评估逍遥散对慢性应激小鼠的抗抑郁作用

摘要

本文介绍了一种建立小鼠抑郁模型的方法，用于观察慢性不可预知性轻度应激（CUMS）相关的行为学变化，并评价逍遥散的抗抑郁作用。

摘要

除了标准化使用抗抑郁药物和心理治疗外，中药的应用也使重度抑郁障碍（MDD）患者的总体症状得到改善。因此，本研究旨在建立小鼠抑郁模型，观察慢性不可预知性轻度应激（CUMS）相关的行为变化，并进一步评价逍遥散的抗抑郁作用。将小鼠随机分为四组：对照组、模型组、逍遥散治疗组和氟西汀治疗组。所有小鼠均单独饲养，通过接受为期21天的多种CUMS干预处理以诱导抑郁样状态，具体操作如实验方案所述。对照组和模型组小鼠每日给予0.5 mL蒸馏水，治疗组小鼠则分别给予逍遥散（0.25 g/kg/天）或氟西汀（2.6 mg/kg/天）。研究中所用药物均在三周内每日经口灌胃给药。为评估抑郁样行为，记录了一系列参数，包括毛发状态、体重、敞箱实验评分和蔗糖偏好实验评分。数据分析显示，与对照组小鼠相比，模型组小鼠的行为发生显著改变，而逍遥散和氟西汀治疗可明显改善这些异常行为。本研究结果表明，逍遥散对CUMS诱导的小鼠抑郁样行为具有抗抑郁作用，提示逍遥散处方中的成分因其对抑郁样行为的有益效应，可能值得进一步开发用于抑郁症的治疗。

引言

重度抑郁障碍（MDD）是一种慢性、高度复发性的精神疾病，临床表现为持续情绪低落、抑郁、自卑、精神运动性迟滞、兴趣丧失、睡眠障碍以及严重的悲观情绪或自杀倾向；该病对人类健康和社会稳定造成了严重危害¹。根据世界卫生组织的报告，MDD已成为全球主要的致残原因之一，并可能在2030年成为疾病负担的主要原因^2,3。目前，抗抑郁药物治疗和心理治疗被认为是治疗MDD的首选方法。然而，大量被诊断为MDD的患者对持续的药物治疗或心理干预无反应，这类患者被归类为难治性抑郁⁴。

逍遥散是一种经典的中药复方⁵，自中国宋代以来已广泛用于治疗心理疾病达数千年之久⁶。它由8味中药组成：Radix Bupleuri、Radix Paeoniae Alba、Radix Angelicae Sinensis、Poria、Rhizoma Atractylodis Macrocephalae、Radix Glycyrrhizae、Rhizoma Zingiberis Recens 和 Herba Menthae。逍遥散含有多种成分，作用于多个靶点，并通过多条通路发挥作用⁷。研究表明，逍遥散是一种安全有效的方剂，常用于治疗多种与精神障碍相关的疾病，现代研究也重点关注了该复方的抗抑郁机制^8,9,10。尽管目前关于重度抑郁症（MDD）的发病机制尚不明确，但已提出多种假说，包括单胺假说、神经递质受体假说、神经内分泌功能改变假说、免疫系统异常假说等etc。多项研究显示，逍遥散的抗抑郁作用与上述假说中的物质基础相关^11,12，其治疗效应表现为改善类抑郁行为¹³。

此外，随着抑郁症的普遍流行，现代社会面临着劳动力减少、提前退休以及高昂治疗费用等问题¹⁴。昂贵的治疗需要严格的医疗监护，这意味着医疗成本大幅增加，同时还需要精准预测不良反应和副作用¹⁵。中药逍遥散成分易得，具有独特疗效且副作用轻微，其应用有助于减轻现代医学治疗的负担。因此，为了为逍遥散的应用提供更充分的理论依据，应提供一种替代性临床疗法，用于治疗发病率逐年上升的抑郁症，同时促进人类健康。本文描述了一项通过建立小鼠抑郁模型，利用逍遥散预防抑郁样行为的实验方案。采用敞箱实验和蔗糖偏好实验验证逍遥散的抗抑郁作用。

方案

本方案经北京中医药大学动物伦理委员会批准，符合中国《实验动物护理与使用指南》的所有规定。 实验过程中未发生意外死亡情况，本研究中也无需对任何动物实施安乐死。

1. 准备实验用药物

注意：中药材由北京中医药大学刘B博士购买并鉴定。逍遥散包含以下八味传统中药，配比为6:6:6:6:3:6:2:2：当归、白芍、茯苓、柴胡、甘草、白术、薄荷和生姜。

