本文介绍了一种弹性染色方案，用于在福尔马林固定、石蜡包埋的pT3N0M0胃癌组织切片中识别弹性纤维。随后，我们描述了一种判断肿瘤细胞是否侵犯弹性膜以外区域的方法。
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本文内容
摘要
摘要
弹性膜通常位于腹膜间皮细胞下方的间皮下层，在苏木精-伊红（H&E）染色中呈两亲性，但可通过弹性纤维染色清晰显示。弹性染色的一个重要优势在于，它有助于判断肿瘤细胞是否已侵入弹性膜以外区域，从而评估胃肠道癌中腹膜表面侵犯的范围，区分pT3与pT4分期。本研究提供了一种用于鉴定福尔马林固定、石蜡包埋的pT3N0M0胃癌组织切片中弹性纤维的实验方案。我们制备了厚度为5-µm的石蜡切片并固定于载玻片上，随后在染色过程中对所有切片进行脱蜡和水化处理。接着，所有组织切片依次经高锰酸钾氧化、草酸漂白、弹性纤维染色，最后用范吉森（Van Gieson's）进行复染。最终观察染色效果：弹性膜呈蓝黑色，胶原纤维呈红色，而癌细胞则呈现不同程度的黄色。本文还详细描述了用于确定癌细胞与弹性膜之间位置关系的分析方法。该方法操作简便、成本低廉，且由于对弹性纤维具有优异的选择性和可靠的染色结果，可广泛应用于胃肠道癌腹膜表面浸润的识别与判断。
引言
根据肿瘤、淋巴结及转移（TNM）癌症分期系统，胃癌在病理分期 pT4 期的预后显著差于 pT3 期（第8版 UICC/AJCC）1。对于胃癌，原发肿瘤（pT）的分类通常取决于肿瘤浸润的深度2。病理分期 pT3 胃癌定义为肿瘤穿透肌层侵入浆膜下组织，而 pT4 胃癌则定义为肿瘤穿透至脏层腹膜表面。是否存在腹膜表面浸润是区分这两个分期的关键2。然而，由于腹膜间皮细胞层非常薄，在手术、术后处理及固定过程中可能受到损伤3。此外，肿瘤相关的炎性改变和纤维化可破坏腹膜的正常解剖结构，使得仅依靠苏木精-伊红（H&E）染色难以准确判断腹膜表面的浸润情况4。目前的辅助诊断方法，如细胞学检查和免疫组织化学染色，其诊断价值有限5,6，因其存在假阳性结果或成本效益较低的问题。
浆膜包括腹膜、胸膜和心包膜，由间皮、基底膜和间皮下层组成7。浆膜的一个共同组织学特征是在间皮细胞邻近的间皮下层中存在弹性膜8,
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方案
1994年至2005年期间，中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院的两位经验丰富的胃肠道病理学家从接受胃部肿瘤切除术的患者中选取了病例样本，这些患者术后病理诊断为pT3N0M0期胃癌（依据第七版TNM分期标准）。本研究已获得伦理审查委员会批准。
1. 切片
- 将石蜡包埋块放入滑动式切片机的固定夹持器中，使其能够相对于刀片前后移动。调整包埋块与切片刀之间的最佳角度。
注意：最佳角度不仅取决于刀片的几何形状，还与切片速度和技术有关。 - 根据需要修整石蜡包埋块，并切成5 µm厚的横切片。
- 将5 µm厚的石蜡切片置于约40–45 °C的水浴中，随后从水中将切片转移至载玻片上，每张载玻片放置一个切片。
- 小心地将贴附好的切片轻压在纸巾上，以去除残留水分和可能存在的气泡。
- 让切片在空气中干燥30分钟，然后在45–50 °C的烘箱中烘烤2小时。
2. 所有切片的脱蜡和复水
- 将载玻片浸入盛有二甲苯的考普林瓶中，持续 10 分钟。
- 从第一个二甲苯瓶中取出载玻片，再浸入另一个考普林瓶中的二甲苯中，持续 10 分钟。
- 接着将载玻片浸入盛有 100% 乙醇的考普林瓶中，持续 5 分钟。
- 将载玻片浸入另一个盛有 100% 乙醇的考普林瓶中，同样持续....
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结果
成功的弹性纤维染色可清晰显示pT3期胃癌中的弹性膜和癌细胞。图1 为低倍镜视野，在使用弹性蛋白溶液染色后、按所述方案进行Van Gieson复染前的显微镜观察结果，显示弹性膜紧邻浆膜间皮细胞，呈丝状蓝黑色染色，而肿瘤细胞与弹性膜之间仍存在一定距离。图2 为采用Van Gieson复染的典型弹性纤维染色结果，其中弹性膜染成蓝黑色，胶原纤维染成红色，肌纤维和癌细胞染成黄色。弹性膜浸润定义为癌细胞穿透弹性膜（图2B），而弹性膜未浸润则定义为癌细胞接近弹性膜但未发生穿透（图2A）。若弹性染色显示存在重复结构，提示弹性膜有多层，当肿瘤浸润未超过最外层弹性膜（箭头所示）时，应诊断为弹性膜未浸润（图2C
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讨论
本文提出的方法为识别浆膜下弹性膜提供了一种准确的手段。该方法可用于评估肿瘤细胞是否已侵入pT3N0M0胃癌中的弹性膜12。在H&E染色切片中，弹性膜呈红色，难以与胶原纤维区分；而其他现有的辅助诊断方法，如细胞学和免疫组织化学，其诊断价值也较为有限5。腹腔冲洗液中发现肿瘤细胞并不一定意味着原发肿瘤已发生浆膜层浸润，可能源于淋巴结转移或其他远处转移。由于间皮细胞可能被纤维性炎症破坏，免疫组织化学诊断可能难以实施，且工作量相对较大6。然而，弹性染色作为一种经典的特殊染色方法，可使弹性膜清晰可见11,12,13。按照本方案规范操作后，弹性膜可被染成蓝黑色，胶原纤维呈红色，肌纤维和红细胞呈黄色，从而便于病理医师评估肿瘤细胞与弹性膜的分布情况。弹性染色在诊断标准方面也可能存在某些局限性。例如，在某些情况下，.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢国家自然科学基金（项目编号：81401902 和 81501992）以及湖南省自然科学基金（项目编号：2017SK2134、2018JJ2238）的部分资助。论文由雷光撰写。全部实验由雷光和杨海燕完成。作者感谢病理科医生以及随访患者数据的同行们提供的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 弹性蛋白-范吉森染色试剂盒 | Baso | BA4083B | 用于弹性纤维、胶原纤维和肌纤维的染色 |
| Permount TM 封片介质 | MXB Biotechnologies | DAB-0033 | 用于封片 |
| 乙醇 | LMAI Bio | LM64-17-5 | 100% |
| 二甲苯 | LMAI Bio | LX820585 |
参考文献
- Jiang, C. G., et al. Clinicopathologic characteristics and prognosis of gastric cancer invading the subserosa. Journal of Surgical Oncology. 102 (7), 737-741 (2010).
- Amin, M. B., et al. AJCC Cancer Staging Manual. 8th ed. , Springer. New York, NY. (2017). <....
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