脊索中胚层节点和脊索板是发育中的小鼠胚胎中存在的短暂信号调控中心，可通过多种技术进行观察。本文详细描述了用于研究其结构和形态发生过程的两种技术：1）扫描电子显微镜（SEM）；2）整体免疫荧光染色（WMIF）。
本文内容
摘要
摘要
小鼠胚胎在原肠胚形成和形态发生启动后，会经历显著的形态变化。形态发生的一个重要特征是，经过原始条纹的细胞会形成短暂存在的组织中心——脊索中胚层结节（node）和脊索板（notochordal plate）。这些信号中心的正确形成对于体轴发育至关重要，因此可视化这些结构的技术受到小鼠发育生物学研究者的高度关注。脊索中胚层结节和脊索板位于胚胎发育约第7.5天（E7.5）时原肠胚的腹侧表面。结节呈杯状结构，其细胞各具有一根细长的纤毛。结节凹陷处纤毛的正确亚细胞定位及其旋转运动决定了胚胎的左右不对称性。脊索板细胞也具有单根纤毛，但比结节细胞的纤毛更短。脊索板最终发育为脊索，后者作为重要的信号组织中心，在体节发生和神经模式形成中发挥关键作用。由于结节和脊索板的细胞短暂地存在于胚胎表面且带有纤毛，因此可利用扫描电子显微镜（SEM）对其进行观察。此外，另一种在细胞水平上可视化这些结构的技术是整体免疫荧光染色（WMIF），即使用针对在结节和脊索板中高表达蛋白的抗体进行标记。本报告中，我们介绍了优化后的扫描电镜和整体免疫荧光染色实验方案，用于观察发育中小鼠胚胎的结节与脊索板，以辅助评估野生型及原肠胚形成突变型胚胎中的组织形态和细胞排列情况。
引言
原肠胚形成及其伴随的形态发生运动对小鼠胚胎的形态构建至关重要1形态发生过程中细胞形态和排列方式的变化可提供位置信息，以调控细胞命运，同时还使后续的信号通路能够精确执行其功能，从而促进新形成的胚层发生分化。1瞬时组织结构和信号中心（如脊索中胚层节点和脊索）的形成对于发育程序的执行至关重要2发育生物学研究者已采用多种技术来研究这些结构的形态发生过程，其中最显著的是细胞报告基因和活体成像技术的应用 离体 成像以追踪细胞及亚细胞行为的动态变化2,3,4在本报告中，我们重点描述了其中两种技术的优化方案细节：扫描电子显微镜（SEM）和整体免疫荧光染色（WMIF），这些技术在过去和现在对于研究脊索前体——脊索中节和脊索板的形态发生过程均起到了关键作用。
小鼠胚胎节是在原肠胚形成和形态发生期间（胚胎第7.5至8天，E7.5–E8）位于小鼠胚胎腹侧表面、处于早期至晚期头部褶皱阶段的一个泪滴状细胞杯状结构2,5,6,7。脊索板在形态上从前部自胚胎节延伸而出3。胚胎节和脊索板中的每个细胞均具有单根纤毛，向外突出；其中胚胎节细胞的纤毛较长，但纤毛长度随发育阶段而变化2。研究表明，胚胎节凹陷处纤毛的旋转对于决定左右不对称性的信号传导至关重要4。脊索板是脊索的前体结构，而脊索作为一个重要的信号中心，对邻近体节及上方神经管的模式形成具有关键作用3。
由于结节（node）具有特定的位置（表面）、形态（杯状）以及独特的外层细胞结构（纤毛），扫描电子显微镜（SEM）传统上被用于观察结节和脊索板，并研究它们的形成过程与结构2,7。SEM 还可用于研究影响原肠胚形成、形态发生以及纤毛形成的突变中，结节自身结构或其细胞表面纤毛的结构变化8,9,10。SEM 是一种利用聚焦电子束探测材料（如生物样本）外表面拓扑超微结构的技术11。样品通常经过固定、干燥处理，然后溅射镀金属，再在扫描电子显微镜下进行观察，具体步骤如本文第1步所述。
