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方法文章

改造杆状病毒表达载体以在昆虫细胞中产生分泌型植物蛋白

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DOI：

10.3791/58283

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2018年8月20日

 ,  , 
1Department of Molecular and Structural Biochemistry, College of Agriculture and Life Sciences, North Carolina State University

本文内容

摘要

本文介绍了利用昆虫细胞与杆状病毒蛋白表达系统大量生产植物分泌蛋白以用于蛋白结晶的实验方案。已使用GP67或昆虫血淋巴素（hemolin）信号肽对杆状病毒表达载体进行改造，以实现植物蛋白在昆虫细胞中的分泌表达。

摘要

对于科学家而言，表达用于结构和生化研究的重组分泌型真核蛋白一直是一项挑战。杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统是用于表达具有某些翻译后修饰的重组真核分泌蛋白的系统之一。分泌蛋白需要通过分泌途径进行蛋白糖基化、二硫键形成以及其他翻译后修饰。为了改进现有的分泌型植物蛋白的昆虫细胞表达，通过在启动子与多克隆位点之间插入GP67或血啉素（hemolin）信号肽序列，对杆状病毒表达载体进行了改造。这种新设计的改良载体系统成功地高效表达了拟南芥（Arabidopsis thaliana）的可溶性重组分泌植物受体蛋白。其中两种表达的植物蛋白——拟南芥TDR和PRK3质膜受体的胞外结构域——已被结晶，用于X射线晶体学研究。该改良的载体系统是一种改进的工具，未来也有望用于动物界中重组分泌蛋白的表达。

引言

一个研究实验室必须具备生产大量均一重组蛋白的能力，以进行生物化学和生物物理表征，尤其是X射线晶体学研究。目前已有多种成熟的异源表达系统，例如 大肠杆菌酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞 等等。 其中，杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统是用于蛋白质结晶、生产大量结构正确折叠的大型重组真核蛋白的最常用技术之一1.

杆状病毒表达系统的表达载体经过改造，含有强效的多角体蛋白或P10启动子，以实现重组胞内蛋白的高产量表达2,3。为了构建重组杆状病毒，将目的基因克隆至含有苜蓿银纹夜蛾多核型杆状病毒（Autographa californica multi-nucleopolyhedrovirus）多角体蛋白（polh）位点的昆虫载体中。随后对所获得的构建体进行测序，并验证其正确的开放阅读框（ORF）。将正确的构建体通过转染过程导入宿主昆虫细胞中，目的基因通过同源重组插入病毒基因组。该过程导致重组病毒基因组的产生，随后复制生成重组芽生病毒颗粒1。

表达系统中最常用的昆虫细胞是Sf9细胞和High Five（Hi5）细胞。Sf9细胞是Sf21的一个克隆分离株，来源于Spodoptera frugiperda的蛹期卵巢细胞；Hi5细胞则是来源于亲本Trichoplusia ni卵巢细胞系TN-368的克隆分离株4,5。共转染、病毒扩增和空斑实验通常在Sf9细胞上进行，而Hi5细胞通常被选用于生产更高产量的重组蛋白6。值得注意的是，由于Hi5细胞容易产生突变病毒，因此不适合用于病毒子代的生成与扩增。传统上，25 - 30 °C的温度范围被认为适合昆虫细胞的培养。然而，已有报道指出，27 - 28 °C是昆虫细胞生长和感染的最适温度7,8。

在基因上游引入强信号序列是实现分泌蛋白高效表达所必需的。该信号序列可有效引导翻译后的重组蛋白进入内质网，从而进行蛋白质分泌以及正确折叠和稳定所必需的翻译后修饰3。已有研究选用多种信号肽序列，如杆状病毒包膜蛋白GP64/67、蜜蜂蜂毒肽（melittin）等，以促进杆状病毒介导表达系统中分泌型重组蛋白的表达3。研究表明，与使用目的基因自身固有的信号肽相比，引入GP67信号肽可提高分泌型重组蛋白的表达产量9。Hemolin是巨大蚕蛾Hyalophora cecropia在细菌感染后诱导产生的血淋巴蛋白10。由于其诱导表达水平相对较高，该基因的信号肽序列可用于介导重组蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中的分泌表达。

