在此，我们描述了一种使用收缩力测定法 果蝇 S2R+ 细胞。外源性配体折叠胃形成蛋白（folded gastrulation, Fog）的应用可激活 Fog 信号通路并诱导细胞收缩力。该实验可用于研究 Fog 信号通路中细胞收缩力相关蛋白的调控机制。
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摘要
摘要
我们开发了一种基于果蝇（Drosophila）细胞的细胞实验体系，可重现由分泌型上皮形态发生素折叠素（folded gastrulation, Fog）引发的顶端收缩过程。在该实验中，Fog 作为激动剂，通过包含G蛋白偶联受体（Mist）、Gα12/13蛋白（Concertina/Cta）以及含PDZ结构域的鸟苷酸交换因子（RhoGEF2）的信号级联反应，激活Rho蛋白。Fog信号通路导致肌动蛋白细胞骨架迅速而显著地重排，形成具有收缩功能的“拉绳”结构。可溶性Fog从稳定细胞系中收集后，外源性地施加于S2R+细胞，可诱导细胞发生类似顶端收缩的形态学变化，该过程在原肠胚形成等发育事件中普遍存在。本实验体系适用于高通量筛选，并可通过RNA干扰（RNAi）技术，帮助鉴定参与该信号通路的其他基因。
引言
以遗传学模式生物进行的胚胎发生研究极大地增进了我们对细胞如何组装成组织的理解。这些研究 黑腹果蝇特别是，这些研究已促成从受精到成体的生物体形态发生与发育过程中关键基因和生物学原理的鉴定1,2,3与开展的遗传学研究同时进行 黑腹果蝇源自果蝇组织的培养细胞系也已成为研究广泛分子与细胞生物学问题的有力体系4,5,6. 果蝇 组织培养细胞的维持条件要求极低，因其在室温下培养且无需二氧化碳2因此，它们适用于高分辨率成像，并且对RNAi介导的基因抑制具有高度敏感性。6,7许多研究团队已使用 果蝇 组织培养细胞作为研究细胞形态决定、细胞骨架动态、存活能力、吞噬作用及信号转导通路相关基因的工具4,8,9,10,11与整体动物模型联合使用时，培养的 果蝇 细胞系提供了一系列高度互补的方法，可加速鉴定对发育至关重要的分子，并为确定这些分子的机制作用提供研究框架12在此，我们描述了一种基于细胞的检测方法，用于研究触发顶端收缩的信号通路 通过 折叠胚层形成（folded-gastrulation，Fog）通路13,14该基于细胞的收缩力检测方法可使研究人员探究Fog信号通路以及调控非肌球蛋白II收缩力的分子机制。
早期黑腹果蝇（Drosophila）胚胎的原肠胚形成已被研究多年，是上皮形态发生以及上皮细胞向间充质细胞身份转变的遗传学模型。原肠胚形成的关键事件之一是沿着胚胎腹侧中线的一群上皮细胞发生形态变化，从柱状转变为锥体形15,16,17,18。这种简单的细胞形状改变导致预定中胚层细胞向内迁移，其驱动力来自非肌球蛋白II对肌动蛋白网络的收缩作用16,19,20。数十年的遗传学研究已鉴定出该信号通路中的多个分子组分，并将其按顺序排列如下：1）Fog从腹侧中线上皮细胞的顶端结构域分泌；2）Fog结合G蛋白偶联共受体Mist和Smog，通过包含Gα12/13亚基Concertina（Cta）的异源三聚体G蛋白复合物传递信号，其中Cta由非经典鸟苷酸交换因子Ric-8协助；3）Cta激活鸟嘌呤核苷酸交换因子RhoGEF2，后者进一步激活小G蛋白Rho1；4）Rho1激活Rho激酶（Rok）；5）Rok通过磷酸化调节轻链（RLC）来激活顶端结构域的非肌球蛋白II收缩性，从而引起顶端收缩（图1）15,21,22,23,24,25,26,27,28,29。这些组分中的若干突变会干扰正常的原肠胚形成及其他形态发生运动，包括翅盘和唾液腺的形成，表明该通路在黑腹果蝇（Drosophila）胚胎发育的多个阶段中均发挥作用30,31,32。Fog信号通路是上皮形态塑造研究最深入的模型之一，为从基因转录到细胞骨架驱动的细胞运动如何调控组织水平的形态发生提供了重要见解14,15,21。
