来源于人诱导性多能干细胞的自发收缩心肌细胞合胞体是研究人类心脏生理学和药理学的有用模型。本文介绍了一种高通量筛选系统，该系统利用钙敏感性荧光染料和温度可控的成像多孔板读数仪，定量分析外源性化合物对搏动频率的影响。
本文内容
摘要
摘要
来源于人诱导性多能干细胞的心肌细胞（hiPSC-CM）可自发收缩形成合胞体，是研究人类心脏生理学和药理学的有用模型。已有多种方法被提出用于记录这种自发性活动并评估药物效应，但许多方法存在通量有限和/或生理相关性不足的问题。我们开发了一种高通量筛选系统，利用钙敏感型荧光染料和温度可控的多孔板成像读板仪，定量检测外源性化合物对hiPSC-CM搏动频率的影响。本文详细描述了细胞板和化合物板的制备方法，以及如何运行自动化检测以实现高灵敏度和高重复性。同时，还介绍了如何转换和分析荧光数据，以可靠地评估药物对自发节律的影响。该检测方法可用于药物发现项目，指导化学结构优化，避免或选择性地作用于影响人类心脏功能的化合物。
引言
本方案描述了一种在生理相关节律下测定药物对人诱导多能干细胞来源心肌细胞（hiPSC-CM）合胞体自发搏动频率影响的方法。人诱导多能干细胞可分化为功能性心肌细胞，并在体外形成自发搏动的合胞体in vitro1,2,3,4。这些hiPSC-CM可通过商业途径获得，或由实验室自行制备，是构建人类心脏生理学和药理学模型的有用细胞来源。尤其可用于预测或表征药物在人体给药后可能引起的心脏效应5。
在生理条件下，可使用微电极阵列或阻抗感应技术测量hiPSC-CM合胞体的搏动频率1：这些非侵入性技术可提供有关药物效应的非常详细的信息，但通量较低，难以在现实的时间和预算限制内对大规模化合物库进行筛选。可采用384孔荧光成像酶标仪结合钙敏感性染料建立更高效的检测系统6，但传统的酶标仪受限于温度控制不佳和采集频率不足。这些局限性表现为非生理性的搏动速率（约15次/分钟，而受控环境下的正常范围为35–55次/分钟1）以及较差的钙信号分辨率（8 Hz的采集频率仅处于记录刺激条件下可达120次/分钟搏动速率的最低要求，且无法提取斜率或持续时间等参数信息）。本文所述方法结合了在生理节律下记录搏动模式的能力，并具备足够的分辨率，从而避免了上述问题。
从积极方面来看，该方法简单、可靠且通量高，能够在合理成本下快速测试大量化合物。从消极方面来看，该方法需要配备有效温控系统的快速酶标仪，而此类设备投资昂贵，并且无法提供有关药物效应作用机制的详细信息，可能需要进一步采用更精细的方法进行补充测试。
每次在一块384孔细胞板上进行检测大约需要6 × 106个hiPSC-CM细胞。hiPSC-CM通常以商品化形式提供，每份冻存液约为1 mL，含细胞数约4 × 106个。因此，使用三份冻存细胞制备两块细胞板较为方便。大多数情况下，由于该检测方法变异性较低，对测试化合物进行双复孔检测即可；每块细胞板中，阳性对照（forskolin、N6-环戊基-腺苷和E-4031）进行四复孔检测，阴性对照（单独DMSO）进行20复孔检测。因此，使用两块384孔细胞板最多可评估352个化合物/浓度组合。以下方案基于使用352个待测化合物、两块细胞板以及三份共1200万个细胞的实验设计；若需增加数据点，可据此方案按比例放大。
方案
1. 细胞培养板的制备
注意：在测定药物效应前 3–4 周准备细胞培养板。
- 实验第0天
注意：出于实验规划的目的，测试化合物的给药可在第22天至第28天之间的任意一天进行。–实验的第28步。- 打开水浴锅，设置温度为 37 °C，预热 40 mL 铺板培养基（按生产商提供的配方）。
注意：使用细胞时应采用其供应商提供的配套培养基和维持培养基。 - 将含有冻存细胞的冻存管置于水浴中 2 分钟，以解冻 hiPSC-CM。
- 将1 mL细胞悬液小心转移至50 mL锥形管中。
- 用1 mL预热的铺板培养基冲洗每个冻存管，以回收残留细胞，并将冲洗液加入步骤1.1.3中盛有细胞的同一离心管中。
- 将另外8 mL温热的铺板培养基小心地混入细胞悬液中。
- 使用台盼蓝排斥法和血细胞计数板计数活细胞8.