A. thaliana 的导管分子分化抑制因子受体（TDR）和花粉受体激酶3（PRK3）均属于植物富含亮氨酸重复序列的类受体激酶（LRR-RLK）蛋白家族11,12。为了研究该类植物受体蛋白的结构与功能，并促进其他植物分泌蛋白的结构与生化表征，已有研究对杆状病毒-昆虫细胞表达系统进行了改造，以提高目标蛋白的质量和产量。TDR和PRK3的胞外结构域已成功利用两种改良的表达载体在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中得以表达。TDR和PRK3蛋白的胞外结构域均获得了晶体。本文报道了通过在启动子与多克隆位点之间引入GP67或血清素（hemolin）信号序列的两种改良杆状病毒表达载体，实现大量重组植物分泌蛋白的表达与纯化。

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方案

注意：采用带有修饰表达载体的昆虫细胞/杆状病毒系统，用于分泌性植物蛋白的表达与结晶。

1. 利用GP67信号肽修饰杆状病毒表达载体以实现植物蛋白分泌表达

  1. 合成一个包含5'端BglII酶切位点13、GP67分泌信号序列以及带有NotI、BamHI、EcoRI、StuI、SalI、SpeI、XbaI、PstI和XhoI的多克隆位点的DNA片段（图1A）。
    注意：由于BglII和BamHI消化后的DNA产生相同的黏性末端，线性化载体可与消化后的DNA片段连接，而在连接后形成的序列中，BglII和BamHI位点均会突变为不能被BglII或BamHI切割的序列14。
  2. 用BglII和XhoI酶切4 µg DNA，同时用BamHI和XhoI酶切4 µg表达载体DNA14。将每种限制性内切酶各10单位与DNA混合于1×浓度的反应缓冲液（50 mM醋酸钾、20 mM Tris-醋酸盐、10 mM醋酸镁和100 µg/mL BSA，pH 7.9，25 °C）中，于37 °C孵育4小时。
    1. 使用DNA凝胶回收试剂盒纯化切除的DNA片段和线性化载体DNA15。
  3. 在10 µL连接反应体系中，将100 ng线性化载体DNA与400 ng酶切后的DNA片段混合，体系包含1× T4 DNA连接酶反应缓冲液（50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、1 mM ATP和10 mM DTT，pH 7.5，25 °C）及5单位T4 DNA连接酶。将反应体系于16 °C孵育16小时。
  4. 取5 µL连接产物，按照标准转化流程转入100 µL DH5α感受态细胞中，并在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上筛选转化菌落16。挑取5–10个单菌落，分别接种于2 mL含100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，在摇床培养箱中以220 rpm、37 °C振荡培养16小时。
  5. 使用质粒DNA小提试剂盒提取各菌落的质粒DNA17，并使用引物AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG进行DNA测序以确认克隆正确性。
  6. 以合成的TDR基因构建体为模板，通过PCR扩增拟南芥（A. thaliana）TDR基因编码第30–642位氨基酸的片段（正向引物：CATG GCGGCCGC CTCAAGTTTTCACCTCAACTCTTGTC，反向引物：GC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG ACCGTCTATATCTGCATTTCCGGC）。在含有0.5 mM dNTP混合物、0.2 µM引物、0.1 µg模板DNA、0.4 mM MgCl2和1单位DNA聚合酶的DNA聚合酶反应缓冲液中，进行30个循环的扩增。
    1. PCR循环程序设置如下：95 °C预变性30秒；随后进行30个循环，每个循环包括95 °C变性30秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸1分钟；最后在72 °C延伸5分钟。
  7. 使用NotI和BamHI限制性内切酶对PCR产物片段和修饰后的载体进行双酶切。将基因片段与线性化载体连接：在10 µL连接反应体系中，混合100 ng线性化载体DNA与400 ng酶切后的DNA片段，体系包含T4 DNA连接酶反应缓冲液和5单位T4 DNA连接酶。将反应体系于16 °C孵育16小时。
  8. 取5 µL连接产物，按照标准转化流程转入100 µL DH5α感受态细胞中，并在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上筛选转化菌落16。通过DNA测序确认正确克隆。