我们开发了一种基于细胞的收缩力检测方法，该方法重现了在发育中的果蝇胚胎中观察到的 Fog 信号通路下游的多种细胞反应17我们构建了一株稳定的S2细胞系，该细胞系表达在C末端带有Fog标签的蛋白 myc 在可诱导的金属硫蛋白启动子控制下，可通过添加硫酸铜（CuSO₄）进行收获4) 加入培养基中。当将Fog诱导的条件培养基外源性地施加于S2受体阳性（S2R+）细胞时——S2R+细胞是S2细胞的一个亚系，其特征在于差异性表达Frizzled和整联蛋白亚基等受体——这些细胞会发生细胞骨架的重组，其形态学特征与顶端收缩高度相似。12,17,27,33这些变化可通过相差显微镜观察，Fog处理会导致出现相位较暗的皱褶结构，提示非肌球蛋白II收缩性的径向增强；也可通过荧光显微镜观察，在表达EGFP标记RLC的细胞中，Fog处理会诱导非肌球蛋白II环状结构的形成。34这些环状结构中含有可见的肌球蛋白磷酸化调节轻链（pRLC） 通过 免疫染色23,34,35该Fog诱导的反应需要Cta、RhoGEF2、Rho和Rok；因此，通过使用重组Fog-Myc和S2R+细胞，我们建立了一种基于组织培养系统的研究Fog诱导收缩的方法。24,25,34.
方案
1. 维持 果蝇 组织培养细胞
- 在室温下培养 S2R+、S2R+:RLC-EGFP 和 S2:Fog-Myc 细胞，培养温度最好控制在 20 °C 至 25 °C 之间，使用添加了 10% 胎牛血清、100 单位/毫升青霉素、100 µg/mL 链霉素和 0.25 两性霉素 B 的 Shield 和 Sang M3 昆虫培养基，细胞密度不得低于 5 × 105 个细胞/毫升。
注意：细胞密度过低会导致细胞死亡。 - 迅速解冻冻存的细胞冻存管，并将其转移至组织培养瓶中。初始培养时使用较小的组织培养瓶（12.5 cm2 或 25 cm2），加入 4–5 mL 细胞培养基，直至细胞培养状态稳定，且因冻存复苏导致的细胞死亡现象减轻。
注意：冻存复苏引起的细胞死亡表现为细胞无法贴壁、形态不呈光滑圆形，以及培养基中出现细小深色的细胞碎片，提示存在坏死细胞。 - 让细胞在数天（4–8 天）内不受干扰地生长至 100% 汇合度，即细胞之间几乎无间隙，并开始相互堆叠。将该 100% 汇合的小型培养瓶（12.5 cm2 或 25 cm2）中的全部细胞转移至一个较大的组织培养瓶（75 cm2），并加入 10 mL 新鲜细胞培养基。
注意：在 75 cm2 培养瓶中维持培养可获得足够多数目的细胞，满足大多数实验需求。 - 每 3–4 天传代一次，通过反复吹打培养基，利用液体流动使贴壁较松的细胞从组织培养塑料表面脱落。将含有重悬细胞的培养基转移至新的培养瓶中。每次传代时用新鲜细胞培养基将细胞按 1:4 比例稀释，并根据需要重复操作。
2. RNAi 处理 果蝇 S2R+ 细胞
注意：有关如何制备适用于昆虫培养的双链RNA的详细说明，请参见Rogers和Rogers6。
- 将S2R+细胞以不低于5 × 105 个细胞/mL的密度接种至6孔或12孔组织培养板中，使用完全Shield和Sang M3细胞培养基进行RNAi处理。
- 在组织培养超净台中操作，轻轻倾斜6孔或12孔组织培养板，用移液器吸除旧的细胞培养基，然后迅速向每孔加入1 mL新鲜细胞培养基。
注意：在更换培养基前，若细胞已松散贴壁30–45分钟，则此操作不会造成明显的细胞损失。 - 根据Rogers和Rogers6中所述的详细方案制备dsRNA，并通过移液直接加入每孔细胞的组织培养基中，终浓度为10 µg/mL，每种RNAi条件对应一孔。