WMIF 是一种用于在三维（3D）空间中可视化基因产物（如蛋白质）的染色技术。对组织、器官甚至整个生物体进行WMIF染色，可提供信号分布以及最终结构形态的三维空间信息。该技术基于先固定样品，再用荧光标记物进行染色。小鼠胚胎在约E7.5时期体积较小且具有透明性，因此非常适合采用WMIF方法来观察脊索中胚层（node）和脊索板（notochordal plate）。例如，转录因子Brachyury（T）在胚胎发育E7.5至E8时期主要表达于脊索中胚层和脊索板的细胞核中，在原条（primitive streak）中表达较弱，目前已有针对T蛋白且适用于WMIF的良好商用抗体，使得该染色方法得以实现。脊索中胚层和脊索板的细胞还具有明显的顶膜收缩特征，其顶面朝向外侧，因此可用荧光标记的鬼笔环肽（Phalloidin）对F-肌动蛋白（F-Actin）进行染色，以标记顶膜收缩区域。以这些试剂为例，通过WMIF联合T蛋白与F-Actin染色，可在原肠胚形成期的小鼠胚胎中实现脊索中胚层和脊索板的三维可视化，如我们在步骤2中所示8。此外，纤毛标记物（如ARL13B或乙酰化微管蛋白）以及其他脊索中胚层和脊索板标记物（如FOXA2）也可用于发育中小鼠胚胎的WMIF染色3,4。
我们已证明，纹状体相互作用蛋白1（STRIP1）对于小鼠胚胎的正常原肠胚形成和形态发生至关重要8。STRIP1是纹状体相互作用磷酸酶和激酶复合物（STRIPAK）的核心组分，我们及其他研究团队已发现该复合物参与肌动蛋白细胞骨架的组织调控8,12。Strip1突变胚胎的主要缺陷表现为轴向中胚层（脊索前体结和脊索板）的形成异常以及前后体轴的延伸受阻。我们采用扫描电镜（SEM）和整体免疫荧光染色（WMIF）对野生型（WT）和Strip1突变胚胎中的脊索前体结及脊索板进行了分析，结果如代表性结果部分及相应图示所示。
方案
所有涉及动物实验的研究均经北莱茵-威斯特法伦州主管部门（LANUV-NRW）批准。
1. 小鼠胚胎结的扫描电子显微镜观察
- 在约E7.5（2-4体节期）通过颈椎脱位法处死怀孕雌性小鼠。步骤1.1至1.7的详细说明及图解可在小鼠胚胎实验手册中找到13。
- 使用剪刀和精细镊子切开皮肤和肠系膜，暴露腹腔并取出子宫。
- 将子宫在蒸馏水中短暂冲洗，然后放入含有1×磷酸盐缓冲液（PBS）的小型洁净培养皿（6 cm）中。
- 在解剖显微镜下，使用精细镊子去除子宫肌层，分离出各个蜕膜或着床部位。
- 用一对镊子夹住每个蜕膜，用另一对镊子在红色部分（未来胎盘）与白色部分（胚胎所在位置）之间做一纵向全层切口。沿切口连续的蜕膜白色部分垂直方向做浅层穿孔。将蜕膜水平方向拉开成两半，并小心地从白色部分挖出胚胎。
- 将胚胎转移至新的培养皿（35 mm）中，内含新鲜无菌过滤的PBS。对所有蜕膜/胚胎重复此操作。
- 用镊子从每个胚胎上轻轻剥离包裹胚胎的相对不透明的膜——Reichert膜，操作方式如同从外周胎盘锥（略带红色的着床部位）开始脱掉一只袜子。若需进行基因分型，此时可取少量卵黄囊组织（约0.1 mm2）。
- 在化学通风橱内佩戴适当防护装备（手套），将胚胎转移至含2.5%戊二醛溶于无菌过滤PBS中的电子显微镜级固定液中，置于微量离心管（1.5 mL）内，室温下保存。于4 °C过夜固定。
- 小心移除管中的戊二醛固定液，避免触碰胚胎，并将废液倒入合适的废弃物容器中。用无菌过滤的PBS洗涤胚胎三次，每次15分钟，室温进行。
- 将胚胎依次在乙醇系列中脱水，每次5分钟：50%、70%、85%，以及100%（绝对乙醇）三次。胚胎可在乙醇中于−20 °C保存，或直接进入下一步。