2. 利用昆虫Hemolin信号肽修饰杆状病毒表达载体以实现植物蛋白的分泌表达

  1. 合成一个包含5'端BglII酶切位点13、昆虫hemolin分泌信号序列以及带有NotI、BamHI、EcoRI、StuI、SalI、SpeI、XbaI、PstI和XhoI的多克隆位点的DNA片段（图1B）。
  2. 用BglII和XhoI酶切4 µg的DNA，同时用BamHI和XhoI酶切4 µg的表达载体DNA14。将每种限制性内切酶各10单位与DNA混合于1x浓度的反应缓冲液（50 mM醋酸钾、20 mM Tris-醋酸盐、10 mM醋酸镁和100 µg/mL BSA，pH 7.9，25 °C）中，并在37 °C下孵育4小时。
    1. 使用DNA凝胶回收试剂盒15纯化切除的DNA片段和线性化载体DNA。
  3. 将100 ng线性化载体DNA与400 ng酶切后的DNA片段混合于10 µL连接反应体系中，体系包含1x T4 DNA连接酶反应缓冲液（50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、1 mM ATP和10 mM DTT，pH 7.5，25 °C）及5单位T4 DNA连接酶。将反应体系在16 °C下孵育16小时。
  4. 取5 µL连接产物转化至100 µL DH5α感受态细胞中，并在氨苄青霉素-LB琼脂平板上筛选菌落。挑取5–10个单菌落，分别接种于含100 µg/mL氨苄青霉素的2 mL LB培养基中，在摇床培养箱中以220 rpm、37 °C振荡培养16小时。
  5. 使用质粒DNA小提试剂盒17提取质粒DNA，并使用引物AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG通过DNA测序验证克隆。
  6. 以合成的PRK3基因构建体为模板，通过PCR扩增拟南芥（A. thaliana）花粉受体激酶3（PRK3）基因编码第20–237位氨基酸的片段（正向引物：CATG GCGGCCGC CTACAAAACGTTAGTGAATCGGAACC，反向引物：CGC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG TGAAGGTTTCTCATCGCATTCTATATTC）。在含有0.5 mM dNTP混合物、0.2 µM引物、0.1 µg模板DNA、0.4 mM MgCl2和1单位DNA聚合酶的反应缓冲液中进行30个循环的扩增。
    1. PCR循环程序设置如下：初始变性95 °C 30秒；随后进行30个循环，每个循环包括95 °C变性30秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸30秒；最后72 °C延伸5分钟。
  7. 使用NotI和BamHI限制性内切酶对PCR产物片段和修饰后的载体进行双酶切。将基因片段与线性化载体连接：将100 ng线性化载体DNA与400 ng酶切后的DNA片段混合于10 µL连接反应体系中，体系包含T4 DNA连接酶反应缓冲液和5单位T4 DNA连接酶。将反应体系在16 °C下孵育16小时。
  8. 取5 µL连接产物，按照标准转化流程将其转化至100 µL DH5α感受态细胞中，并在氨苄青霉素-LB琼脂平板上筛选转化子16。通过DNA测序确认正确克隆。

