改造杆状病毒表达载体以在昆虫细胞中产生分泌型植物蛋白

摘要

本文介绍了利用昆虫细胞与杆状病毒蛋白表达系统大量生产植物分泌蛋白以用于蛋白结晶的实验方案。已使用GP67或昆虫血淋巴素（hemolin）信号肽对杆状病毒表达载体进行改造，以实现植物蛋白在昆虫细胞中的分泌表达。

摘要

对于科学家而言，表达用于结构和生化研究的重组分泌型真核蛋白一直是一项挑战。杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统是用于表达具有某些翻译后修饰的重组真核分泌蛋白的系统之一。分泌蛋白需要通过分泌途径进行蛋白糖基化、二硫键形成以及其他翻译后修饰。为了改进现有的分泌型植物蛋白的昆虫细胞表达，通过在启动子与多克隆位点之间插入GP67或血啉素（hemolin）信号肽序列，对杆状病毒表达载体进行了改造。这种新设计的改良载体系统成功地高效表达了拟南芥（Arabidopsis thaliana）的可溶性重组分泌植物受体蛋白。其中两种表达的植物蛋白——拟南芥TDR和PRK3质膜受体的胞外结构域——已被结晶，用于X射线晶体学研究。该改良的载体系统是一种改进的工具，未来也有望用于动物界中重组分泌蛋白的表达。

引言

一个研究实验室必须具备生产大量均一重组蛋白的能力，以进行生物化学和生物物理表征，尤其是X射线晶体学研究。目前已有多种成熟的异源表达系统，例如 大肠杆菌酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞 等等。 其中，杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统是用于蛋白质结晶、生产大量结构正确折叠的大型重组真核蛋白的最常用技术之一¹.

杆状病毒表达系统的表达载体经过改造，含有强效的多角体蛋白或P10启动子，以实现重组胞内蛋白的高产量表达^2,3。为了构建重组杆状病毒，将目的基因克隆至含有苜蓿银纹夜蛾多核型杆状病毒（Autographa californica multi-nucleopolyhedrovirus）多角体蛋白（polh）位点的昆虫载体中。随后对所获得的构建体进行测序，并验证其正确的开放阅读框（ORF）。将正确的构建体通过转染过程导入宿主昆虫细胞中，目的基因通过同源重组插入病毒基因组。该过程导致重组病毒基因组的产生，随后复制生成重组芽生病毒颗粒¹。

表达系统中最常用的昆虫细胞是Sf9细胞和High Five（Hi5）细胞。Sf9细胞是Sf21的一个克隆分离株，来源于....

方案

注意：采用带有修饰表达载体的昆虫细胞/杆状病毒系统，用于分泌性植物蛋白的表达与结晶。

1. 利用GP67信号肽修饰杆状病毒表达载体以实现植物蛋白分泌表达

1. 合成一个包含5'端BglII酶切位点¹³、GP67分泌信号序列以及带有NotI、BamHI、EcoRI、StuI、SalI、SpeI、XbaI、PstI和XhoI的多克隆位点的DNA片段（图1A）。
   注意：由于BglII和BamHI消化后的DNA产生相同的黏性末端，线性化载体可与消化后的DNA片段连接，而在连接后形成的序列中，BglII和BamHI位点均会突变为不能被BglII或BamHI切割的序列¹⁴。
2. 用BglII和XhoI酶切4 µg DNA，同时用BamHI和XhoI酶切4 µg表达载体DNA¹⁴。将每种限制性内切酶各10单位与DNA混合于1×浓度的反应缓冲液（50 mM醋酸钾、20 mM Tris-醋酸盐、10 mM醋酸镁和100 µg/mL BSA，pH 7.9，25 °C）中，于37 °C孵育4小时。
   1. 使用DNA凝胶回收试剂盒纯化切除的DNA片段和线性化载体DNA¹⁵。
   ....

结果

如图1所示，使用两种改造后的pFastBac1杆状病毒表达载体，分别携带GP67或血素蛋白（hemolin）信号序列，以替代目的基因固有的信号序列，从而表达分泌型蛋白。病毒GP67基因和昆虫血素蛋白（hemolin）基因已被证实可在细胞中实现高效的分泌表达。融合这两种信号序列之一的融合蛋白，预期其分泌表达水平将显著提高。这两种改造载体中设计了相同的多克隆位点（MCS）。在MCS的最5'端特意引入了NotI酶切位点，因为NotI具有八核苷酸识别序列，而大多数其他限制性酶切位点通常为六核苷酸序列。因此，与大多数其他限制性酶切位点相比，NotI位点在目的基因中出现的概率更低，从而使得对大多数目的基因进行限制性酶切和克隆操作更为可行。将目的基因克隆至NotI与下游某一限制性酶切位点之间时，仅会在目的基因上游引入三个氨基酸残基GGR。

pBac1-GP67 和 pBac1-Hem 已成功用于分别表达 <.......