1. 按先前所述方法制备逍遥散¹⁶。
   注意：我们在中日友好医院中药制剂室提取了这些化合物，提取率为18.8%。
2. 采用高效液相色谱-质谱联用分析法（LC-MS/MS）验证逍遥散的质量¹⁷。

2. 实验操作前小鼠的准备

注意：实验方案中选用60只12周龄的健康雄性C57BL/6J小鼠，每只小鼠体重在18至22 g之间。

1. 在进行CUMS实验前，将小鼠单独饲养于典型的无特定病原体（SPF）级实验动物房中（22 ± 1 °C，12 h/12 h明暗循环，相对湿度：30–40%），适应环境一周。
2. 根据小鼠体重，将其随机分为对照组、模型组、逍遥散治疗组和氟西汀治疗组，每组15只小鼠。
3. 实验开始前，使用记号笔在每只小鼠尾部编号标记。
4. 对所有小鼠进行为期五天的蔗糖偏好实验（参见步骤5）和旷场实验（参见步骤6）。

3. 小鼠抑郁模型的诱导

注意：为诱导抑郁，模型组及两个治疗组的小鼠接受为期21天的CUMS处理¹⁸。方案可根据实际情况调整，但应遵循同一应激源不可连续使用的原则。

1. 连续21天每天使小鼠暴露于以下七种应激源中的任意两种¹⁹。我们的造模方案设计如下：
   1. 周一，使小鼠经历食物剥夺（清空每笼饲料，持续24小时，上午8:00至次日上午8:00）和饮水剥夺（移除每笼饮水瓶，持续24小时，上午8:00至次日上午8:00）。
   2. 周二，使小鼠经历束缚应激（将小鼠置于小型塑料容器中束缚3小时，上午8:00至11:00）和空笼应激（移除每笼垫料，持续11小时，上午8:00至晚上19:00）。
   3. 周三，使小鼠经历潮湿污染笼具（向每笼中倒入水并保持湿润24小时，上午8:00至次日上午8:00）和拥挤笼具（每笼放入5只小鼠，持续24小时，上午8:00至次日上午8:00）。
   4. 周四，使小鼠经历束缚应激和冰水游泳^20,21（强迫每只小鼠在装有冰水的透明玻璃水族箱中游泳5分钟）。
   5. 周五，使小鼠经历潮湿污染笼具和食物剥夺。
   6. 周六，使小鼠经历束缚应激和拥挤笼具。
   7. 周日，使小鼠经历空笼应激和冰水游泳。
2. 每周记录小鼠的被毛状态和体重，直至造模结束（第21天）。计算被毛状态总分，该分数为七个不同身体部位评分之和：头部、颈部、背部被毛、腹部被毛、前爪、尾部和后爪。评分为1表示被毛整洁，评分为0表示被毛凌乱²²。
3. 实验结束时进行为期五天的蔗糖偏好测试（参见步骤5）和旷场实验（参见步骤6）。

4. 逍遥散的给药

注意：逍遥散的剂量（0.25 g/kg/天）是根据其先前报道中表现出的良好疗效而选定的⁹。

1. 实验过程中，使用蒸馏水配制逍遥散和氟西汀混悬液，并确保立即使用。
2. 造模前每天给予对照组和模型组小鼠蒸馏水 0.5 mL，通过灌胃给药。同时，给予两个治疗组小鼠逍遥散（0.25 g/kg/天）或氟西汀（2.6 mg/kg/天）。

5. 蔗糖偏好实验

注意：测试前未进行任何水或食物剥夺。该方案按照先前报道的方法进行²³。

1. 前两天，将小鼠单独饲养，每只小鼠提供两个装有自来水的水瓶。
2. 接下来两天，给每只小鼠提供两个装有1%蔗糖溶液的水瓶。
3. 最后一天，给每只小鼠提供两个水瓶，持续24小时，其中一个装有自来水，另一个装有1%蔗糖溶液。为消除小鼠饮水行为中的位置偏好，在12小时后交换两个水瓶的位置。
4. 记录消耗的蔗糖溶液和自来水的体积（mL），并按以下公式计算蔗糖偏好率：蔗糖偏好率（%）= 蔗糖溶液消耗量 / 总液体消耗量 × 100%。

