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方法文章

高纯度凋亡小体的检测与分离

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DOI：

10.3791/58317

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2018年8月12日

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Genetics, La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University

本文内容

摘要

建立了一种利用流式细胞术或差速离心的实验流程，用于从凋亡样本中高纯度地检测、定量和分离凋亡小体。

摘要

凋亡小体（ApoBDs）、微囊泡和外泌体是细胞外囊泡家族中的主要成员，其中ApoBDs是体积最大的类型之一。已有研究提出，ApoBDs可通过运输生物分子来促进细胞清除以及细胞间通讯。目前用于ApoBDs鉴定与分离的传统方法常受限于定量不准确和样品纯度低的问题。本文介绍了一种用于确认凋亡诱导、验证ApoBDs形成并实现高纯度分离ApoBDs的工作流程。我们还将概述并比较基于荧光激活细胞分选（FACS）和差速离心的ApoBDs分离方法。此外，将采用已建立的基于流式细胞术的染色与分析方法，对分离所得ApoBDs的纯度进行验证。综上所述，通过该方法成功诱导并验证了THP-1单核细胞的凋亡及其凋亡后细胞解体过程，并从THP-1单核细胞中分离获得了纯度达97–99%的ApoBDs。

引言

细胞凋亡是一种被广泛研究的程序性细胞死亡形式，对于维持人体生理稳态以及清除潜在有害细胞至关重要1。在细胞凋亡被诱导后，凋亡细胞（ApoCells）会经历一系列形态学变化，并解体为称为凋亡小体（ApoBDs）的小型膜结合囊泡。总体而言，该过程被称为凋亡细胞解体，可根据形态学特征分为三个明确的阶段2,3。第一阶段（质膜出泡）的特征是细胞表面形成类似气球状的结构，称为出泡（blebs）4,5。第二阶段（凋亡突起形成）包括形成长的膜突起，例如凋亡丝状突起（apoptopodia）、串珠状凋亡丝状突起（beaded-apoptopodia）和微管 spike（microtubule spikes）6,7,8。最后，第三阶段（ApoBD 形成）包括凋亡突起和/或凋亡细胞的断裂，从而生成 ApoBDs6,9。先前的研究结果提示，ApoBDs 在促进凋亡细胞清除及介导细胞间通讯方面具有重要作用。例如，有研究提出，凋亡细胞断裂为 ApoBDs 可产生较小的“可入口大小”的片段，便于周围吞噬细胞清除2,10,11。此外，ApoBDs 可能携带一系列生物分子，如 DNA、RNA 和蛋白质，这些分子可被转运至邻近细胞，从而促进细胞间通讯12,13,14。为了对这些过程进行功能性研究，必须确认三个关键参数：（i）验证凋亡的诱导及 ApoBD 的形成，（ii）ApoBD 的分离，以及（iii）ApoBD 纯度的确认。

此前，已有多种方法被用于研究细胞凋亡及凋亡小体（ApoBDs），包括流式细胞术和电子显微镜15,16,17,18。然而，ApoBD的检测与定量通常较为困难，或常被忽视。例如，目前最常用的基于流式细胞术的细胞凋亡检测方法采用膜联蛋白V（A5，一种可结合外翻的“吃我”信号磷脂酰丝氨酸（PtdSer）的蛋白）和核酸染料碘化丙啶（PI）19。但使用这种通用染色组合时，分析通常默认样本中仅存在三类细胞亚群（活细胞、凋亡细胞（ApoCells）和坏死细胞）。此外，尽管许多研究者将流式细胞术检测及其后续数据分析视为细胞凋亡研究的"金标准"，但该方法通常在初始设门步骤中通过选择FSC/SSCintermediate-high事件而排除了ApoBDs。因此，我们近期开发了一种新型流式细胞术检测方法，联合使用A5与TO-PRO-3（另一种可被caspase 3/7激活的pannexin 1（PANX1）通道选择性摄取的核酸染料）7,20。由于caspase 3诱导的PANX1激活发生在细胞凋亡早期PtdSer暴露之前，TO-PRO-3可对凋亡细胞与坏死细胞进行差异化染色。此外，该方法结合我们提出的新型设门策略，在数据分析过程中纳入所有获取的事件，从而可识别出六类细胞/颗粒亚群，包括：(i) 活细胞（FSC/SSCintermediate/high，A5low，TO-PRO-3low）；(ii) A5-早期凋亡细胞（FSC/SSCintermediate/high，A5low，TO-PRO-3intermediate）；(iii) A5+凋亡细胞（FSC/SSCintermediate/high，A5high，TO-PRO-3intermediate）；(iv) 坏死细胞或晚期凋亡细胞（FSC/SSCintermediate/high，A5high，TO-PRO-3high）；(v) 凋亡小体（ApoBDs）（FSC/SSClow，A5intermediate，TO-PRO-3low/intermediate）；以及(vi) 碎片（FSC/SSClow，A5low，TO-PRO-3low）20。该方法强调了分析所有细胞/颗粒亚群的重要性，更重要的是实现了ApoBDs与细胞及碎片的有效分离20。因此，该方法展示了一种可同时验证细胞凋亡诱导及ApoBD形成的高效技术。

