pT3N0M0胃癌组织石蜡包埋切片的弹性纤维染色

摘要

本文介绍了一种弹性染色方案，用于在福尔马林固定、石蜡包埋的pT3N0M0胃癌组织切片中识别弹性纤维。随后，我们描述了一种判断肿瘤细胞是否侵犯弹性膜以外区域的方法。

摘要

弹性膜通常位于腹膜间皮细胞下方的间皮下层，在苏木精-伊红（H&E）染色中呈两亲性，但可通过弹性纤维染色清晰显示。弹性染色的一个重要优势在于，它有助于判断肿瘤细胞是否已侵入弹性膜以外区域，从而评估胃肠道癌中腹膜表面侵犯的范围，区分pT3与pT4分期。本研究提供了一种用于鉴定福尔马林固定、石蜡包埋的pT3N0M0胃癌组织切片中弹性纤维的实验方案。我们制备了厚度为5-µm的石蜡切片并固定于载玻片上，随后在染色过程中对所有切片进行脱蜡和水化处理。接着，所有组织切片依次经高锰酸钾氧化、草酸漂白、弹性纤维染色，最后用范吉森（Van Gieson's）进行复染。最终观察染色效果：弹性膜呈蓝黑色，胶原纤维呈红色，而癌细胞则呈现不同程度的黄色。本文还详细描述了用于确定癌细胞与弹性膜之间位置关系的分析方法。该方法操作简便、成本低廉，且由于对弹性纤维具有优异的选择性和可靠的染色结果，可广泛应用于胃肠道癌腹膜表面浸润的识别与判断。

引言

根据肿瘤、淋巴结及转移（TNM）癌症分期系统，胃癌在病理分期 pT4 期的预后显著差于 pT3 期（第8版 UICC/AJCC）¹。对于胃癌，原发肿瘤（pT）的分类通常取决于肿瘤浸润的深度²。病理分期 pT3 胃癌定义为肿瘤穿透肌层侵入浆膜下组织，而 pT4 胃癌则定义为肿瘤穿透至脏层腹膜表面。是否存在腹膜表面浸润是区分这两个分期的关键²。然而，由于腹膜间皮细胞层非常薄，在手术、术后处理及固定过程中可能受到损伤³。此外，肿瘤相关的炎性改变和纤维化可破坏腹膜的正常解剖结构，使得仅依靠苏木精-伊红（H&E）染色难以准确判断腹膜表面的浸润情况⁴。目前的辅助诊断方法，如细胞学检查和免疫组织化学染色，其诊断价值有限^5,6，因其存在假阳性结果或成本效益较低的问题。

浆膜包括腹膜、胸膜和心包膜，由间皮、基底膜和间皮下层组成⁷。浆膜的一个共同组织学特征是在间皮细胞邻近的间皮下层中存在弹性膜^8,9。弹性膜具有较强的抗损伤能力，当间皮细胞因严重的肿瘤相关性炎症或纤维化而破坏时，可作为替代性预后标志物³。弹性膜主要由弹性蛋白和微原纤维组成¹⁰，可通过弹性染色显示。弹性染色的主要原理在于，弹性蛋白与弹性染色液中间苯二酚的酚基形成氢键，从而使弹性纤维染成蓝黑色。经Van Gieson（VG）对比染色后，胶原纤维呈红色，肌纤维和红细胞呈黄色^8,11,12,13。

第八版肺癌TNM分期将脏层胸膜侵犯（T2）定义为肿瘤侵犯超过弹性膜层或侵犯至脏层胸膜表面²。结直肠癌相关研究表明，pT3期结直肠癌中弹性膜层的侵犯可能是导致预后不良的原因。结直肠癌的5年无病生存率和总生存率已被证实与pT4a期相似^13,14,15。根据我们先前关于弹性染色的研究，pT3期胃癌中弹性膜层的侵犯对预后具有显著的负面影响，应被视为与pT4a期胃癌同等处理¹²。因此，这种简单且经济有效的方法有助于消除通过H&E染色所得结果的不确定性，以及克服细胞学、免疫组织化学等其他辅助诊断方法常见的局限性。该方法可高效用于诊断胃肠道癌的腹膜表面侵犯，尤其适用于某些不明确的病例。由于H&E染色及其他常规染色通常难以识别此类侵犯，该方法显得尤为便捷。此外，该方法具有较高的结果可靠性，因其对弹性纤维具有高度特异性。本文中，我们采用弹性染色来判断肿瘤细胞是否已侵犯pT3N0M0期胃癌中的弹性膜层¹²。

