制备肾皮质细胞外基质来源水凝胶

摘要

本文介绍了一种利用肾脏皮质细胞外基质制备水凝胶的方案，以保留天然肾脏细胞外基质（ECM）的结构和生化组成。文中描述了该水凝胶的制备过程及其应用。最后，探讨了利用该水凝胶支持肾脏特异性细胞与组织再生及生物工程构建的前景。

摘要

细胞外基质（ECM）提供重要的生物物理和生化信号，以维持组织稳态。现有的合成水凝胶可为 体外 细胞培养环境，但缺乏诱导细胞产生生理行为所必需的蛋白质和配体组成。本文描述了一种源自肾脏皮质细胞外基质（ECM）的水凝胶制备方法，该水凝胶具有适当的机械强度和支持性的生化组成。该水凝胶通过机械匀浆和溶解脱细胞的人肾脏皮质ECM制备而成。该基质保留了天然肾脏皮质ECM的蛋白质比例，同时能够形成具有生理机械刚度的凝胶。该水凝胶可作为基底，用于在生理条件下维持源自肾脏皮质的细胞。此外，可通过调控水凝胶的组成以模拟疾病环境，从而为未来研究肾脏疾病提供可能。

引言

细胞外基质（ECM）提供重要的生物物理和生化信号，以维持组织稳态。其复杂的分子组成调控着组织的结构与功能特性。结构蛋白为细胞提供空间感知能力，并支持细胞黏附与迁移。¹结合的配体与细胞表面受体相互作用以调控细胞行为²肾脏细胞外基质含有大量分子，其组成和结构因解剖位置、发育阶段和疾病状态而异^3,4重现细胞外基质（ECM）的复杂性是研究肾源性细胞的关键方面 体外.

先前尝试模拟细胞外基质（ECM）微环境主要集中在对完整组织进行脱细胞处理，以制备可重新接种细胞的支架。脱细胞处理通常使用化学去垢剂，如十二烷基硫酸钠（SDS）或非离子型去垢剂，并采用器官整体灌注或浸没振荡的方法进行。^{5,6,7,8,9,10,11....}

方案

人类肾脏由 LifeCenter Northwest 按照器官获取组织协会制定的伦理准则分离获得。本方案遵循华盛顿大学规定的动物护理和细胞培养指南。

1. 人肾组织的制备

1. 脱细胞溶液的制备
   1. 对一个5000 mL烧杯和一根70 x 10 mm搅拌子进行灭菌处理。
   2. 在烧杯中将十二烷基硫酸钠（SDS）按1:1000（重量:体积）的比例溶于经高压灭菌的去离子水中。将溶液置于搅拌台上，以约200 rpm的速度搅拌24小时，或直至SDS完全溶解。
      注意：通常，2500 mL的1% SDS溶液足以对一个完整的人类肾脏进行脱细胞处理。
   3. 将溶液转移至500 mL无菌真空滤器中，过滤后收集到已灭菌的可密封容器中。
2. 肾脏组织的处理
   1. 清洗并高压灭菌一对镊子、两个止血钳、一对通用剪刀、两个手术刀片手柄、一个用铝箔覆盖的1000 mL烧杯，以及一根36 x 9 mm搅拌子。
   2. 在组织培养超净台内铺上吸水垫。将烧杯、一个无菌组织培养皿（150 x 25 mm）和完整的肾脏器官放入超净台中。向烧杯中加入500 mL的1% SDS溶液。
      注意：人类肾脏由LifeCenter NorthWest提供，运输过程中保持冰上保存。
   3. 将肾脏置于无菌组织培养皿中（

结果

kECM水凝胶提供了一种化学成分与天然肾脏微环境相似的基质，用于肾脏细胞培养。制备该水凝胶时，首先从完整肾脏器官中机械分离出肾皮质组织并进行切碎（图1）。使用化学去污剂对组织进行脱细胞处理（图2A.1-A.3），随后用清水冲洗以去除去污剂颗粒（图2A.4-A.6），从而获得分离的肾皮质ECM。组织学评估证实，典型的基底膜蛋白（如胶原蛋白-IV和层粘连蛋白）以及结构蛋白（如胶原蛋白-I）均得以保留，仅纤连蛋白有所缺失（图2B）。此外，ECM中的蛋白质组成（包括亚型的保留）与天然肾ECM中观察到的数值一致（图3）。将ECM（图4A）进行机械均质化和冷冻干燥.......

讨论

基质提供了调控细胞行为的重要力学和化学信号。合成水凝胶能够支持复杂的三维图案化，但无法提供生理基质微环境中存在的多样化细胞外信号。来源于天然细胞外基质（ECM）的水凝胶是进行体内（in vivo）和体外（in vitro）研究的理想材料。以往的研究已利用去细胞化ECM水凝胶来包覆合成生物材料，以防止宿主产生免疫反应^33,34，诱导干细胞分化^35,36,37,38，作为二维培养和软光刻细胞培养的基底^39,40,41,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
肾脏组织制备
5000 mL 烧杯	Sigma-Aldrich	Z740589
十二烷基硫酸钠（SDS）	Sigma-Aldrich	436143
无菌 H2O			经高压灭菌的去离子 H2O
搅拌子（70 x 10 mm）	Fisher Science	14-512-128
500 mL 真空滤器	VWR	97066-202
搅拌板	Sigma-Aldrich	CLS6795420D
1000 mL 烧杯	Sigma-Aldrich	CLS10031L
镊子	Sigma-Aldrich	F4642	可使用任何类似的镊子
剪刀式止血钳	Sigma-Aldrich	Z168866
解剖剪	Sigma-Aldrich	Z265977
4号手术刀柄	VWR	25859-000	可使用任何类似的手术刀柄
20号手术刀片	VWR	25860-020	可使用任何类似的手术刀片
搅拌子（38.1 x 9.5 mm）	Fisher Science	14-513-52
吸水垫	VWR	82020-845
培养皿（150 x 25 mm）	Corning	430597
可高压灭菌的生物危害袋	VWR	14220-026
无菌细胞筛（40 µm）	Fisher Science	22-363-547
细胞培养级水	HyClone	SH30529.03
30 mL 独立管	VWR	89012-778
ECM凝胶制备
组织匀浆机	Polytron	PCU-20110
冷冻干燥机	Labconco	7670520
20 mL 玻璃闪烁瓶及瓶盖	Sigma-Aldrich	V7130
搅拌子（15.9 x 8 mm）	Fisher Science	14-513-62
猪胃黏膜来源胃蛋白酶	Sigma-Aldrich	P7012
0.01 N HCl	Sigma-Aldrich	320331	用细胞培养用水稀释至0.01 N HCl
肾脏ECM凝胶化
1 N NaOH（无菌）	Sigma-Aldrich	415413	用细胞培养级水稀释至1 N
199培养基	Sigma-Aldrich	M4530
15 mL 圆锥形离心管	ThermoFisher	339651
细胞培养基	ThermoFisher	11330.032	DMEM/F12培养基（Dulbecco改良Eagle培养基：营养混合物F-12）
胎牛血清（FBS）	Gibco	10082147
抗生素-抗真菌剂（100X）	Life Technologies	15240-062
胰岛素-转铁蛋白-硒-丙酮酸钠溶液（ITS-A，100X）	Life Technologies	51300-044
1 mL 注射器	Sigma-Aldrich	Z192325
微型刮勺	Sigma-Aldrich	Z193208