注意：6 x 10 的需求6 一个384孔细胞培养板的细胞用量考虑了冻存细胞中最多存在20%死细胞的可能性，这在我们的经验中为最高比例。 - 将细胞悬液调整至 5 x 105 活细胞/mL，使用预热的铺板培养基。
- 将细胞悬液分配至两块384孔细胞培养板中，每孔加入25 µL（约每孔12,500个细胞）。
注意：细胞培养板无需预先包被任何基质（参见 讨论). - 将细胞培养板置于含5% CO₂的湿润环境中，37 °C培养2.
- 打开水浴锅，设置温度为 37 °C，预热 40 mL 铺板培养基（按生产商提供的配方）。
- 实验第1天
- 打开37 °C水浴锅，将50 mL添加了1% v/v青霉素-链霉素溶液的维持培养基预热。
- 将细胞培养板每孔中的铺板培养基更换为50 µL温热的维持培养基。
- 第2天–实验的第21天（最长至第27天）
注意hiPSC-CMs 在此期间无需传代，因为它们是不分裂的细胞。- 每2天更换一半的维持培养基–3天后换液，并在第7、14和21天完全更换培养基。
注意：荧光检测可在实验的第22至28天之间进行。更长时间尚未尝试，但可能仍然可行。
- 每2天更换一半的维持培养基–3天后换液，并在第7、14和21天完全更换培养基。
2. 仪器、化合物板和检测板的准备
注意：在实验第22至28天测量药物效应当天，准备仪器、化合物板和检测板。使用配备温度控制功能及合适荧光滤光片组和激发光源的荧光酶标仪。例如，使用Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8荧光滤光片组（激发波长：472 nm；发射波长：520–560 nm）和150 W激发光源单元。
- 在将第一块细胞板放入酶标仪进行检测前至少2小时，打开酶标仪并将加热系统设定为37 °C。
注意：也可在前一天晚上完成此步骤。 - 分别用DMSO配制佛司可林（forskolin）、N6-环戊基-腺苷（N6-cyclopentyl-adenosine）和E-4031的储备液，浓度分别为0.33 mM、10 mM和3.33 mM（溶剂为H2O）。
注意：储备液在加入细胞前将被稀释333倍，目标是使终浓度分别达到1 µM佛司可林、30 µM N6-环戊基-腺苷和10 µM E-4031，这些浓度可产生可靠且可重复的效应。 - 将352种待测化合物配制成DMSO储备液，浓度为计划测试浓度的333倍（例如，若测试浓度为30 µM，则储备液浓度为10 mM）。
注意：目标是在化合物加入细胞板后，使DMSO的终浓度为0.3%（v/v）；这是不会影响心肌细胞节律性活动的最高DMSO浓度。储备液也可在前一天配制。每次重复检测至少需要5 µL储备液。 - 准备化合物板。
- 将40 mL添加了1% v/v青霉素-链霉素溶液的维持培养基恢复至室温。
- 向两块384孔化合物板中每孔加入1.5 µL储备液，分配如下：i) 待测化合物（每种两个孔），ii) 阳性对照（佛司可林、N6-环戊基-腺苷和E-4031，每块化合物板中每种化合物各四个孔），iii) 阴性对照（DMSO，每块化合物板20个孔）。
- 以100 × g 离心化合物板1分钟。
- 向每孔加入37 µL室温维持培养基（此时总体积为38.5 µL，含3.9% DMSO）。
- 再次以100 × g 离心化合物板1分钟。
- 将化合物板装入酶标仪。
注意：接下来的步骤应尽快进行，以尽量减少化合物板中的液体蒸发。
- 配制荧光染料。
- 开启37 °C水浴锅，并将100 mL添加了1% v/v青霉素-链霉素溶液的维持培养基预热至37 °C。
- 用10 mL含抗生素的预热维持培养基重悬钙离子敏感型荧光染料及其淬灭剂。
注意：该荧光染料储备液通常含有钙离子敏感型荧光染料（如Fluo-4）和一种淬灭剂，剩余溶液可在4 °C保存至少5天。
3. 数据采集
注意：在测定药物效应的当天进行数据采集。先对第一块细胞板完整执行步骤 3.1–.10 ，然后对第二块细胞板重复相同操作。
- 启动酶标仪软件（如需要），并安装移液吸头。
- 调整软件设置，以至少 10 赫兹的采样频率记录 2 分钟的钙波信号，以确定每个孔的基础搏动频率。
- 对于一块细胞培养板，将 3 mL 荧光染料储备液加入 12 mL 含抗生素的温热维持培养基中，配制荧光染色工作液。
