. 将装有样品的试管水平放置于转速设为约 100 rpm 的旋转摇床中，确保样品在试管内可自由移动。
  4. 在20%、40%、60%、80%和100%的甲醇/B1n缓冲液中依次进行梯度脱水，每个浓度处理指定时间（表2尽量减少溶液的残留转移。
  5. 用100%二氯甲烷（DCM）对样品进行脱脂处理（3次），每次脱脂的孵育时间按所示时间进行 表2样品应在第二次和第三次二氯甲烷洗涤结束时沉降至管底。若未沉降，应延长孵育时间以确保完全脱脂（例如，从30分钟延长至1-2小时。
    警告：二氯甲烷（DCM）应在通风橱内操作。储存时使用玻璃容器，孵育时使用聚丙烯材质的微量离心管。微量离心管不可用于DCM的长期储存。聚苯乙烯材质的培养皿和血清移液管与DCM不相容。DCM具有高度挥发性。转移样品时应迅速加入新鲜溶液，以防止干燥。
  6. 用100%甲醇洗涤两次，每次洗涤时间为指定时间（表2).
  7. 可选：如果样本灌注不佳，残留红细胞中的血红蛋白可能会产生强烈的自发荧光。用5% H2O2 在甲醇中（1体积的30% H2O2 在4 °C下用5倍体积的甲醇处理过夜。
  8. 在反向甲醇/B1n缓冲液系列中重悬样本：80%、60%、40%、20%甲醇/B1n，以及100% B1n缓冲液（两次），每步处理指定时间表2).
  9. 用 PTxwH 缓冲液洗涤样品（表1室温下孵育 2 小时。
  10. 将去脂质样品保存在PTxwH缓冲液中，4°C条件下（最长1年），或立即进行免疫染色步骤。

3. 全胚胎免疫染色

时间：8–10 天

注意：以下所有步骤均应在室温下进行，除非另有说明，操作过程中需振荡并避光。对于小样本，使用含有1.6 mL溶液的2 mL微量离心管；对于大样本，使用含有4 mL溶液的5 mL离心管。建议首先在组织的小块样本或经甲醇处理的组织切片上验证抗体的有效性。

  1. 将一抗用 PTxwH 缓冲液稀释至推荐浓度。将稀释后的抗体溶液在约 20,000 × g 条件下离心 10 分钟，以防止引入抗体沉淀或聚集体。
  2. 用一抗溶液孵育去脂样品，孵育时间见 表 2 中的说明。
  3. 使用 PTxwH 缓冲液通过一系列孵育步骤洗涤样品：5 分钟、10 分钟、15 分钟、20 分钟、1 小时、2 小时、4 小时和过夜。
  4. 将二抗用 PTxwH 缓冲液稀释至推荐浓度。将稀释后的抗体溶液在约 20,000 × g 条件下离心 10 分钟，以防止引入抗体沉淀或聚集体。
    注意：为避免组织自发荧光导致的高背景信号，建议使用偶联有在红光和远红光区域发射荧光的荧光染料的二抗。根据显微镜可用的激光谱线数量，可在同一样品中同时成像最多 3–4 个标记物。
  5. 用二抗溶液孵育样品，孵育时间见 表 2 中的说明。
  6. 使用 PTxwH 缓冲液通过一系列孵育步骤洗涤样品：5 分钟、10 分钟、15 分钟、20 分钟、1 小时、2 小时、4 小时和过夜。
  7. 可选：对于较脆弱的组织类型，可在 4 °C 条件下用含 4% 多聚甲醛（PFA）的 1× PBS 缓冲液固定染色后的组织过夜，以帮助维持组织形态。
    注意：此步骤可能会增加成像背景。脂肪组织无需执行此步骤。
  8. 使用 1× PBS 缓冲液通过一系列孵育步骤洗涤样品：5 分钟、10 分钟和 30 分钟。
  9. 在解剖显微镜下轻轻去除样品表面的绒毛。