- 将乙醇中的胚胎转移至临界点干燥仪（CPD）专用篮中。向腔室内加入乙醇，完全浸没篮子。
- 在10 °C条件下，用液态CO2小心冲洗十次以置换乙醇。最后一次冲洗后排出液态CO2，直至腔室液面降至一半。升温至40 °C，使压力升至80 bar（临界点），此时液态CO2转化为气态。保持10分钟后，缓慢排气约45分钟。
- 作为比临界点干燥更简便的替代方法，可在乙醇中按1:1比例加入六甲基二硅氮烷（HMDS），处理胚胎30分钟。随后将胚胎转移至纯HMDS中再处理30分钟。用移液器将胚胎从液体中取出，静置干燥30分钟。
注：两种干燥方法在我们的实验中效果相当。 - 使用细毛刷将干燥后的胚胎腹侧（节点）朝上，用双面导电胶固定于扫描电镜（SEM）样品台。
- 将带有胚胎的样品台插入溅射镀膜仪中，进行金颗粒镀膜，此方法更有利于为细长纤毛充电。镀层厚度为120–150 Å；镀膜时间取决于电流强度，因样品而异。
- 将镀膜后的样品台放入扫描电镜中，抽真空后观察胚胎节点及脊索板细胞上的纤毛，放大倍数范围为1000X至15,000X。
2. 小鼠结节和脊索板的整体免疫荧光染色
- 使用预冷的含 0.05% Tween 20 的 PBS（PBSTw），按照上述步骤 1.1–1.7 操作，取出 E7.75 胚胎并置于冰上的 35 mm 培养皿中的 PBSTw 内。
- 在化学通风橱内佩戴适当的防护手套，将胚胎转移至含有4%多聚甲醛的PBS固定液的微量离心管中。于4 °C条件下过夜固定胚胎。
- 小心地从离心管中移除多聚甲醛固定液，避免触碰胚胎，并将废液弃入适当的废液容器中。用含0.2% Triton X-100的PBS（PBSTr）在室温下清洗胚胎3次，每次5分钟。所有清洗步骤及后续孵育步骤均在旋转摇床上进行。
- 去除最后一次洗涤，加入含10%热灭活血清（来自二抗的宿主物种）的PBSTr封闭液。在4 °C条件下，于旋转摇床上封闭2小时至过夜（或更长时间）。
- 除去封闭液，加入约 1 mL 用封闭液稀释的一抗，例如抗 T 抗体按 1:500 稀释。在 4 °C 条件下于摇床上孵育过夜（或更长时间）。
- 除去一抗，并通过加入叠氮化钠至终浓度0.02%（将20%储存液1 µL加入1 mL抗体溶液中）以保存抗体供后续使用。该抗体可重复使用约10次。用PBSTr缓冲液将胚胎漂洗两次，随后在4 °C下于旋转摇床中洗涤三次，每次30分钟。
- 用荧光标记的二抗替代洗涤液，二抗需针对一抗的宿主物种，按约1:1000稀释，于4 °C在旋转摇床中孵育过夜（或更长时间）。
- 除去二抗，用PBSTr漂洗两次，再用PBSTr洗涤三次，每次30分钟。
- 用含1:500荧光标记鬼笔环肽（phalloidin）用于标记F-肌动蛋白和1:1000 DAPI用于标记细胞核的PBSTr溶液替换最后一次洗涤液，室温孵育1小时。
- 用 PBSTr 漂洗两次，再用 PBSTr 在室温下洗涤 30 分钟。
- 用 PBS 替换 PBSTr，将胚胎置于冰上。准备干净的带正电荷载玻片（60 × 24 mm）和盖玻片（24 × 24 mm），以及基于水性甘油的封片剂，例如含抗荧光淬灭剂的 90% 甘油 PBS 溶液（1×PBS 配制），用于封片。
- 在载玻片的透明区域上，相距约 15 mm 处贴上两条透明胶带。这将形成足够的三维空间（Z 轴方向），使胚胎能够被压平但不会完全压碎。
- 在解剖显微镜下，使用剪去尖端的P200移液枪（以留出足够空间，便于胚胎转移且不造成损伤）小心地将胚胎转移至载玻片上。
