建立了一种利用流式细胞术或差速离心的实验流程，用于从凋亡样本中高纯度地检测、定量和分离凋亡小体。
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本文内容
摘要
摘要
凋亡小体（ApoBDs）、微囊泡和外泌体是细胞外囊泡家族中的主要成员，其中ApoBDs是体积最大的类型之一。已有研究提出，ApoBDs可通过运输生物分子来促进细胞清除以及细胞间通讯。目前用于ApoBDs鉴定与分离的传统方法常受限于定量不准确和样品纯度低的问题。本文介绍了一种用于确认凋亡诱导、验证ApoBDs形成并实现高纯度分离ApoBDs的工作流程。我们还将概述并比较基于荧光激活细胞分选（FACS）和差速离心的ApoBDs分离方法。此外，将采用已建立的基于流式细胞术的染色与分析方法，对分离所得ApoBDs的纯度进行验证。综上所述，通过该方法成功诱导并验证了THP-1单核细胞的凋亡及其凋亡后细胞解体过程，并从THP-1单核细胞中分离获得了纯度达97–99%的ApoBDs。
引言
细胞凋亡是一种被广泛研究的程序性细胞死亡形式，对于维持人体生理稳态以及清除潜在有害细胞至关重要1。在细胞凋亡被诱导后，凋亡细胞（ApoCells）会经历一系列形态学变化，并解体为称为凋亡小体（ApoBDs）的小型膜结合囊泡。总体而言，该过程被称为凋亡细胞解体，可根据形态学特征分为三个明确的阶段2,3。第一阶段（质膜出泡）的特征是细胞表面形成类似气球状的结构，称为出泡（blebs）4,5。第二阶段（凋亡突起形成）包括形成长的膜突起，例如凋亡丝状突起（apoptopodia）、串珠状凋亡丝状突起（beaded-apoptopodia）和微管 spike（microtubule spikes）6,7,8。最后，第三阶段（ApoBD 形成）包括凋亡突起和/或凋亡细胞的断裂，从而生成 ApoBDs6,9。先前的研究结果提示，ApoBDs 在促进凋亡细胞清除及介导....
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方案
1. 诱导细胞凋亡
- 以 300 × g 离心细胞样品 5 分钟，弃上清液以去除任何预先存在的细胞碎片。
注意：使用贴壁细胞时，应提前接种细胞，并在诱导凋亡前用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。 - 确定细胞数量并收集细胞。
注意：根据分离后的检测方法，我们建议起始细胞数量至少为 1 x 107 细胞 - 用完全培养基（含10% (vol/vol) 胎牛血清、50 IU/mL 青霉素、50 µg/mL 链霉素的相应培养基）重悬，最终浓度为 1 × 10⁶ 细胞/mL6 cells/mL
- 分装约 2 x 106 每孔细胞数（6 孔板）
- 为诱导细胞凋亡，移去培养板盖后，以150 mJ/cm²的剂量照射细胞2 使用紫外照射仪进行照射，时间约为30-60秒。
注意：照射前，确保细胞数量约为 0.5 x 106 细胞被保留作为“未处理”细胞对照。
注意：凋亡也可通过其他方法诱导，例如抗Fas处理或血清剥夺6. - 37°C、5% CO₂ 条件下孵育2 根据细胞系的不同，孵育时间为2-8小时。
- 使用台式光学显微镜观察细胞，确认是否存在凋亡形态学特征，例如膜泡形成、凋亡突起（apopto....
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结果
根据本文所述方法，诱导THP-1单核细胞发生凋亡，并通过基于流式细胞术（FACS）或差速离心的方法检测和分离凋亡小体（ApoBDs）（图1）。首先，通过紫外线（UV）照射诱导细胞凋亡，在孵育2–3小时后收集样本，此时细胞已呈现典型的凋亡形态学特征，包括膜出泡、凋亡膜突起形成以及凋亡小体的产生6。采用TO-PRO-3和A5标记的流式细胞术方法，将活细胞、坏死细胞、早期凋亡细胞（early ApoCells）、凋亡细胞（ApoCells）、凋亡小体（ApoBDs）及细胞碎片进行区分，从而确认单核细胞凋亡及凋亡小体的形成（图2）。综合流式细胞术分析结果表明，UV处理可导致约20%的细胞变为凋亡细胞（ApoCells）（图3）。
然后通.......
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讨论
自20世纪50年代首次描述以来，细胞凋亡领域已取得显著进展，成为重要的研究方向。尽管该领域受到广泛关注并投入了大量研究努力，但由于缺乏适当的方法学，细胞凋亡的某些方面——特别是凋亡小体（ApoBDs）的形成——仍未得到充分研究。这些问题突出表现为传统Annexin V/PI流式细胞术分析难以同时追踪细胞凋亡进程和ApoBD的形成，以及ApoBD分离纯度不足。我们近期已开发出若干方法，以解决这些技术上的局限性。
我们基于流式细胞术的新型分析方法能够检测和定量传统分析方法常忽略的凋亡小体（ApoBDs）20。此外，这种经改进的流式细胞术方法结合使用染料TO-PRO-3，揭示了一种额外的A5-早期凋亡阶段，从而更清晰地界定凋亡进程20。传统上，ApoBD的检测主要依赖基于成像的技术，如共聚焦显微镜和组织学方法，而我们的流式细胞术则提供了一种高通量定量ApoBD形成的手段。尽管该方法看似复杂，但实际操作相对简便，仅需 commercially available 试剂和一台.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了澳大利亚国家健康与医学研究委员会（GNT1125033 和 GNT1140187）以及澳大利亚研究理事会（DP170103790）向 I.K.H.P. 提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞，例如培养的人源 THP-1 单核细胞（克隆编号：TIB-202） | ATCC | - | |
| RPMI 1640 培养基 | Life Technologies | 22400-089 | |
| 青霉素-链霉素混合液 | Life Technologies | 15140122 | |
| FSC | Gibco | 10099-141 | |
| 1x PBS | - | - | |
| Annexin V FITC | BD Bioscience | - | |
| TO-PRO-3 碘化物 | Life Technologies | T3605 | TO-PRO-3 可能引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激。避免直接接触。 |
| 10x Annexin V 结合缓冲液 | BD Bioscience | 556454 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1001710526 | |
| 离心管（15 mL） | Cellstar | 188271 | |
| 微量离心管（1.5 mL） | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 组织培养孵育箱（37 °C，5% CO2） | - | - | |
| 离心机 | Beckman Coulter | 392932 | |
| FACS ARIA III 流式细胞仪，配备用于 FITC 和 APC 检测的两根激光器 | BD Bioscience | - | |
| FACS Canto II 流式细胞仪，配备用于 FITC 和 APC 检测的两根激光器 | BD Bioscience | - | |
| FACS Diva 6.1.1 软件 | BD Bioscience | - | |
| FlowJo 8.8.6 软件 | - | - | |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | - |
参考文献
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).
- Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions. Trends....
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重印与许可
