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猪全胰腺的分离与脱细胞化

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DOI：

10.3791/58302

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2018年10月10日

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, Institute of Clinical Sciences, Sahlgrenska Academy, University of Gothenburg, 2The Transplant Institute, Sahlgrenska University Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

由于胰腺具有外分泌和内分泌功能，全胰腺的组织工程一直是一项挑战。本文展示了一种完整猪胰腺的解剖方法，以及通过灌注去垢剂Triton X-100、脱氧胆酸钠和脱氧核糖核酸酶实现成功脱细胞的流程。

摘要

对整个胰腺进行组织工程改造有望改善目前对糖尿病的治疗。最终目标是利用同种异体或异种来源的细胞，结合人类细胞来实现胰腺的组织工程化。高效地分离、脱细胞以及再细胞化猪胰腺的方法展示将有助于推动该领域的发展。与人类胰腺类似，猪胰腺具有特殊的解剖结构，分为脾叶、十二指肠叶和连接部三个部分，被十二指肠和小肠环绕。胰腺的十二指肠叶通过多条小血管与十二指肠相连。由于胰腺兼具外分泌和内分泌功能，其组织工程化过程较为复杂。本文展示了一种详细的方案，用于完整分离猪胰腺，并使用去垢剂对其进行脱细胞处理，同时保留其结构及部分细胞外基质成分。为实现完全灌注，选择主动脉作为入口，门静脉作为出口。其他血管（肝动脉、脾静脉、脾动脉、 肠系膜动静脉分支）以及胆管均予以结扎。为防止血栓形成，需对猪进行肝素化处理，并在分离后立即用冷肝素溶液冲洗器官。为抑制外分泌酶的活性，胰腺脱细胞过程在 4 °C 下进行。脱细胞通过灌注 Triton X-100、脱氧胆酸钠和脱氧核糖核酸酶完成，并辅以间歇性及最终的充分洗涤。成功的脱细胞处理后，胰腺呈现白色，苏木精-伊红染色的组织学评估显示细胞核消失，而细胞外基质结构得以保留。因此，本研究所提出的方法可用于成功分离并脱细胞化完整的猪胰腺。

引言

糖尿病的特征是血液中葡萄糖水平升高，被大多数国家公认为一项重要的公共卫生挑战1。高血糖水平会影响血管和神经系统，导致眼睛、心脏、肾脏受损以及四肢缺血。传统治疗方法包括注射外源性胰岛素、药物治疗和生活方式改变。尽管尚无根治手段，但在某些情况下，现有治疗无法将胰岛素维持在治疗水平，从而导致高血糖。虽然胰岛或全胰腺移植可消除该疾病，但由于合适供体器官短缺，以及免疫抑制和包封技术带来的风险与困难，这类移植并不常见2。

目前，组织工程与再生医学领域的进步有望为解决上述问题提供方案。通过脱细胞技术，可去除人类或动物供体的细胞成分，同时保留支架中重要的细胞外基质（ECM）蛋白、生长因子和信号分子。此类支架在经受者自体非免疫原性干细胞重新接种后，有望在无需免疫抑制的情况下实现移植，从而恢复器官功能3,4。来源于同种异体或异种的组织工程器官可用于临床移植，因为主要的细胞外基质蛋白在不同物种间具有保守性，移植后可能不会引发排斥反应5。

脱细胞是一种经过深入研究的方法，通过在生理环境下合理利用物理力、化学去污剂和酶，去除组织或器官中的细胞和细胞核物质。再细胞化则是将细胞重新接种到无细胞器官中的过程。该过程在技术上具有较高挑战性，需要大量细胞、优化的细胞接种策略以及生物反应器系统，以在温度、压力和气体等符合生理条件的环境下培养器官6。