- 将细胞培养板各孔中的 20 µL 培养基替换为 30 µL 荧光染色工作液。
- 上下吹打 1 次以混匀。
- 尽快将细胞培养板放入酶标仪中，使 hiPSC-CM 适应仪器内的温度环境。
- 在开始数据采集前等待 60 分钟。
- 在酶标仪软件中启动数据采集，以至少 10 Hz 的采样频率记录 2 分钟的钙波信号，以确定每个孔的基础搏动频率。
注意：每次记录过程中，确保细胞培养板在数据采集结束后不会被自动移出仪器，以避免细胞板在室温下冷却。在某些版本的酶标仪软件中，可能需要在每次记录完全结束前手动停止，以实现此目的。 - 通过酶标仪的机械臂，使用移液器将化合物板中的化合物逐孔加入细胞板中，每孔加入 5 µL（加样后 DMSO 的终浓度为 0.3% [v/v]）。
- 在化合物加入后约 5、15、30、45 和 60 分钟，分别启动酶标仪软件进行数据采集，每次记录 2 分钟的钙波信号（每次均需确保细胞板保留在仪器内）。
4. 数据分析
注意：测量完成后可随时进行数据分析。
- 将每个记录时间段的原始数据从酶标仪软件导出为 ASCII 文本文件。
- 将原始数据导入数据分析软件。
- 针对每个孔和所有时间点，提取主搏动频率。
注意：使用本方案中列出的数据分析软件 材料表可以使用基于Lomb-Scargle最小二乘谱分析法的LombPeriodogram函数，通过自定义分析程序计算搏动频率7周期图应在 0.01 至 5 Hz 的频率范围内进行计算。可使用 PeakAutoFind 程序从周期图中提取主频率。该分析方法对搏动频率的测量比酶标仪软件自带的可选方法更为准确。然而，若无法进行软件定制，仍可使用后者。 - 从数据分析软件中将每个记录时段的主要搏动频率导出为剪贴板副本或 ASCII 文本文件。
- 通过剪贴板粘贴或文本文件导入，将主要搏动频率导入电子表格软件中。
注意：步骤 4.5–4.9 可在任何现代电子表格软件中执行。 - 对每个孔，将给药后各时间点（5、15、30、45 和 60 分钟）的搏动频率除以基线时的原始搏动频率，从而将各时间点的搏动频率相对于基线进行归一化处理。
- 通过计算加入药物后各时间点（5、15、30、45 和 60 分钟）20 个加有 DMSO 孔的归一化值的平均值，得出每个时间点的 DMSO 平均效应。
- 对每孔在加药后的每个时间点（5、15、30、45 和 60 分钟），减去同一块板上相应时间点的DMSO对照组平均效应值。
- 取重复测量值的平均数。
注意如果化合物加入后导致频率发生变化，或软件在加入化合物后无法找到主频，则可通过目视观察搏动模式来评估该化合物是否诱发了心律失常。
结果
图1 显示了一个384孔板在基线条件下钙波的代表性记录。大多数情况下，所有孔均表现出规律的搏动频率，板内差异较小（平均值 ± 标准差 = 40.1 ± 3.5 次/分钟；范围 = 34–54 次/分钟）。极少数情况下（每10次实验中少于1次），有少于5个孔出现心律失常或无节律搏动。在三个384孔板中，我们还尝试使用了另一家供应商提供的心肌细胞（见材料表），并获得了与自发性搏动相似的基线值。
心脏离子通道阻滞剂以可重复的方式影响心肌细胞的节律5。氨氯地平是一种慢钙通道阻滞剂9，在浓度达到1 µM时，以浓度依赖性方式使节律加速超过100%（图2A）。该效应在给药后5分钟内即明显出现，但在随后的30分钟内仍继续增加约50%，之后趋于稳定。当浓度高于1 µM时，氨氯地平会抑制搏动（虚线所示），这与其阻断钙循环从而抑制自发性收缩的作用机制相符。其他选择性二氢吡啶类钙通道阻滞剂也会产生非常相似的效果。
E-4031，一种快速延迟整流钾通道阻断剂10，使节律减慢约65–70%，呈浓度依赖性 10 µM (图2B）。该效应在最初5分钟内出现，并在随后的60分钟内保持稳定。其他选择性IKr阻滞剂也产生类似效应，尽管其最大减率幅度可能有所不同。例如, 35–顺丁烯二酸西沙必利为40%，E-4031为70%，多非利特为90%–95%。这种差异的原因尚不清楚。
河豚毒素是一种快速钠通道阻断剂11，在1–30 µM浓度范围内，以浓度依赖的方式使节律减慢约15%（图2C）。该效应在给药后5分钟内即充分显现，并在随后60分钟内无明显变化。然而，当浓度超过30 µM时，河豚毒素在给药后5分钟内即完全抑制搏动；而在给药30分钟后，浓度高于1 µM时即可抑制搏动。其他钠通道阻断剂（如利多卡因或美西律）也产生类似的全或无效应。