3. 含重组蛋白表达盒的杆状病毒构建体的制备与扩增

  1. 按照杆状病毒表达系统方案1，使用100 ng构建质粒转化40 µL DH10Bac感受态细胞。将转化后的平板在37 °C培养48 h。
  2. 从每个转化平板上挑取两个白色菌落，分别接种至含有50 µg/mL卡那霉素、7 µg/mL庆大霉素和10 µg/mL四环素的2 mL LB培养基中。按照杆状病毒表达系统方案1提取并验证杆粒DNA。将每份DNA分装至两管中，每管20 µL，并于-20 °C保存。
    注意：以下步骤需进行无菌操作。
  3. 在6孔板中，于27 °C使用含10%胎牛血清（FBS）和100 µg/mL（或100 I.U./mL）青霉素-链霉素抗生素的培养基培养Sf9细胞至80%汇合度。根据组织培养板上覆盖面积的百分比估算细胞汇合度。
  4. 在两个无菌的1.5 mL离心管中分别配制以下溶液。
    1. 管1：每次转染时，将20 µL杆粒DNA加入100 µL不含抗生素的Sf9细胞基础培养基中。通过轻弹管壁轻轻混匀。
    2. 管2：每次转染时，将8 µL脂质转染试剂加入100 µL不含抗生素的Sf9细胞基础培养基中。通过上下吹打6次充分混匀。
  5. 将上述两种溶液混合，缓慢上下吹打3次以轻柔混匀，室温孵育20–40分钟。
  6. 用3 mL不含抗生素的Sf9细胞基础培养基将Sf9单层细胞每孔洗涤2次。每次转染时，向含有脂质-DNA混合物的各管中加入0.8 mL不含抗生素的Sf9细胞基础培养基。缓慢上下吹打3次以轻柔混匀管内液体。吸除孔中洗涤液，将转染混合物覆盖于细胞上。
  7. 加入转染混合物后，将转染板于27 °C孵育5小时。随后弃去转染液，更换为含10% FBS和100 µg/mL（或100 I.U./mL）青霉素-链霉素抗生素的完全Sf9细胞培养基。将转染板于27 °C继续孵育4天。
  8. 收集并扩增重组杆状病毒。
    1. 孵育4天后，将感染后的培养板上清液收集至无菌15 mL锥形管中。在1010 × g离心5分钟以去除细胞碎片。弃去沉淀，将上清液转移至洁净管中，4 °C保存可长达1年。
      注意：此为P0代病毒。可分装后于-80 °C长期保存。
    2. 为扩增每种重组病毒，在150 mm培养皿中培养Sf9细胞至80%汇合度。吸除培养基，向贴壁细胞中加入2 mL P0代病毒，于27 °C培养箱中孵育1小时。每隔15分钟轻轻摇动培养皿以混匀培养基与细胞。
      1. 加入含10% FBS和100 µg/mL（或100 I.U./mL）青霉素-链霉素抗生素的25 mL完全Grace's培养基。于27 °C培养箱中继续孵育3天，获得P1代病毒。
    3. 将感染后的培养板上清液收集至无菌50 mL锥形管中，在1010 × g离心5分钟以去除细胞碎片。将上清液转移至洁净管中，4 °C保存可长达1年。
      注意：P1代病毒可分装后于-80 °C长期保存。
    4. 为将病毒从P1代扩增至P2代，在150 mm培养皿中培养Sf9细胞至90%汇合度，吸除培养基，向培养皿中加入2 mL P1代病毒，于27 °C培养箱中孵育1小时。
    5. 重复步骤3.8.2和3.8.3以获得P2和P3代病毒。P3代病毒保存时间不得超过2个月。

4. 蛋白质表达、NiNTA 纯化及结晶

  1. 在含有100 µg/mL（或100 I.U./mL）青霉素-链霉素抗生素的培养基中，于27 °C、100 rpm的摇床培养箱中培养1 L Hi5昆虫细胞，使其密度达到2 × 106。在570 × g条件下离心5分钟，弃去上清液，将细胞重悬于20 mL新制备的P3病毒液中，室温静置1小时。每15分钟轻轻摇动旋转瓶一次，使细胞充分重悬。
  2. 将细胞转移至含有100 µg/mL（或100 I.U./mL）青霉素-链霉素抗生素的1 L新鲜培养基中，在27 °C、100 rpm的摇床培养箱中继续培养72小时。在1,010 × g条件下离心5分钟，收集上清液。
  3. 使用pH指示试纸，通过添加0.1 M HCl或0.1 M NaOH将上清液的pH调节至8.0，并加入结合缓冲液至终浓度为20 mM Tris缓冲液（pH 8.0）、100 mM NaCl和5 mM咪唑。根据表达的His标签重组蛋白的预估产量，加入适量的NiNTA树脂（10–40 mL）。
    1. 在4 °C下以低速磁力搅拌混合溶液1小时。按照标准NiNTA纯化方案18对树脂进行洗涤并洗脱结合的蛋白。
  4. 对纯化后的蛋白进行离子交换层析和凝胶过滤层析，以及其他蛋白纯化方法，以获得均一的样品。
    注意：对于TDR胞外域，使用20 mM Tris（pH 8）、100 mM NaCl作为凝胶过滤缓冲液；对于PRK3胞外域，推荐使用20 mM bis-Tris（pH 6）、100 mM NaCl作为凝胶过滤缓冲液。