由于胰腺具有外分泌和内分泌功能，因此可被视为组织工程中较难处理的组织之一。外分泌组织分泌多种消化酶，而内分泌部分则分泌包括胰岛素在内的多种激素。已有研究报道，利用酶类（胰蛋白酶、脱氧核糖核酸酶 [DNase]）以及非离子型（Triton X-100）和离子型去污剂（脱氧胆酸钠 [SDC] 和十二烷基硫酸钠 [SDS]），对来自小鼠7,8、人类9和猪10的完整胰腺进行脱细胞处理。然而，按照已发表的实验方案操作时，我们在实现成功解剖、完全灌注和彻底脱细胞的同时，难以维持细胞外基质（ECM）结构的完整性。我们推测，脱细胞过程中使用的去污剂会导致细胞裂解，从而将消化酶释放到器官内部。这些释放出的酶会对ECM支架造成不可逆的损伤，使其在脱细胞和再细胞化过程中效率降低。因此，设计一种能够在有效脱细胞的同时抑制消化酶活性的方法，可能解决这一问题。我们采用了Peloso et al.提出的在低温条件下进行胰腺脱细胞的策略，尽管他们并未说明使用低温的原因9。同时，我们在解剖策略上参考了Taylor et al.的方法并加以改进，选择主动脉而非腹腔干（CT）和肠系膜上动脉（SMA）作为灌注入口11。

在最近发表的一篇文章12中，我们展示了一种有效分离并脱细胞化猪胰腺的方法，同时保留部分细胞外基质（ECM）成分。本文详细描述了如何解剖包含脾叶、十二指肠叶及连接叶的完整猪胰腺，并提供了一套逐步实现成功脱细胞化的操作方案。

方案

本实验所采用的猪胰腺解剖及脱细胞方法遵循哥德堡大学的伦理准则。

1. 脱细胞支架制备装置的准备

  1. 使用3 x 5 mm硅胶管，将洗涤剂入口容器、蠕动泵和器官室中的胰腺依次串联连接 通过 脱气装置（参见 图1将鲁尔接头公头连接至器官浴槽中管路的游离端。
  2. 使用另一根 3 x 5 mm 的硅胶管，将器官腔室连接至去污剂排出口容器 通过 蠕动泵收集灌注的洗涤剂。
  3. 将一支2 ml无标记移液枪连接到去污剂入口容器和去污剂出口容器管路的自由端。
  4. 保持整个装置于 4 °C.

器官脱细胞装置；蠕动泵、脱气装置、用于组织处理的器官室
图1：灌注装置的准备。 使用一根3 x 5 mm硅胶管，按照图示装置，将洗涤剂入口容器与蠕动泵、脱气装置和器官腔室依次串联连接。黑色箭头指示了从洗涤剂入口容器流向器官腔室的液体流动方向。对于洗涤剂出口，使用另一根3 x 5 mm硅胶管，将器官腔室连接 通过 蠕动泵连接至洗涤剂排液容器。红色箭头指示从器官腔室流向洗涤剂排液容器的液体流动方向。 请点击此处以查看此图的放大版本。

2. 脱细胞溶液的制备

  1. 溶液1（磷酸盐缓冲液 [PBS]）：将8 g（137 mM）氯化钠、0.2 g（2.7 mM）氯化钾、1.44 g（10 mM）磷酸钠和0.24 g（1.8 mM）磷酸钾加入1 L超纯水中，搅拌至溶解。用盐酸（HCl）调节pH至7.4。共需3.2 L该溶液。
  2. 溶液2（PBS + 肝素）：向1 L溶液1中加入3.4 mL肝素（17国际单位 [IU]/mL）。现配现用，并置于冰上冷却至低温。共需1.2 L该溶液。
  3. 溶液3（超纯水 + 叠氮化钠 + 乙二胺四乙酸二钠 [EDTA]）：向1 L超纯水中加入1.86 g（5 mM）EDTA和200 mg（0.02%）叠氮化钠。搅拌至盐类完全溶解。使用前将溶液冷却至4 °C。共需22 L该溶液。
  4. 溶液4（PBS + 叠氮化钠 + EDTA）：向1 L溶液1中加入200 mg（0.02%）叠氮化钠和1.86 g（5 mM）EDTA。搅拌至盐类完全溶解。使用前将溶液冷却至4 °C。共需1 L该溶液。
  5. 溶液5（超纯水 + 叠氮化钠）：向1 L超纯水中加入200 mg（0.02%）叠氮化钠。搅拌至盐类完全溶解。使用前将溶液冷却至4 °C。共需260 L该溶液。
    注意：EDTA会与SDC形成沉淀，因此溶液5中不添加EDTA，因其将用于SDC处理前后立即进行的洗涤步骤。
  6. 溶液6（SDC + Triton X-100）：向940 mL超纯水中加入40 g（4%）SDC、60 mL（6%）Triton X-100、200 mg（0.02%）叠氮化钠和69.6 mg（0.4 mM）苯甲基磺酰氟（PMSF）。搅拌至溶解。使用前将溶液冷却至4 °C。PMSF需在使用前加入。共需9.6 L该溶液。
  7. 溶液7（DNase）：将10,000 Kunitz单位的DNase-I溶于250 mL含CaCl2和MgCl2的Dulbecco's PBS中（终浓度为40 Kunitz单位/mL）。现配现用，立即使用。使用前将溶液预热至37 °C。
  8. 溶液8（PBS + 叠氮化钠）：向1 L溶液1中加入200 mg（0.02%）叠氮化钠。搅拌至盐类完全溶解。使用前将溶液冷却至4 °C。共需1 L该溶液。