传统上，凋亡小体（ApoBDs）的分离主要通过多种差速离心方法实现，这些方法可根据密度将ApoBDs与细胞或其他细胞外囊泡分离开。然而，此类离心方法通常受限于ApoBDs纯度较低、缺乏用于确认样品纯度的定量步骤，和/或无法分离特定细胞类型的ApoBDs17,21,22。因此，我们近期开发了两种新方法：一种基于流式细胞分选（FACS）的方法，以及一种新的基于差速离心的方法，这两种方法均可与我们先前建立的流式细胞术方法联用，以验证细胞凋亡的诱导及样品纯度23。通过基于FACS的方法分离ApoBDs，可将其纯度富集至高达99%，并可结合多种细胞类型特异性抗体，从混合细胞群体、组织样本及体液中分离ApoBDs23。此外，我们改进后的差速离心方法可高效地将ApoBDs分离至>90%的纯度23。

本文详细描述了我们用于验证细胞凋亡诱导以及检测和定量凋亡小体（ApoBD）形成的实验流程。同时，我们还阐述并比较了基于流式细胞术分选和差速离心法的ApoBD分离操作流程。代表性数据表明，所述方法为未来的ApoBD研究提供了一种高效且前沿的技术工具。

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方案

1. 诱导细胞凋亡

  1. 以 300 × g 离心细胞样品 5 分钟，弃上清液以去除任何预先存在的细胞碎片。
    注意：使用贴壁细胞时，应提前接种细胞，并在诱导凋亡前用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。
  2. 确定细胞数量并收集细胞。
    注意：根据分离后的检测方法，我们建议起始细胞数量至少为 1 x 107 细胞
  3. 用完全培养基（含10% (vol/vol) 胎牛血清、50 IU/mL 青霉素、50 µg/mL 链霉素的相应培养基）重悬，最终浓度为 1 × 10⁶ 细胞/mL6 cells/mL
  4. 分装约 2 x 106 每孔细胞数（6 孔板）
  5. 为诱导细胞凋亡，移去培养板盖后，以150 mJ/cm²的剂量照射细胞2 使用紫外照射仪进行照射，时间约为30-60秒。
    注意：照射前，确保细胞数量约为 0.5 x 106 细胞被保留作为“未处理”细胞对照。
    注意：凋亡也可通过其他方法诱导，例如抗Fas处理或血清剥夺6.
  6. 37°C、5% CO₂ 条件下孵育2 根据细胞系的不同，孵育时间为2-8小时。
  7. 使用台式光学显微镜观察细胞，确认是否存在凋亡形态学特征，例如膜泡形成、凋亡突起（apoptopodia）及凋亡小体（ApoBD）的形成。
    注意：40倍放大倍数已足够
  8. 使用 P1000 移液器吸取并收集凋亡样本。
  9. 用1×PBS洗涤平板，并与剩余样品合并，以确保获得最大产量。
  10. 收集约1/10th 用于“全凋亡样本”（WAS）对照。
  11. 收集“未处理”样品。
  12. 将WAS样品和未处理样品在3,000 × g离心6分钟。
  13. 用1 mL 1×PBS重悬，置于冰上备用。
  14. 对于ApoBD的分离，将剩余的凋亡样品继续进行步骤2或步骤3。