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结果

如图1所示，使用两种改造后的pFastBac1杆状病毒表达载体，分别携带GP67或血素蛋白（hemolin）信号序列，以替代目的基因固有的信号序列，从而表达分泌型蛋白。病毒GP67基因和昆虫血素蛋白（hemolin）基因已被证实可在细胞中实现高效的分泌表达。融合这两种信号序列之一的融合蛋白，预期其分泌表达水平将显著提高。这两种改造载体中设计了相同的多克隆位点（MCS）。在MCS的最5'端特意引入了NotI酶切位点，因为NotI具有八核苷酸识别序列，而大多数其他限制性酶切位点通常为六核苷酸序列。因此，与大多数其他限制性酶切位点相比，NotI位点在目的基因中出现的概率更低，从而使得对大多数目的基因进行限制性酶切和克隆操作更为可行。将目的基因克隆至NotI与下游某一限制性酶切位点之间时，仅会在目的基因上游引入三个氨基酸残基GGR。

pBac1-GP67 和 pBac1-Hem 已成功用于分别表达 <...

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讨论

鉴于生物系统中数千种蛋白质在大小和稳定性方面存在多样性，研究实验室通常需要凭经验决定选择哪种异源表达系统来表达特定蛋白质。E. coli 表达系统由于细菌生命周期短、培养基成本低以及易于放大生产，常常是蛋白质表达的首选19。然而，在表达分子量超过 60 kDa 的大型真核蛋白时，使用 E. coli 系统常常会导致蛋白质在包涵体中形成不溶性沉淀或发生聚集20。对于这类难表达蛋白以及其他分泌型蛋白的表达，杆状病毒-昆虫细胞表达系统可能比 E. coli 系统更具优势。特别是在表达分泌型真核蛋白时，这种改良的杆状病毒-昆虫细胞表达系统可能是更优的选择。

许多分泌型真核生物蛋白，包括植物分泌蛋白，在蛋白质折叠和分泌过程中需要复杂的糖基化、二硫键形成以及其他翻译后修饰21。E. coli系统缺乏加工许多真核蛋白所需复杂修饰的细胞机制22