6. 开放旷场实验

1. 在光线较暗且安静的房间内进行旷场实验，使用一个四边黑色无光泽的木制箱子。用蓝色线条将箱底均分为25个相等的方格。
2. 每只小鼠进入前，用5%酒精清洁旷场箱。然后，将小鼠轻柔地放置于旷场中央。
3. 在旷场正上方约200 cm处悬挂一台高清数码摄像机，记录每只小鼠5分钟内的行为活动。
4. 使用视频追踪系统软件分析小鼠行为录像，记录总移动距离和进入中心区域的次数。
5. 使用统计学软件分析总移动距离和进入中心区域次数的数据。

结果

请注意，该结果此前已由丁秀芳博士发表。 等¹⁸

数据以均值表示 ± 均值标准误（SEM）。根据正态性检验和方差齐性检验结果，对一般数据采用单因素方差分析（ANOVA）或非参数检验。组间比较采用LSD检验。此外，对于重复测量数据（被毛评分和体重），采用一般线性模型（GLM）的重复测量过程进行单因素方差分析，并采用多变量方差分析方法对各时间点的组间差异进行比较（LSD法）。

CUMS诱导小鼠的生理状态

在采用慢性不可预知性轻度应激（CUMS）方法诱导小鼠抑郁模型三周后，模型组小鼠毛发状态出现逐渐加重的营养不良表现；在应激两周时尚未出现明显变化，但在...

讨论

本研究中使用的CUMS模型是建立抑郁症应激易感性模型的常用方法²⁴。CUMS的大多数表现可通过抗抑郁药物恢复，表明该模型具有较强的预测效度²⁵。通过该方法，动物接受慢性不可预测的应激刺激后，会出现重度抑郁症的核心症状，包括位置偏爱条件反射降低、快感缺失以及情绪样行为受损²⁶。本实验方案结果显示，持续给予逍遥散或氟西汀可改善CUMS诱导模型小鼠的抑郁样行为；其中氟西汀作为阳性对照药物，用于验证逍遥散的干预效果。

与旷场实验、强迫游泳实验或新奇抑制摄食实验不同，毛发评分并非与人类抑郁症相关的指标，但却是目前用于小鼠抑郁模型最普遍、最可靠且经过充分验证的方法²⁷。在本研究中，模型组小鼠的毛发状态逐渐出现营养不良性改变，这种变化在应激两周后尚未显现，但在慢性不可预知性温和应激（CUMS）程序结束时（三周）明显加重；而在应激暴露一周后，各组间体重差异尚不显著。然而，在造模两周后，各组间的体重差异开始显现...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
中药	Tongrentang (亳州，安徽) 饮片有限公司	-	药物由中日友好医院中药制剂室提取，使用蒸馏水配制逍遥散混悬液，剂量为 0.25 g/kg/d。
氟西汀	PATHEON FRANCE	5545A	使用蒸馏水配制氟西汀混悬液，剂量为 2.6 mg/kg/d。
C57BL/6j 小鼠	北京维通利华实验动物技术有限公司（查尔斯河公司）	SCXK 2011-0004	购自北京维通利华实验动物技术有限公司（查尔斯河公司）的 60 只健康雄性 12 周龄 C57BL/6J 小鼠。
小鼠笼具	斯泰林生物科技	34853016	318×202×135 mm
蒸馏水	-	-	实验全程使用该蒸馏水。
蔗糖	Sigma	-	用于糖水偏好实验中配制 1% 蔗糖溶液。
ACS-2EAS 电子天平	北京恒中衡电子科技有限公司	-	用于称量小鼠在不同阶段的体重。
木质黑色无光泽箱	-	-	（40 cm × 40 cm × 15 cm），由蓝色线条划分为 25 个相等的方格。
WV-CP470 摄像机	Panasonic，日本	-	高清数码摄像机，用于记录旷场实验的全过程。
EthoVision 3.0 软件	Noldus，瓦赫宁根，荷兰	-	视频追踪系统，用于评估小鼠的运动功能和情绪行为。
SPSS Statistics 21.0 软件	IBM	-	采用 SPSS 21.0 软件进行数据分析，根据正态性检验和方差齐性检验结果，对一般数据采用单因素方差分析或非参数检验，组间比较采用 LSD 法。
Graphpad Prism 6.0 软件	Graphpad Software, Inc.，美国	-	使用 Graphpad Prism 6.0 软件绘制统计图表。