该方法用于在福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片上鉴定弹性纤维，也可用于冰冻切片。本实验选择石蜡包埋切片，以更好地保持细胞和组织形态。本方案中所有步骤均在室温下进行。本研究使用一种 commercially staining kit（商品化染色试剂盒），包含高锰酸钾溶液、草酸溶液、弹性蛋白溶液和Van Gieson染液。

方案

1994年至2005年期间，中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院的两位经验丰富的胃肠道病理学家从接受胃部肿瘤切除术的患者中选取了病例样本，这些患者术后病理诊断为pT3N0M0期胃癌（依据第七版TNM分期标准）。本研究已获得伦理审查委员会批准。

1. 切片

1. 将石蜡包埋块放入滑动式切片机的固定夹持器中，使其能够相对于刀片前后移动。调整包埋块与切片刀之间的最佳角度。
   注意：最佳角度不仅取决于刀片的几何形状，还与切片速度和技术有关。
2. 根据需要修整石蜡包埋块，并切成5 µm厚的横切片。
3. 将5 µm厚的石蜡切片置于约40–45 °C的水浴中，随后从水中将切片转移至载玻片上，每张载玻片放置一个切片。
4. 小心地将贴附好的切片轻压在纸巾上，以去除残留水分和可能存在的气泡。
5. 让切片在空气中干燥30分钟，然后在45–50 °C的烘箱中烘烤2小时。

2. 所有切片的脱蜡和复水

1. 将载玻片浸入盛有二甲苯的考普林瓶中，持续 10 分钟。
2. 从第一个二甲苯瓶中取出载玻片，再浸入另一个考普林瓶中的二甲苯中，持续 10 分钟。
3. 接着将载玻片浸入盛有 100% 乙醇的考普林瓶中，持续 5 分钟。
4. 将载玻片浸入另一个盛有 100% 乙醇的考普林瓶中，同样持续 5 分钟。
5. 将载玻片浸入盛有 95% 乙醇的考普林瓶中，持续 2 分钟。
6. 将载玻片浸入盛有 70% 乙醇的考普林瓶中，持续 2 分钟。
   注意：执行上述步骤时，应确保载玻片完全浸没在溶液中。
7. 在新的容器中用蒸馏水短暂冲洗载玻片。

3. 染色

1. 染色前，用纸巾轻轻擦去载玻片上组织周围的多余液体。
2. 将载玻片置于室温及常湿环境中，以防止在整个染色过程中组织干燥。
3. 用几滴高锰酸钾溶液对载玻片进行氧化处理，持续 5 分钟。确保高锰酸钾的用量足以完全覆盖每张载玻片上的组织切片。
4. 在 Coplin 染色缸中用蒸馏水冲洗经氧化处理的载玻片，换水 2 - 3 次。观察组织呈现的蓝色。
5. 接着，加入几滴草酸对这些载玻片进行漂白处理，持续 5 分钟。确保草酸的用量足以完全覆盖每张载玻片上的组织切片。
6. 将载玻片浸入盛有蒸馏水的 Coplin 染色缸中进行冲洗，重复 2 - 3 次。
7. 随后，将这些载玻片短暂地在 95% 酒精中洗涤，然后将其浸入弹力蛋白染液（5 g/L）中 8 - 24 小时。
   注意：弹力蛋白染液具有挥发性，且染色时间相对较长，因此最好将染色载玻片置于密封容器（如带密封盖的透明玻璃瓶）中浸泡。容器的容量和染液的体积应根据浸入的载玻片数量而定，只要能完全浸没所有载玻片即可。
8. 将这些载玻片直接浸入 95% 乙醇中 1 - 2 分钟，以充分分化各组织切片。
   注意：分化是指组织切片电荷的变化，可去除组织吸收的过量染料，使颜色更清晰。弹力蛋白染色后不应使用蒸馏水冲洗，以免影响分化效果。必要时可在显微镜下检查，应可见蓝黑色的弹力纤维和灰色背景。组织切片宜略微欠分化，因为后续的 Van Gieson 复染也会在一定程度上脱去部分弹力染色。
9. 分化完成后，用蒸馏水彻底冲洗这些载玻片。
10. 将载玻片浸入 Van Gieson 染液中复染 1 分钟。
    注意：Van Gieson 染液的用量应足以完全浸没每张载玻片上的组织切片。
11. 快速滴加 95% 乙醇至这些切片上数秒钟，以充分分化各组织切片。
    注意：Van Gieson 复染后切勿用水冲洗载玻片，否则可能导致复染颜色减弱甚至被洗脱。