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了北卡罗来纳州立大学为 Guozhou Xu 提供的新进教师启动资金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
摇床培养箱VWR型号 Excella E2527 oC
培养箱VWR型号 200527 oC
离心机BECKMAN型号 J-6配有摆桶转子
Herculase II Fusion DNA 聚合酶Agilent600677-51用于 DNA 的 PCR 扩增
PCR 仪BIO-RAD型号 C1000 Touch用于 DNA 的 PCR 扩增
摇床培养箱New Brunswick Scientific型号 I 24用于细菌培养
定制 DNA 合成GENSCRIPT
BamHI (HF)New England BiolabsR3136S限制性内切酶
BglIINew England BiolabsR0144S限制性内切酶
NotI (HF)New England BiolabsR3189S限制性内切酶
XhoINew England BiolabsR0146S限制性内切酶
T4 DNA 连接酶New England BiolabsM0202TDNA 连接
QIAquick 凝胶回收试剂盒Qiagen28704从琼脂糖凝胶中纯化 DNA
QIAprep Spin 质粒小提试剂盒Qiagen27104从细菌培养物中纯化质粒 DNA
琼脂糖Thermo Fisher Scientific15510-019用于 DNA 凝胶电泳
MAX Efficiency DH5α 感受态细胞Invitrogen18-258-012用于 DNA 连接产物的转化
Lennox L LB 肉汤Research Product International Corp.L24066-5000.0用于制备细菌培养物
氨苄青霉素钠盐Thermo Fisher Scientific11593-019抗生素
卡那霉素硫酸盐Thermo Fisher Scientific15160-054抗生素
四环素Thermo Fisher Scientific64-75-5抗生素
庆大霉素Thermo Fisher Scientific15710-064抗生素
MAX Efficiency DH10Bac 感受态细胞Thermo Fisher Scientific10361-012用于制备杆状病毒 DNA（bacmid）
S.O.C. 培养基Thermo Fisher Scientific15544-034用于 DNA 转化
CellFECTIN II 转染试剂Thermo Fisher Scientific10362-101昆虫细胞转染试剂
Bac-to-Bac 表达系统Thermo Fisher Scientific10359-016杆状病毒-昆虫细胞表达试剂盒
Bluo-galThermo Fisher Scientific15519-028用于重组杆状病毒 DNA（bacmid）的筛选
IPTGThermo Fisher Scientific15529-019用于重组杆状病毒 DNA（bacmid）的筛选
pFastBac1Thermo Fisher Scientific10360014杆状病毒表达载体
Sf9 细胞Thermo Fisher Scientific11496015Sf9 单层细胞
Hi5 细胞Thermo Fisher ScientificB85502High Five 昆虫细胞
Grace’s 昆虫培养基（未添加补充物）Thermo Fisher Scientific11595030Sf9 细胞转染基础培养基
Grace’s 昆虫培养基（添加补充物）Thermo Fisher Scientific11605102Sf9 单层细胞培养完全培养基
Sf-900 II SFMThermo Fisher Scientific10902104不含胎牛血清（FBS）的 Sf9 悬浮细胞培养基
Express Five SFMThermo Fisher Scientific10486025Hi5 细胞培养基
青霉素-链霉素Thermo Fisher Scientific15140122100 ml (10,000 I.U./ml)
L-谷氨酰胺（200 mM）Thermo Fisher Scientific25030081100 ml
经认证的胎牛血清（FBS）Thermo Fisher Scientific16000-044500 ml
6 孔板Thermo Fisher Scientific08-772-1B平底
150 mm 培养皿Thermo Fisher Scientific353025每箱 100 个
1.5 ml 微量离心管USA Scientific1415-2500每袋 500 支
15 ml 带螺帽的锥形离心管USA Scientific1475-0511每袋 25 支
50 ml 带螺帽的锥形离心管USA Scientific1500-1211每袋 25 支
Ni-NTA SuperflowQiagen30430NiNTA 树脂
pH 指示试纸EMD Millipore Corporation1.09535.0001pH 0 - 14