- 每天重复上述操作，每孔更换1 mL新鲜培养基并补充10 µg/mL的dsRNA，每种RNAi条件分别处理。
注意：RNAi实验通常持续7天；然而，具体时间取决于目标蛋白的周转速率及dsRNA的干扰效率。某些蛋白在短至3天的RNAi处理后即可被有效耗竭，而其他靶蛋白则需要更长的处理时间6。
3. 雾水的产生与收集
- 通过让 S2:Fog-Myc 细胞不受干扰地生长 4 - 8 天，扩大其培养规模，以在 10 mL 细胞培养基中获得接近 100% 汇合的 75-cm2 培养瓶（或 alternatively，在 20 mL 细胞培养基中使用 150-cm2 培养瓶），从而最大化 Fog 的产量。
- 向接近 100% 汇合的 75-cm2 培养瓶中加入 50 µL 的 100 mM CuSO4（或对于 150-cm2 培养瓶加入 100 µL 的 100 mM CuSO4），以诱导金属硫蛋白启动子。在室温下孵育 48 小时。
- 用移液器将含有 Fog-Myc 的培养基从组织培养瓶中移除，并转移至 15-mL 或 50-mL 圆锥形管中。在 4 °C 下以 2,500 x g 离心 10 - 15 分钟，以去除细胞和细胞碎片。
- 将澄清后的细胞培养基转移至新的圆锥形管中，并置于冰上保存。分批操作，将 5 mL 澄清培养基转移至含再生纤维素膜的 3,000 MW 浓缩管中，并在 4 °C 下以 2,500 x g 每次离心 30 分钟，以浓缩培养基。
注意：也可使用更大容量（50 mL）的浓缩管。在浓缩过程中，富含 Fog 的深色培养基将开始在 V 形滤器底部积聚。 - 将移液器吸头插入浓缩管的 "V" 形底部，每次离心后移除深色部分的培养基，并转移至新的 1.7-mL 微量离心管中。将培养基保持在冰上。
- 使用同一浓缩管，重复步骤 3.4 和 3.5，移除深色浓缩的 Fog-Myc 培养基并替换为更多预澄清的培养基，直至培养基体积浓缩至原始体积的十分之一（即，从 10 mL 起始材料浓缩至 1 mL）。
- 将浓缩的 Fog-Myc 储存于 4 °C。
注意：储存后务必监测是否存在细菌污染，长期储存可能导致污染。 - 进行 SDS-PAGE 时，取 10 µL 浓缩 Fog-Myc 培养基与 10 µL 含变性 SDS 的缓冲液混合制成裂解液。在 35 mA 条件下电泳约 1 小时。随后在 120 mA 条件下将凝胶转印至硝酸纤维素膜（或 alternatively，PVDF 膜）1 小时。使用任何市售的 Myc 抗体进行 Western 印迹检测，以识别 150-kDa 条带。
注意：条件培养基中 Fog-Myc 的浓度可能因批次而异。进行检测时无需确定 Fog-Myc 的精确浓度，但应在实验前测试每批样品的有效性。 - 在完成步骤 3.1 - 3.2 后，通过移液从接近 100% 汇合的 75-cm2 S2 细胞培养瓶（或 alternatively，从 150-cm2 培养瓶中取 20 mL）收集 10 mL 细胞培养基，制备对照 S2 条件培养基。将对照 S2 细胞培养基转移至新的 15-mL 或 50-mL 圆锥形管中。
- 参照步骤 3.4 - 3.7，通过离心（在 4 °C 下以 2,500 x g 每次离心 30 分钟）去除裂解液中的细胞和细胞碎片，然后将澄清的细胞裂解液转移至浓缩管中，分批离心，将对照培养基浓缩至原始体积的十分之一。
注意：在检测中应用 S2 条件培养基不会引起明显的细胞收缩性。 - 将浓缩的 S2 对照培养基在 4 °C 下储存数月。
注意：储存后务必监测污染情况。
4. 刀豆蛋白A包被的玻璃底培养皿的制备及S2R+细胞的接种
- 通过将5 mg刀豆蛋白A（con A）溶解于10 mL水中，配制10 mL浓度为0.5 mg/mL的刀豆蛋白A（con A）溶液。将该溶液分装为更便于使用的体积（500 µL至1 mL），并于-20 °C保存。