4. 组织透明化

时间：1-2 天

  1. 可选：将样品包埋在琼脂糖中，以方便光片显微镜的样品安装。
    注意：强烈建议对脂肪组织进行此步骤，以在成像过程中稳定其形态。
    1. 用1%琼脂糖（w/v）溶于1×磷酸盐缓冲液（PBS）中制备包埋液。将包埋液冷却至约40 °C，以避免样品暴露于过高温度。
    2. 将清洗后的样品放入模具中（例如，培养皿或称量舟）中，并将其置于所需位置。避免液体残留。轻轻将包埋液倒入样本上，避免产生气泡。
    3. 让琼脂糖在室温下完全凝固。切下含有样品的凝胶块。
      注意：所有步骤（包括过夜孵育）均应在室温下进行，并避光、振荡操作。对于小样本，使用含1.6 mL溶液的2 mL微量离心管；对于大样本，使用含4 mL溶液的5 mL离心管。
  2. 使用甲醇梯度对样品进行脱水处理2O：25%、50%、75% 和 100%（3 次），作用指定时间（表2).
    注意：样本可在100%甲醇步骤中放置过夜。
  3. 将样品在100% DCM中振荡孵育1小时（重复3次）。每次DCM洗涤结束后，样品应沉降至管底。若未沉降，可延长孵育时间以确保甲醇完全去除。样品可在100% DCM步骤中过夜放置。
  4. 在二苄基醚（DBE）中孵育样品，温和振荡过夜，以实现折射率匹配。
    注意：样品最终将在可见光下变为透明。
    警告：DBE 具有危害性。避免与皮肤接触。务必在通风橱内操作，并佩戴双层手套。一旦手套被 DBE 污染，应立即丢弃。储存时使用玻璃容器，孵育时使用微量离心管（聚丙烯材质）。微量离心管不可用于 DBE 的长期储存。由聚苯乙烯制成的培养皿和血清移液管与 DBE 不相容。如有泄漏，须用 100% 乙醇清理。
  5. 将样品与新鲜的DBE在轻微振荡下孵育2小时。将样品置于室温避光处保存，或直接进行成像。
    注意：建议在一个月内对样品进行成像。尽管某些荧光染料比其他染料更稳定，但不建议在此阶段长期保存样品。

5. 显微镜观察

  1. 使用与DBE兼容的光片显微镜进行成像。
    注意：只有经批准可用于有机溶剂成像且折射率与DBE匹配的物镜，才能在DBE浸没式成像中用作浸液物镜。
    1. 将琼脂糖包埋的样本固定在可防止成像过程中移动的样品台上。将样本浸入盛有DBE的成像 chamber 中。
    2. 采集覆盖整个样本的z轴层扫图像（例如，1-2倍放大倍数）以获取目标标记物在整个组织中的分布/结构。
    3. 切换至更高放大倍数的物镜（例如，4-12倍放大倍率）以放大感兴趣区域，从而成像精细结构。
      注：胶原蛋白是脂肪组织细胞外基质的主要成分，该基质包围着所有脂肪细胞13胶原蛋白具有典型的发射光谱，范围约为400 nm至550 nm14使用488激光线（绿色）对样品进行成像，并收集位于胶原蛋白发射光谱范围内的波长区间的发射光例如，525–550 nm）将提供组织自发荧光信号，该信号此前已被证明可用于界定脂肪细胞轮廓及整体组织结构12.
  2. 使用倒置共聚焦显微镜或双光子显微镜进行成像。
    1. 将琼脂糖包埋的样本放入带有玻璃底的腔室载玻片中，避免接触任何塑料部件（或其他可密封的DBE兼容成像腔室）。确保DBE不泄漏。
    2. 选择工作距离较长的物镜以实现更深的穿透。
      注意：应使用倒置共聚焦显微镜或双光子显微镜，通过培养皿载玻片的玻璃底部进行成像。避免样品与浸没式物镜直接接触，此类物镜不适用于基于DBE的成像。