Bepridil 是一种对心脏 Na、Ca 和 K 通道具有混合阻断作用的药物9，同样会产生全或无效应（图 2D）。这表明在此实验条件下，Bepridil 的主要作用是阻断 Na 通道。由 Ca 通道阻断引起的加速效应未被观察到，而由 IKr 阻断导致的渐进性减慢效应似乎被 Na 通道的作用所掩盖。
图1：384孔板中典型的基线Ca²⁺波动。（A）板上所有孔均表现出规律的搏动频率，变异性极小。该图像直接截取自酶标仪软件。每条曲线持续时间为10秒。荧光强度为任意单位（由摄像机灰度值导出的相对光单位）。（B）此图为其中一条10秒曲线的放大图，显示信号噪声较低。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：心脏离子通道阻滞剂的代表性效应。 这些图显示了浓度-反应曲线，其中（A）为选择性钙通道阻滞剂氨氯地平，（B）为选择性IKr阻滞剂E-4031，（C）为选择性钠通道阻滞剂TTX，以及（D）为非选择性通道阻滞剂苄普利尔。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
成功记录搏动频率有两个最关键的方面。第一是细胞接种和培养过程需格外谨慎。特别是更换培养基时，应尽量避免刮伤孔底部的细胞层。允许移液器接触孔底，但每次应保持相同的角度，从而仅在细胞层上产生微小划痕，不影响检测结果。第二个获得可重复且均一节律的关键方面是在整个测量过程中，确保细胞培养板各区域的温度稳定在37 °C。使用除本实验所用酶标仪以外的设备时，我们无法实现这种均一性，但若对温度调控系统进行特殊改造，可能实现类似效果，从而使本方案不再局限于单一品牌的酶标仪，适用性更广。在本实验所用设备上实现温度稳定性时，必须在每次记录结束前手动停止；否则，机械臂会将已测量的细胞板弹出。这一技术问题可能在下一代酶标仪软件版本中得到解决，但目前仍至关重要。若细胞板被误移出酶标仪，必须尽快重新放回内部。然而，实验质量仍会下降，因为温度变化会极快地影响细胞搏动速率。
一些尚未经过充分测试的其他因素可能重要性较低。例如，hiPSC-CM 的生产商建议在接种细胞前对细胞培养板进行包被处理，但在本项特定检测中并未使用包被，因为这些细胞在多种表面上均能较容易地贴附，而且对 384 孔板进行适当包被非常困难。然而，细胞培养板的包被仍可能是可接受的，甚至可能提高检测的质量。我们从未测试过除 DMSO 以外的其他溶剂是否可行，但根据其他记录技术的经验，预计 EtOH 或 MeOH 在类似浓度下也是可耐受的。我们通常使用同一家制造商提供的 hiPSC-CM，仅测试过另一家供应商的细胞，结果显示其表现类似。同样，我们仅使用了少数几个不同的 hiPSC-CM 批次，这些批次均经过预先检测，以确认其行为与初始批次相似。有 1 至 2 个批次被认为不合适，因其在本实验所用培养条件下，同步收缩网络的稳定性和可重复性较差。此外，在测试一组有限的"典型"化合物（如佛司可林、N6-环戊基腺苷和 E-4031，以及内皮素、异丙肾上腺素、氨氯地平和波尼西莫德）时，不同批次间的药理学表现非常相似。我们仅使用了来自健康供体的 hiPSC-CM。评估来自心脏病患者诱导的 hiPSC-CM 是否会产生不同的结果可能是有价值的，尽管在评估酪氨酸激酶抑制剂的心脏毒性时，并未观察到健康供体与患者之间存在差异12。最后，我们在进行药物效应检测前通常会在培养中等待 22–28 天：根据我们对相同细胞进行阻抗记录的经验，慢阻抗（反映细胞层稳定性）和快阻抗（反映搏动频率）在培养 12–15 天后即达到稳态。然而，我们决定等待 22–28 天，因为此时心脏离子通道和成熟标志物的表达谱已趋于稳定13。尚未研究过若在更早或更晚时间点使用细胞是否可获得可比的结果。
本方案通过直接测量hiPSC-CM的自发搏动频率，评估药物对人类心脏电生理的潜在影响。相比其他方法，其主要优势在于：i）适用于高通量筛选环境；ii）可在生理温度下记录心肌细胞的活性及药物作用；iii）实验操作和结果评估均无需电生理学专业知识。