参考文献

  1. Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnology Progress. 30, 1-18 (2014).
  2. Khan, S., Ng, M. L., Tan, Y. J. Expression of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 3a protein and the assembly of coronavirus-like particles in the baculovirus expression system. Methods in Molecular Biology. 379, 35-50 (2007).
  3. Possee, R. D., King, L. A. Baculovirus Transfer Vectors. Methods in Molecular Biology. 1350, 51-71 (2016).
  4. Vaughn, J. L., Goodwin, R. H., Tompkins, G. J., McCawley, P. The establishment of two cell lines from the insect Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae). In Vitro. 13, 213-217 (1977).
  5. Hink, W. F. Established insect cell line from the cabbage looper, Trichoplusia ni. Nature. 226, 466-467 (1970).
  6. Davis, T. R., et al. Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines. In Vitro Cellular & Development Biology - Animal. 29A, 388-390 (1993).
  7. Wickham, T. J., Nemerow, G. R. Optimization of growth methods and recombinant protein production in BTI-Tn-5B1-4 insect cells using the baculovirus expression system. Biotechnology Progress. 9, 25-30 (1993).
  8. Davis, T. R., Trotter, K. M., Granados, R. R., Wood, H. A. Baculovirus expression of alkaline phosphatase as a reporter gene for evaluation of production, glycosylation and secretion. Nature Biotechnology. 10, 1148-1150 (1992).
  9. Murphy, C. I., et al. Enhanced expression, secretion, and large-scale purification of recombinant HIV-1 gp120 in insect cell using the baculovirus egt and p67 signal peptides. Protein Expression and Purification. 4, 349-357 (1993).
  10. Sun, S. C., Lindstrom, I., Boman, H. G., Faye, I., Schmidt, O. Hemolin: an insect-immune protein belonging to the immunoglobulin superfamily. Science. 250, 1729-1732 (1990).
  11. Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. Differential CLE peptide perception by plant receptors implicated from structural and functional analyses of TDIF-TDR interactions. PLoS One. 12, e0175317(2017).
  12. Chakraborty, S., Pan, H., Tang, Q., Woolard, C., Xu, G. The Extracellular Domain of Pollen Receptor Kinase 3 is structurally similar to the SERK family of co-receptors. Scientific Reports. 8, 2796(2018).
  13. Khorana, H. G. Total synthesis of a gene. Science. 203, 614-625 (1979).
  14. Bahl, C. P., Marians, K. J., Wu, R. A general method for inserting specific DNA sequences into cloning vehicles. Gene. 1, 81-92 (1976).
  15. Xu, W., Zhang, Y. Isolation and Characterization of Vaccine-Derived Polioviruses, Relevance for the Global Polio Eradication Initiative. Methods in Molecular Biology. 1387, 213-226 (2016).
  16. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166, 557-580 (1983).
  17. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiments. (6), 247(2007).
  18. Reddy, B. G., et al. Expression and purification of the alpha subunit of the epithelial sodium channel, ENaC. Protein Expression and Purification. 117, 67-75 (2016).
  19. Harris, T. J., Emtage, J. S. Expression of heterologous genes in E. coli. Microbiological Sciences. 3, 28-31 (1986).
  20. Kaur, J., Kumar, A., Kaur, J. Strategies for optimization of heterologous protein expression in E. coli: Roadblocks and reinforcements. International Journal of BIological Macromolecules. 106, 803-822 (2018).
  21. Guo, Y., Yang, F., Tang, X. An Overview of Protein Secretion in Yeast and Animal Cells. Methods in Molecular Biology. 1662, 1-17 (2017).
  22. Blight, M. A., Chervaux, C., Holland, I. B. Protein secretion pathway in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 5, 468-474 (1994).
  23. Idiris, A., Tohda, H., Kumagai, H., Takegawa, K. Engineering of protein secretion in yeast: strategies and impact on protein production. Applied Microbiology and Biotechnology. 86, 403-417 (2010).
  24. Wormald, M. R., Dwek, R. A. Glycoproteins: glycan presentation and protein-fold stability. Structure. 7, R155-R160 (1999).
  25. Geisler, C., Mabashi-Asazuma, H., Jarvis, D. L. An Overview and History of Glyco-Engineering in Insect Expression Systems. Methods in Molecular Biology. 1321, 131-152 (2015).
  26. Li, Z., Chakraborty, S., Xu, G. X-ray crystallographic studies of the extracellular domain of the first plant ATP receptor, DORN1, and the orthologous protein from Camelina sativa. Acta Crystallographica Section F: Structural BIology and Crystallization Communications. 72, 782-787 (2016).
  27. Aricescu, A. R., Owens, R. J. Expression of recombinant glycoproteins in mammalian cells: towards an integrative approach to structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 23, 345-356 (2013).
  28. Reuter, L. J., Bailey, M. J., Joensuu, J. J., Ritala, A. Scale-up of hydrophobin-assisted recombinant protein production in tobacco BY-2 suspension cells. Plant Biotechnology Journal. 12, 402-410 (2014).
  29. Dohi, K., et al. Inducible virus-mediated expression of a foreign protein in suspension-cultured plant cells. Archives of Virology. 151, 1075-1084 (2006).

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