2. 通过流式细胞术分离ApoBD

  1. 将整个样品在 3,000 x g 条件下离心 6 分钟。
  2. 去除大部分上清液，注意不要扰动沉淀。
  3. 用染色液重悬沉淀，每 1×107 个细胞加入 1 mL 1x A5 结合缓冲液、75 µL A5-FITC 和 2 µL TO-PRO-3。
  4. 将样品在室温避光条件下孵育 10 分钟。
  5. 加入 1–2 mL 1x A5 结合缓冲液，并在 3,000 x g 条件下离心 6 分钟，以去除过量染料。
    注意：对于混合细胞群体或组织样本，在 3,000 x g 离心 6 分钟前，需在 1x A5 结合缓冲液中加入特异性细胞标志物抗体组合进行染色，并在冰上孵育 20 分钟（或按照试剂生产商说明书操作）。
  6. 将样品沉淀用 FACS 缓冲液重悬，每 1×107 个细胞加入 3 mL FACS 缓冲液（1x PBS、1x A5 结合缓冲液、10% FSC、2 mM EDTA）。
  7. 通过 70 µm 细胞滤网过滤至圆底聚丙烯（流式细胞术）管中，样品置于冰上并避光保存。
  8. 打开流式分选仪，使用 100 µm 喷嘴进行标准仪器设置，完成液滴延迟校准，并确保液流稳定。
  9. 加载样品，并将采集速度设置为约 1000 个事件/秒。
  10. 调节 FSC、SSC、APC（TO-PRO-3）和 FITC（A5）电压，使事件在流式图中合理分布，确保各细胞群可被清晰区分。
  11. 记录 20,000 个事件。
  12. 按照第 4 部分的方法设置门控策略。
  13. 在分选布局中，将最终的 ApoBD 门设为待分选的目标细胞群。
  14. 开始采集样品，并通过收集 5,000–10,000 个 ApoBD 至含有约 250 µL FACS 缓冲液的新管中，进行测试性分选。
  15. 执行系统反向冲洗，并加载已分选的 ApoBD。
  16. 采集并记录测试性分选的 ApoBD。
  17. 通过比较 FSC（y 轴）与 A5（x 轴事件）验证 ApoBD 纯度是否达到约 99%。
    注意：由于激光漂白作用，重新分析样品时 A5 染色强度可能略有下降。
  18. 当达到高纯度后，加载原始样品并继续分选，直至获得所需数量的 ApoBD。
    注意：如有需要，可进行双分选以同时分离 ApoCells 和 ApoBDs。
    注意：若长时间分选，建议将收集管置于 4 °C 条件下孵育。
  19. 分选完成后，收集少量分选后 ApoBD、分选后 ApoCells、未处理组和 WAS 样品，用于验证凋亡情况并确认分选后纯度。
    注意：尽管测试分选与最终分选的纯度不应有显著差异，但该结果依赖于液流设置和稳定性。

3. 通过差速离心法分离ApoBD

  1. 将剩余的凋亡样品在 300 x g 条件下离心 10 分钟。
  2. 收集上清液，留下约 500 µL 以避免扰动细胞沉淀，并将其转移至新的 15 mL 圆锥形离心管中。
  3. 移除剩余的 500 µL 上清液，并将细胞沉淀重悬于 2 mL 的 1x PBS 中（此为“ApoCell 富集组分”）。
  4. 将收集的上清液在 3,000 g 条件下离心 20 分钟。
  5. 检查是否有沉淀形成，并小心移除上清液（上清液中可能含有包括微囊泡和外泌体在内的小型细胞外囊泡）。
  6. 将沉淀重悬于 1 mL 的 1x PBS 中（此为“ApoBD 富集”组分）。
  7. 分别取 100 µL 的活细胞、WAS、ApoCell 富集和 ApoBD 富集样品，加入新的圆底聚苯乙烯（流式细胞术）管中。
  8. 加入 100 µL 染色液，其中包含 2x A5 结合缓冲液、1:100 稀释的 A5-FITC 和 1:1,000 稀释的 TO-PRO-3。
  9. 室温避光孵育 10 分钟。
  10. 通过流式细胞术分析样品，采用上述所述的设门策略，以验证凋亡的成功诱导以及 ApoBD 富集组分的纯度。