3. 猪胰腺的解剖

注意：本研究中，猪胰腺来自农场饲养的雌性猪，体重为45 kg，在安乐死后经肝素化处理（400 IU/kg）。

  1. 将猪仰卧位放置于解剖台上。
  2. 使用手术刀从剑突向耻骨联合做一条正中切口（约40 cm），暴露所有腹腔器官。
  3. 定位脾叶、十二指肠叶和连接叶。
  4. 找到主十二指肠乳头水平位置，并在该位置近口侧使用两道单独缝线结扎十二指肠。
  5. 用两道单独缝线结扎食管下段，然后用剪刀在两道结扎线之间剪断，取出胃。
  6. 分离结肠周围的结缔组织，以暴露小肠。
  7. 分离结肠与胰腺脾叶相连的结缔组织。
  8. 结扎动脉后，将结肠从小肠上分离并移除。
  9. 找到肠系膜下静脉和肠系膜下动脉分支，在胰腺尾侧可见处用一道缝线同时结扎肠系膜下动、静脉。
  10. 在脾门靠近脾脏处，用一道缝线同时结扎脾动脉和脾静脉，然后用剪刀在其远端剪断，以切除脾脏。
  11. 沿十二指肠分离，直至十二指肠叶和连接叶完全游离，最后在末端用两道单独缝线结扎十二指肠。
  12. 游离门静脉，用一道缝线结扎以防止肝脏出血，并在结扎线近端剪断。门静脉在脱细胞过程中作为流出道。
  13. 游离并用两道缝线结扎胆管和肝动脉，然后在缝线远端剪断。
  14. 在肾静脉下方找到主动脉，并从肌肉和结缔组织中向头侧方向游离，直至胰腺区域。
  15. 轻柔翻转胰腺，游离主动脉，保留肠系膜上动脉（SMA）和腹腔干（CT）完整，然后用剪刀在腹腔干上方、肠系膜上动脉下方剪断主动脉。
  16. 用剪刀剪断周围剩余组织，取出胰腺。
  17. 使用连接4 mm动脉切开插管的50 mL注射器，经主动脉灌注溶液2，直至整个器官被充分灌注或器官完全变冷。

4. 脱细胞化猪胰腺的制备

  1. 整个过程中将胰腺保持在 4 °C 或置于冰上。
  2. 使用剪刀剪开十二指肠的缝线，用 25 mL 移液管冲洗 50 - 150 mL 超纯水以清除食物残渣，然后再次用缝线结扎。
  3. 用缝线结扎主动脉的一端以及除肠系膜上动脉（SMA）和腹腔干（CT）以外的所有分支，以防止泄漏。
  4. 从主动脉的另一端插入一根 4 mm 动脉切开插管，并用缝线结扎固定。
  5. 使用脱细胞装置以 20 mL/min 的流速用溶液 3 对胰腺灌注 1 小时。
    注意：预先用溶液 3 填充泵的管路，以确保无气泡进入胰腺。检查器官各个部位是否有泄漏，并用缝线结扎所有开放的血管分支，门静脉除外。
  6. 将胰腺在溶液 4 中于 -20 °C 冷冻，直至开始脱细胞处理。