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结果

采用 Adipo-Clear 方法制备的完整脂肪垫可通过三维成像，以分析在瘦型和肥胖状态下组织形态及细胞间相互作用的变化。该方法可通过采集绿色通道中的组织自发荧光信号，简便地用于分析脂肪组织的一般结构。我们此前已证实，脂肪组织中的自发荧光信号与 perilipin 染色信号高度重叠，而 perilipin 是常用于标记成熟脂肪细胞的标志物12。例如，使用光片显微镜以低倍率（1.3X）扫描后侧皮下脂肪垫（psWAT），可清晰显示脂肪细胞的小叶状结构（图 1A 和 B）。通过更高倍率（4X）对感兴趣区域进行放大，可进一步揭示更详细的信息，例如脂肪细胞的大小（图 1C 和 D）。

Adipo-Clear 技术特别适用于可视化纤...

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讨论

Adipo-Clear 是一种简单且稳健的脂肪组织透明化方法，可在常规实验室条件下轻松实施。与 iDISCO/iDISCO+10,11,12 等其他基于溶剂的透明化方法相比，Adipo-Clear 特别针对脂肪组织及高脂含量组织的透明化进行了优化。去脂步骤可完全去除脂肪组织中的脂质，从而实现整个组织的免疫标记，并显著减少光散射，使得在不损失 XY 分辨率的情况下完成全程成像成为可能。除了可快速扫描大体积组织的光片荧光显微镜外，共聚焦显微镜和双光子显微镜也可用于获取更高分辨率和更丰富的细节。

基于甲醇/二氯甲烷（DCM）的脱脂是关键步骤。脱脂不充分可能导致图像模糊，尤其是组织核心区域。应通过观察脂肪样本是否沉入DCM中来确保脂质完全去除。含有多种组织类型的样本（例如，附着附睾和睾丸的附睾脂肪）即使延长DCM孵育时间也可能无法完全下沉。然而，将这些样本在DCM中孵育过夜通常可实现完全...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢洛克菲勒大学生物成像资源中心的Christina Pyrgaki、Tao Tong和Alison North提供的协助与支持。我们还感谢Xiphias Ge Zhu在视频剪辑方面的帮助。本工作由人类前沿科学计划组织（PC）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1× 磷酸盐缓冲液Corning21-040-CV
多聚甲醛Sigma AldrichP6148-1KG
甲醇Fisher ScientificA412SK-4
吐温 X-100Sigma AldrichX100-500ML
吐温 20Sigma AldrichP2287-500ML
肝素Sigma AldrichH3393-100KU
二氯甲烷Sigma Aldrich270991
30% 过氧化氢Fisher Scientific325-100
苯甲醚Sigma Aldrich108014
琼脂糖Invitrogen16500500
叠氮化钠Sigma Aldrich71289-5G
甘氨酸Fisher ScientificBP381-1
兔多克隆抗酪氨酸羟化酶抗体MilliporeAB1521:200 稀释
山羊多克隆抗 CD31/PECAM-1 抗体R&D SystemsAF3628终浓度为 2 µg/mL
大鼠单克隆抗 CD68 抗体，克隆 FA-11Bio-RadMCA1957终浓度为 2 µg/mL
驴抗兔 IgG (H+L) Alexa Fluor 647Jackson ImmunoResearch711-605-152终浓度为 5–10 µg/mL
驴抗山羊 IgG (H+L) Alexa Fluor 568InvitrogenA11077终浓度为 5–10 µg/mL
驴抗大鼠 IgG (H+L) Alexa Fluor 647Jackson ImmunoResearch712-605-153终浓度为 5–10 µg/mL
成像腔室ibidi80287
光片显微镜LaVision BioTecUltramicroscope II
成像软件LaVision BioTecImspector software
显微成像可视化软件BitplaneImaris

参考文献

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