讨论

鉴于生物系统中数千种蛋白质在大小和稳定性方面存在多样性，研究实验室通常需要凭经验决定选择哪种异源表达系统来表达特定蛋白质。E. coli 表达系统由于细菌生命周期短、培养基成本低以及易于放大生产，常常是蛋白质表达的首选¹⁹。然而，在表达分子量超过 60 kDa 的大型真核蛋白时，使用 E. coli 系统常常会导致蛋白质在包涵体中形成不溶性沉淀或发生聚集²⁰。对于这类难表达蛋白以及其他分泌型蛋白的表达，杆状病毒-昆虫细胞表达系统可能比 E. coli 系统更具优势。特别是在表达分泌型真核蛋白时，这种改良的杆状病毒-昆虫细胞表达系统可能是更优的选择。

许多分泌型真核生物蛋白，包括植物分泌蛋白，在蛋白质折叠和分泌过程中需要复杂的糖基化、二硫键形成以及其他翻译后修饰²¹。E. coli系统缺乏加工许多真核蛋白所需复杂修饰的细胞机制²²

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
摇床培养箱	VWR	型号 Excella E25	27 oC
培养箱	VWR	型号 2005	27 oC
离心机	BECKMAN	型号 J-6	配有摆桶转子
Herculase II Fusion DNA 聚合酶	Agilent	600677-51	用于 DNA 的 PCR 扩增
PCR 仪	BIO-RAD	型号 C1000 Touch	用于 DNA 的 PCR 扩增
摇床培养箱	New Brunswick Scientific	型号 I 24	用于细菌培养
定制 DNA 合成	GENSCRIPT
BamHI (HF)	New England Biolabs	R3136S	限制性内切酶
BglII	New England Biolabs	R0144S	限制性内切酶
NotI (HF)	New England Biolabs	R3189S	限制性内切酶
XhoI	New England Biolabs	R0146S	限制性内切酶
T4 DNA 连接酶	New England Biolabs	M0202T	DNA 连接
QIAquick 凝胶回收试剂盒	Qiagen	28704	从琼脂糖凝胶中纯化 DNA
QIAprep Spin 质粒小提试剂盒	Qiagen	27104	从细菌培养物中纯化质粒 DNA
琼脂糖	Thermo Fisher Scientific	15510-019	用于 DNA 凝胶电泳
MAX Efficiency DH5α 感受态细胞	Invitrogen	18-258-012	用于 DNA 连接产物的转化
Lennox L LB 肉汤	Research Product International Corp.	L24066-5000.0	用于制备细菌培养物
氨苄青霉素钠盐	Thermo Fisher Scientific	11593-019	抗生素
卡那霉素硫酸盐	Thermo Fisher Scientific	15160-054	抗生素
四环素	Thermo Fisher Scientific	64-75-5	抗生素
庆大霉素	Thermo Fisher Scientific	15710-064	抗生素
MAX Efficiency DH10Bac 感受态细胞	Thermo Fisher Scientific	10361-012	用于制备杆状病毒 DNA（bacmid）
S.O.C. 培养基	Thermo Fisher Scientific	15544-034	用于 DNA 转化
CellFECTIN II 转染试剂	Thermo Fisher Scientific	10362-101	昆虫细胞转染试剂
Bac-to-Bac 表达系统	Thermo Fisher Scientific	10359-016	杆状病毒-昆虫细胞表达试剂盒
Bluo-gal	Thermo Fisher Scientific	15519-028	用于重组杆状病毒 DNA（bacmid）的筛选
IPTG	Thermo Fisher Scientific	15529-019	用于重组杆状病毒 DNA（bacmid）的筛选
pFastBac1	Thermo Fisher Scientific	10360014	杆状病毒表达载体
Sf9 细胞	Thermo Fisher Scientific	11496015	Sf9 单层细胞
Hi5 细胞	Thermo Fisher Scientific	B85502	High Five 昆虫细胞
Grace’s 昆虫培养基（未添加补充物）	Thermo Fisher Scientific	11595030	Sf9 细胞转染基础培养基
Grace’s 昆虫培养基（添加补充物）	Thermo Fisher Scientific	11605102	Sf9 单层细胞培养完全培养基
Sf-900 II SFM	Thermo Fisher Scientific	10902104	不含胎牛血清（FBS）的 Sf9 悬浮细胞培养基
Express Five SFM	Thermo Fisher Scientific	10486025	Hi5 细胞培养基
青霉素-链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 ml (10,000 I.U./ml)
L-谷氨酰胺（200 mM）	Thermo Fisher Scientific	25030081	100 ml
经认证的胎牛血清（FBS）	Thermo Fisher Scientific	16000-044	500 ml
6 孔板	Thermo Fisher Scientific	08-772-1B	平底
150 mm 培养皿	Thermo Fisher Scientific	353025	每箱 100 个
1.5 ml 微量离心管	USA Scientific	1415-2500	每袋 500 支
15 ml 带螺帽的锥形离心管	USA Scientific	1475-0511	每袋 25 支
50 ml 带螺帽的锥形离心管	USA Scientific	1500-1211	每袋 25 支
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430	NiNTA 树脂
pH 指示试纸	EMD Millipore Corporation	1.09535.0001	pH 0 - 14