4. 脱水与封片

1. 将载玻片浸入95%酒精中5分钟，使其快速脱水。
2. 继续用两次100%酒精更换处理，每次将载玻片浸入5分钟，以完成切片的脱水。
3. 将载玻片依次浸入两份二甲苯中，每次3分钟。
4. 在载玻片上滴加一滴树脂封片介质，然后盖上盖玻片。

5. 载玻片的显微镜观察

1. 确定浆膜方向并观察弹性染色结果：弹性纤维（弹性膜）呈蓝黑色，胶原纤维呈红色，肌纤维呈黄色。
2. 在整张切片中寻找癌细胞：癌细胞呈黄色¹²。
3. 确定癌细胞与弹性膜之间的位置关系。
   注意：此处会出现两种情况。只要在整张切片中有一个肿瘤细胞突破了弹性膜，则该病例可判定为弹性膜浸润；反之，只有当整张切片中均无肿瘤细胞突破弹性膜时，方可判定为无弹性膜浸润。

结果

成功的弹性纤维染色可清晰显示pT3期胃癌中的弹性膜和癌细胞。图1 为低倍镜视野，在使用弹性蛋白溶液染色后、按所述方案进行Van Gieson复染前的显微镜观察结果，显示弹性膜紧邻浆膜间皮细胞，呈丝状蓝黑色染色，而肿瘤细胞与弹性膜之间仍存在一定距离。图2 为采用Van Gieson复染的典型弹性纤维染色结果，其中弹性膜染成蓝黑色，胶原纤维染成红色，肌纤维和癌细胞染成黄色。弹性膜浸润定义为癌细胞穿透弹性膜（图2B），而弹性膜未浸润则定义为癌细胞接近弹性膜但未发生穿透（图2A）。若弹性染色显示存在重复结构，提示弹性膜有多层，当肿瘤浸润未超过最外层弹性膜（箭头所示）时，应诊断为弹性膜未浸润（图2C

讨论

本文提出的方法为识别浆膜下弹性膜提供了一种准确的手段。该方法可用于评估肿瘤细胞是否已侵入pT3N0M0胃癌中的弹性膜¹²。在H&E染色切片中，弹性膜呈红色，难以与胶原纤维区分；而其他现有的辅助诊断方法，如细胞学和免疫组织化学，其诊断价值也较为有限⁵。腹腔冲洗液中发现肿瘤细胞并不一定意味着原发肿瘤已发生浆膜层浸润，可能源于淋巴结转移或其他远处转移。由于间皮细胞可能被纤维性炎症破坏，免疫组织化学诊断可能难以实施，且工作量相对较大⁶。然而，弹性染色作为一种经典的特殊染色方法，可使弹性膜清晰可见^11,12,13。按照本方案规范操作后，弹性膜可被染成蓝黑色，胶原纤维呈红色，肌纤维和红细胞呈黄色，从而便于病理医师评估肿瘤细胞与弹性膜的分布情况。弹性染色在诊断标准方面也可能存在某些局限性。例如，在某些情况下，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
弹性蛋白-范吉森染色试剂盒	Baso	BA4083B	用于弹性纤维、胶原纤维和肌纤维的染色
Permount TM 封片介质	MXB Biotechnologies	DAB-0033	用于封片
乙醇	LMAI Bio	LM64-17-5	100%
二甲苯	LMAI Bio	LX820585