5. 猪胰腺的脱细胞处理

  1. 在 4 °C 下解冻胰腺。
  2. 在脱细胞化装置中，以 Solution 3 以 20 mL/min 的流速运行蠕动泵，直至去污剂入口管中无气泡出现。
  3. 将胰腺放入脱细胞化容器中，并将去污剂入口管连接至胰腺的主动脉。以 Solution 3 在 4 °C 下以 20 mL/min 的流速灌注器官过夜。
  4. 倒掉器官腔室中残留的溶液。
  5. 将 Solution 3 更换为 Solution 5，并在 4 °C 下以 20 mL/min 的流速灌注胰腺 30 分钟。倒掉器官腔室中的溶液。
  6. 加入 Solution 6，并在 4 °C 下以 20 mL/min 的流速灌注胰腺 8 小时。倒掉器官腔室中的溶液。
  7. 以 Solution 5 在 4 °C 下以 20 mL/min 的流速灌注器官 96 小时进行洗涤。倒掉器官腔室中的溶液。
  8. 通过在 37 °C 下循环 500 mL 含 CaCl2 和 MgCl2 的 Dulbecco 磷酸盐缓冲液 30 分钟，准备胰腺进行 DNase 处理。倒掉器官腔室中的溶液。
  9. 加入 250 mL 的 Solution 7，并在 37 °C 下以 20 mL/min 的流速灌注胰腺 4 小时。倒掉器官腔室中的溶液。
  10. 以 Solution 5 在 4 °C 下以 20 mL/min 的流速灌注器官 120 小时进行洗涤。
  11. 将器官短期储存在 4 °C 的 Solution 8 中，或长期储存在 -20 °C 的 Solution 8 中。

6. 脱细胞化的验证

  1. 使用剪刀从胰腺的所有叶中切取 3 至 10 mm 的活检组织，并在室温下用甲醛固定 48 小时。
  2. 用超纯水清洗组织块 15 分钟，按照标准方案将其置于组织处理机中进行处理，然后包埋于石蜡中。
  3. 使用切片机切取 5-µm 厚的切片，并按照标准方案采用 Mayer 苏木精和 0.2% 酒精伊红（HE）染色。
  4. 在光学显微镜下观察切片，检查细胞核是否丢失。
    注意：可将新鲜组织以相同方式处理后的样本作为对照，用于检测细胞核是否存在。

结果

代表性猪胰腺解剖图像如图2A、2B和2C（黄色箭头所示）所示，有助于定位和解剖肠系膜下动脉和静脉分支、门静脉、肝动脉、胆管以及分叉至腹腔干（CT）和肠系膜上动脉（SMA）的主动脉。 图3A显示了正常胰腺的大体形态，呈淡粉色，包含脾叶、连接部和十二指肠叶。脱细胞处理后，胰腺失去粉红色，呈现苍白白色。脱细胞胰腺的大体形态图像显示其仍保留脾叶、连接部和十二指肠叶，如图3B所示。图3C显示经HE染色后，正常胰腺中存在大量蓝色细胞核。而在脱细胞胰腺中，HE染色显示细胞核消失，未见蓝色细胞核（图3D）。

显示血管解剖结构的解剖示意图，其中动脉、静脉和胆管被突出显示。
图 2：猪胰腺解剖图像。（A）肠系膜下动脉和静脉分支的位置（黄色箭头）。（B）门静脉、肝动脉和胆管的结扎（黄色箭头）。（C）腹主动脉分出腹腔干和肠系膜上动脉（黄色箭头）。请点击此处查看该图的放大版本。

组织样本解剖结构与组织学图像；形态结构比较；显微镜观察
图 3：正常胰腺与脱细胞胰腺的大体形态学及苏木精-伊红（HE）染色结果。 （A）正常胰腺的大体形态。（B）脱细胞胰腺的大体形态。（C）HE 染色显示正常胰腺中存在蓝色细胞核。（D）HE 染色显示脱细胞胰腺中无蓝色细胞核。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本方案采用在 4 °C 条件下灌注 SDC 和 Triton X-100 的方法，可成功实现猪全胰腺的去细胞化。该技术的关键挑战在于完整分离包含全部三个叶的胰腺组织，同时避免损伤实质及其供血血管，并需结扎标本的其他血管分支，以确保器官灌注过程中无泄漏。猪胰腺的解剖结构与人类胰腺不同，其由三个叶组成，并通过部分包绕小肠而与其紧密接触。由于胰腺中有数条小血管与肠道相连，我们在解剖时将十二指肠与胰腺一并分离。在优化实验过程中发现，若钝性切断这些血管，会导致灌注液泄漏及灌注不完全。