- 使用精细镊子在卵黄囊的两侧进行两次完整的切割，以展开胚胎。将胚胎腹侧（脊索中胚层和脊索板）朝上放置 向上 （神经管背侧朝下贴于载玻片上）
- 加入50 µL封片剂至胚胎上。每张载玻片放置4-5个胚胎。在盖玻片即将接触载玻片的一侧（上侧或下侧）添加少量封片剂，然后将盖玻片跨过两条胶带放置，并使用精细镊子或弯曲的细针缓慢将其放下，覆盖在胚胎上，注意避免产生气泡。
- 使用吸水纸擦拭去除多余的封片剂，注意避免移动盖玻片。
- 使用足量的指甲油密封盖玻片的四周，注意不要移动盖玻片。
- 在共聚焦扫描显微镜下观察。
结果
为了观察约 E7.5 时期的野生型（WT）和 Strip1 突变体胚胎中节点的形成情况，我们按照步骤 1 所述方法并如图 18所示进行了扫描电镜（SEM）分析。通过 SEM 观察胚胎外部拓扑结构的超微细节，结果具有重要信息价值，可明显看出：与野生型胚胎中凹陷状的节点结构不同，突变体胚胎的节点呈现扁平且不规则的形态。对胚胎进行更高倍数的观察，可见节点细胞上具有典型纤毛，从而可明确识别这些细胞。突变体中纤毛表观密度较低，可能归因于节点凹陷结构及曲率的丧失，或节点细胞数量减少。在突变体胚胎中，自节点延伸出的脊索板也呈现不规则形态，可通过其较短的纤毛加以识别。因此，扫描电镜对于揭示 Strip1 突变体中节点形态发生缺陷具有重要意义8。在先前的研究中，我们也曾使用扫描电镜显示缺乏中心粒（作为纤毛形成模板）的突变体胚胎节点中纤毛完全缺失的现象9。
为了在细胞水平上研究Strip1突变胚胎中轴中胚层形成缺陷，我们采用第2步所述的全胚胎免疫荧光染色法（WMIF），如图2所示。利用该技术，可通过F-肌动蛋白和T蛋白染色清晰识别原结和脊索板。野生型（WT）原结和脊索板细胞具有收缩的顶端区域，其中F-肌动蛋白富集，且可见细胞核T蛋白染色。在野生型中，脊索板向头端延伸，而在突变体中则较短且形态不规则。实验数据显示，突变胚胎不同胚层（包括轴向中胚层）中的F-肌动蛋白排列异常8。因此，WMIF技术对于研究Strip1突变胚胎中原结和脊索板形成缺陷具有重要作用。
图1。扫描电子显微镜揭示Strip1突变小鼠胚胎中节点形态发生的缺陷。（上图）对野生型（WT）和Strip1突变体腹侧胚胎节点及脊索板（Noto）的扫描电镜分析8。左侧显示一幅野生型胚胎的低倍镜图像示例。（下图）上图中节点中心区域的高倍放大图像，显示从节点细胞伸出的长单纤毛。所有图中 anterior 朝上。比例尺：30 µm。请点击此处查看此图的放大版本。
图2整体免疫荧光染色在细胞水平上显示了异常的胚结和脊索板 Strip1 突变胚胎。 （顶部）野生型（WT）和WMIF的腹侧三维重建（Volocity软件） Strip1 利用荧光标记的鬼笔环肽（F-Actin，红色）和T抗体（绿色）染色相结合的方法对突变胚胎进行染色。（下方）上述染色的更多示例，聚焦于节点区域并采用更高倍镜观察，同时包含DAPI染色。所有图中 anterior 朝上。比例尺： 30 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。
讨论
在本研究中，我们演示了如何利用扫描电镜（SEM）和全胚胎免疫荧光染色（WMIF）技术对小鼠胚胎节点及脊索板进行成像观察。原肠胚形成期的小鼠胚胎（约E7.5）体积微小，且这些结构位于胚胎表面，因此非常适合采用本文所述的技术进行研究2,7,8。此外，得益于T抗体和纤毛标记物等优质抗体的可获得性，通过WMIF可获得关于这些关键胚胎组织中心的结构、排列及其形成过程的优异三维信息8。