在一项使用多种已获批准用于人类的药物进行的验证研究中，我们证明了该检测方法对人类医学中所用药物的反应与现有临床数据的预测一致5。由于该方法考虑了对心脏节律的所有潜在影响，因此可作为综合体外致心律失常评估（Comprehensive in vitro Proarrhythmic assay, CiPA）倡议的补充，后者专门评估致心律失常潜力14。
未来，该方法可进一步阐明已知影响自发搏动频率的药物的作用机制。在钙瞬变的荧光记录中，很可能还存在额外的机制信息例如，其幅度或形状）发生变化。如果荧光记录以更高的采样速率进行（例如，30 Hz），除了搏动频率外，这些参数也易于提取，且将这些参数的变化与临床常用药物的已知效应进行关联分析可能具有重要意义。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| FDSS7000 荧光酶标仪 | Hamamatsu Photonics (Massy, France) | 非目录产品 | |
| FDSS7000 Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 荧光滤光片套件 | Hamamatsu Photonics (Massy, France) | 设备初始安装时配备 | |
| FDSS7000 温度控制模块 | Hamamatsu Photonics (Massy, France) | A10118-09 | |
| FDSS7000 150 W 激发光源单元 | Hamamatsu Photonics (Massy, France) | C11653-11 | |
| FDSS7000 384 孔板移液吸头 | Hamamatsu Photonics (Massy, France) | A8687-62 | |
| 心肌细胞波形分析软件 | Hamamatsu Photonics (Massy, France) | U8524-12 | Igor Pro 软件的可选替代方案 |
| Igor Pro 数据分析软件 | Wavemetrics (Portland, Oregon, USA) | 最新版本 | |
| iCell-心肌细胞试剂盒 | Cellular Dynamics International (Madison, WI) | R1106 | 包含细胞、铺板培养基和维持培养基 |
| Cor.4U 心肌细胞试剂盒 | Ncardia Germany (Cologne, Germany) | Ax-B-HC02-4M | 包含细胞、铺板培养基和维持培养基 可作为 iCell-心肌细胞试剂盒的替代品 |
| 384 孔细胞培养板 | Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany) | 781091 | |
| 384 孔化合物板 | Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany) | 781280 | |
| FLIPR Calcium 4 检测试剂盒 | Molecular Devices (Sunnyvale, California) | R8142 | |
| 佛司可林 | Sigma-Aldrich (Buchs, Switzerland) | F6886 | |
| N6-环戊基腺苷 | Sigma-Aldrich (Buchs, Switzerland) | C8031 | |
| E-4031 | Enzo Life Sciences (Lausen, Switzerland) | BML-KC158 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Gibco/ThermoFisher (Reinach, Switzerland) | 15140-122 | |
| 台盼蓝溶液，0.4% | Gibco/ThermoFisher (Reinach, Switzerland) | 15250061 |
参考文献
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