由于主动脉通过腹腔干动脉和肠系膜上动脉与胰腺相连，我们选择主动脉作为灌注入口，仅使用一根插管，即单一入口，以简化灌注操作。根据我们的经验，在腹腔干动脉上方和肠系膜上动脉下方结扎主动脉，可缩短解剖时间，并降低损伤这两条血管的风险。除了使用肝素化的猪外，我们还注意到，用冷肝素进行灌注 通过 解剖后立即对主动脉进行灌注有助于使灌注液充分流经整个器官。我们推测，这可能是通过防止血管内形成血栓而实现的。解剖后立即用超纯水对胰腺进行初始灌注，可裂解红细胞并清除器官内的血液残留物，从而防止血栓形成。此过程还可用于发现任何未结扎的小静脉或小动脉分支，因为血流在背景衬托下易于观察。

我们选择在整个脱细胞过程中保持低温条件（4 °C），因为这可以抑制胰腺外分泌细胞释放的外分泌酶的活性。若不加以抑制，这些外分泌酶可能对细胞和细胞外基质（ECM）产生有害影响，因其能够降解细胞膜和蛋白质12。由于冷冻和解冻可有效破裂细胞，我们在洗涤步骤中加入了冻融环节，甚至在灌注去垢剂之前就已进行4,13。解冻后的初始洗涤步骤可清除细胞破裂后的残留物。我们所采用的去垢剂处理方案包含十二烷基硫酸胆碱钠（SDC）和Triton X-100，其浓度异常高，并以较高的灌注速度进行。我们选择这种方法是为了通过快速清除会破坏ECM的外分泌细胞，从而实现更快的脱细胞效果。我们推测，快速而强烈的处理方案有利于胰腺脱细胞，因为胰腺酶与ECM相互作用的时间更短，从而有助于保留良好的ECM成分。为了进一步保护ECM成分，我们还在去垢剂溶液中添加了丝氨酸蛋白酶抑制剂（PMSF），以抑制外分泌细胞释放的酶的活化14。此外，在所有脱细胞溶液中均加入叠氮化钠，因其具有抑菌作用，可降低细菌污染的风险15。

采用本方案脱细胞处理后的胰腺显示出细胞外基质（ECM）结构以及ECM蛋白胶原蛋白和弹性蛋白的良好保留。然而，在脱细胞胰腺中观察到糖胺聚糖显著减少。以这种方式脱细胞的胰腺在人胎儿胰腺干细胞的黏附能力方面也显示出潜力，并且在重新接种细胞14天后的组织片段中检测到外分泌和内分泌标志物的表达12。然而，要生成完整且具有功能的胰腺，仍需进一步研究以评估合适的细胞来源、细胞类型、接种策略以及生物反应器培养条件。

披露

S.S.H. 持有 Verigraft 公司的股份，该公司已获得血管组织工程技术的许可。其他作者无任何利益冲突披露。

致谢

本研究由瑞典政府LUA ALF基金授予S.S.H.的资助项目资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4 mm DLP 动脉切开插管Medtronic31104
2 ml 未标记移液管vWR612-3720
脱气装置Biotech AB0001-6484
DNase-IWorthingtonLS0020007
含 CaCl2 和 MgCl2 的杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）Sigma AldrichD8662
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA disodium salt dihydrate）AlfaAesarA15161.OB
肝素Leo387107
带内径为 1/8" 接头的鲁尔接头公头OinaLM-2PP-QC用于 3×5 mm 硅胶管
蠕动泵OinaSP-1X4
PMSFRoche10837091001在水溶液中不稳定，应在灌注前新鲜配制并加入
氯化钾Sigma AldrichP5405
磷酸氢二钾Sigma AldrichP9791
SDCSigma Aldrich30970
3×5 mm 硅胶管VWR2280706
叠氮化钠Sigma Aldrich71290
氯化钠Sigma Aldrich13423
磷酸氢二钠Merck71640-M
缝合线Vömel14817
50 mL 注射器Becton Dickinson300137
Triton-X-100AlfaAesarA16046.OF

参考文献

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