由于小鼠胚胎发育进程非常迅速，且脊索中胚层（node）和脊索板（notochordal plate）仅在胚胎表面短暂存在，因此这些实验的成功关键在于时机的把握2,3。例如，具有长纤毛的成熟脊索凹坑适合在2-4体节的胚胎中进行扫描电镜（SEM）分析。而在更早或更晚的胚胎（例如前后相差12小时）中，脊索可能已不在胚胎表面。全胚胎免疫荧光（WMIF）在此方面稍具灵活性，但相关结构在发育过程中同样是瞬时存在的，具体时机选择取决于研究人员的研究目的。
试剂的纯度对于这些技术的成功也至关重要，尤其是在利用扫描电镜（SEM）观察超微结构时。附着在胚胎上的微小杂质通常会导致严重的假象。
我们测试了两种不同的胚胎固定方法用于扫描电镜观察：一种使用半浓度Karnovsky固定液（2.5% 戊二醛、2% 多聚甲醛和 0.1 M 卡可基缓冲液），另一种使用更简单的 2.5% 戊二醛溶于 1× PBS。我们倾向于采用步骤1中所述的戊二醛与PBS固定液，但我们及其他研究者也已成功使用半浓度Karnovsky固定液进行扫描电镜分析。
我们还比较了两种用于扫描电镜样品制备的胚胎干燥方法，结果表明，使用临界点干燥仪或HMDS（如步骤1所述并在其他文献中报道的）在样品质量上无显著差异14。
在步骤2中，我们在最后一次洗涤步骤后，将胚胎包埋于载于35 mm玻璃底培养皿中的1%低熔点琼脂糖内，然后在其上覆盖约10 µL封片介质。该包埋方法可行，能够保持胚胎及其相关结构原有的三维结构；然而，由于普通共聚焦显微镜无法深入完整胚胎内部（约1 mm），因此需要使用多光子显微镜对样品进行成像。
我们认为，使用这两种技术可以在正常发育以及在这些结构形成存在缺陷的突变体中，对脊索节点和脊索板的结构提供互补的信息。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
H.B. 得到了科隆大学医学院启动资金和SFB829项目的支持。C.X. 得到了德国研究基金会（DFG）BA 5810/1-1号基金的资助。我们感谢CECAD研究中心和纪念斯隆-凯特琳癌症中心（美国纽约）成像平台的技术支持。我们感谢Joaquín Grego-Bessa（西班牙马德里国家心血管研究中心）在胚胎全标本免疫荧光染色封片方面的宝贵建议。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1,1,1,3,3,3-六甲基二硅氮烷（HMDS） | 卡尔·罗特 | 3840 | |
| 抗T抗体 | R&D Systems | AF2058 | |
| 临界点干燥仪 | Blazers Union | CPD 020 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| 25% 戊二醛溶液 | 默克 | 1042390250 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | |
| SEM镀膜仪PS3 | 琼脂电镜辅助剂 | PS3 | |
| SEM显微镜 Quantum FEG 250 | 赛默飞世尔科技（FEI） | Quantum FEG 250 |
参考文献
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