4. 流式细胞术设门策略

  1. 以TO-PRO-3为纵轴（y轴），FSC为横轴（x轴）作图，以区分坏死细胞（TO-PRO-3high）与所有其他非通透性事件（TO-PRO-3low/intermediate）。
  2. 选择所有非通透性事件，并以SSC为横轴、A5为纵轴作图。圈定两个群体：群体1（P1），即SSC中等/高、A5低/中等的细胞；以及群体2（P2），即所有其他事件。
  3. 从P2中，以TO-PRO-3为纵轴、A5为横轴作图，并选择A5中等/高事件，以排除所有细胞碎片。
  4. 选择所有A5阳性事件，并以FSC为横轴、A5为纵轴作图。将凋亡小体（ApoBDs，FSC低）与凋亡细胞（ApoCells，FSC中等/高）区分开。
    注意：当通过基于FACS的方法圈选ApoBDs以进行ApoBD分离时，我们建议最后一步选择ApoBDs后，再以TO-PRO-3对A5作图并选择所有事件，以确保最终分选门控依赖荧光信号而非FSC/SSC参数。
  5. 对于活细胞分析，选择P1并采用以下两种门控策略之一。对于常规活细胞分析，以FSC为横轴、A5为纵轴作图，并选择所有FSC中等/高细胞，从而去除残留的细胞碎片。或者，对于深入分析，可通过以TO-PRO-3对FSC作图，将活细胞与A5-早期凋亡细胞（early ApoCells）区分开。选择TO-PRO-3低、FSC中等/高的活细胞，以及TO-PRO-3中等、FSC中等/高的A5-早期凋亡细胞。

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结果

根据本文所述方法，诱导THP-1单核细胞发生凋亡，并通过基于流式细胞术（FACS）或差速离心的方法检测和分离凋亡小体（ApoBDs）（图1）。首先，通过紫外线（UV）照射诱导细胞凋亡，在孵育2–3小时后收集样本，此时细胞已呈现典型的凋亡形态学特征，包括膜出泡、凋亡膜突起形成以及凋亡小体的产生6。采用TO-PRO-3和A5标记的流式细胞术方法，将活细胞、坏死细胞、早期凋亡细胞（early ApoCells）、凋亡细胞（ApoCells）、凋亡小体（ApoBDs）及细胞碎片进行区分，从而确认单核细胞凋亡及凋亡小体的形成（图2）。综合流式细胞术分析结果表明，UV处理可导致约20%的细胞变为凋亡细胞（ApoCells）（图3）。

然后通...

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讨论

自20世纪50年代首次描述以来，细胞凋亡领域已取得显著进展，成为重要的研究方向。尽管该领域受到广泛关注并投入了大量研究努力，但由于缺乏适当的方法学，细胞凋亡的某些方面——特别是凋亡小体（ApoBDs）的形成——仍未得到充分研究。这些问题突出表现为传统Annexin V/PI流式细胞术分析难以同时追踪细胞凋亡进程和ApoBD的形成，以及ApoBD分离纯度不足。我们近期已开发出若干方法，以解决这些技术上的局限性。

我们基于流式细胞术的新型分析方法能够检测和定量传统分析方法常忽略的凋亡小体（ApoBDs）20。此外，这种经改进的流式细胞术方法结合使用染料TO-PRO-3，揭示了一种额外的A5-早期凋亡阶段，从而更清晰地界定凋亡进程20。传统上，ApoBD的检测主要依赖基于成像的技术，如共聚焦显微镜和组织学方法，而我们的流式细胞术则提供了一种高通量定量ApoBD形成的手段。尽管该方法看似复杂，但实际操作相对简便，仅需 commercially available 试剂和一台...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了澳大利亚国家健康与医学研究委员会（GNT1125033 和 GNT1140187）以及澳大利亚研究理事会（DP170103790）向 I.K.H.P. 提供的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞，例如培养的人源 THP-1 单核细胞（克隆编号：TIB-202）ATCC-
RPMI 1640 培养基Life Technologies22400-089
青霉素-链霉素混合液Life Technologies15140122
FSCGibco10099-141
1x PBS--
Annexin V FITCBD Bioscience-
TO-PRO-3 碘化物Life TechnologiesT3605TO-PRO-3 可能引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激。避免直接接触。
10x Annexin V 结合缓冲液BD Bioscience556454
EDTASigma-Aldrich1001710526
离心管（15 mL）Cellstar188271
微量离心管（1.5 mL）Sarstedt72.690.001
组织培养孵育箱（37 °C，5% CO2）--
离心机Beckman Coulter392932
FACS ARIA III 流式细胞仪，配备用于 FITC 和 APC 检测的两根激光器BD Bioscience-
FACS Canto II 流式细胞仪，配备用于 FITC 和 APC 检测的两根激光器BD Bioscience-
FACS Diva 6.1.1 软件BD Bioscience-
FlowJo 8.8.6 软件--
 UV Stratalinker 1800Stratagene-

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