- 用200 µL的con A溶液涂覆35 mm玻璃底培养皿的玻璃部分，在组织培养超净台中室温孵育约2分钟。随后吸除所有con A溶液（可保留并用于后续实验），让培养皿完全自然干燥。
注意：培养皿可批量制备，置于干燥处（如实验台抽屉）可保存长达6个月。 - 向每个玻璃底培养皿中加入约2 mL新鲜细胞培养基。通过反复吹打细胞培养基，重悬待检测的S2R+细胞，以脱离任何松散贴壁的细胞。
- 将重悬的S2R+细胞转移至含有新鲜细胞培养基的35 mm玻璃底培养皿中，使细胞密度达到50%–70%融合度。通过组织培养显微镜上下调焦，观察悬浮在培养基中细胞的多个焦平面，以估算细胞数量。
注意：通过反复试验，可确定达到50%–70%融合度所需的合适细胞密度。 - 让细胞在con A包被的玻璃底培养皿上贴壁45–60分钟。
注意：完全贴壁的S2R+细胞呈“煎蛋样”，扁平且相位较暗。
5. 雾化处理培养基的功效测试及细胞收缩力检测
- 如需要，可通过 SDS-PAGE 和 Western 印迹法检测从 S2:Fog-Myc 稳定细胞系中产生并浓缩的 Fog-Myc 产量。取 10 µL 浓缩的 Fog-Myc，加入 10 µL 含 SDS 的上样缓冲液，沸水浴 5 分钟。按照标准的 SDS-PAGE 和 Western 印迹操作流程进行，使用抗 Myc 抗体检测以确认 Fog-Myc 的表达。
- 轻轻吸去步骤 4.3 中贴壁的 S2R+ 细胞所培养的 Shield and Sang M3 培养基，小心地重新加入 75 µL 新鲜 Shield and Sang 培养基，以限制 Fog 条件培养基的使用量。
- 向步骤 5.2 中的玻底培养皿的玻璃区域加入 75 µL Fog 条件培养基，使总体积达到 150 µL，Fog 条件培养基与 Shield and Sang M3 培养基的比例为 1:1。
注意：通常需要 150–200 µL 的总体积才能完全覆盖标准玻底培养皿的玻璃区域；但具体体积取决于所用玻底培养皿的尺寸。 - 使用 20X 或 40X 放大倍数的相差显微镜观察整个视野的细胞，监测细胞收缩性。追踪细胞形态变化，观察明暗交替的波浪状边缘，这是细胞形态改变的典型特征。
注意：通常加入 Fog 后，约有 30%–50% 的 S2R+ 细胞发生细胞收缩；10 分钟后，细胞开始松弛，恢复为边缘平滑、类似“煎蛋状”的形态。 - 评估细胞收缩反应的强度。若使用 1:1 比例的 Fog 条件培养基与新鲜 Shield and Sang 培养基时细胞反应过强，可减少 Fog 条件培养基的用量，以节省浓缩的 Fog-Myc 培养基用于后续实验。若 1:1 比例未能引发明显收缩反应，则可使用未稀释的 Fog 条件培养基；通常 1:3 的比例足以产生有效的实验反应。
注意：一旦针对某一批 Fog 条件培养基确定了最佳比例，后续所有实验均应使用该比例。 - 利用表达 GFP 标记的非肌肉肌球蛋白 II 调节轻链（S2R+:Sqh-EGFP）的稳定 S2R+ 细胞系，监测细胞收缩实验过程中非肌肉肌球蛋白 II 的动态变化。
- 根据步骤 5.2–5.5 确定的 Fog 条件培养基与新鲜 Shield and Sang M3 培养基的比例，用移液器吸去玻底培养皿玻璃区域中的细胞培养液，重新加入新鲜 Shield and Sang 培养基。在采集活细胞成像序列的同时，以预定比例灌注 Fog 条件培养基；灌注过程中注意避免移动玻底培养皿。
6. 收缩的 S2R+ 细胞的固定与染色
- 使用 PEM 缓冲液（100 mM Pipes，1 mM EGTA，1 mM MgCl2，pH 6.9）中配制的 10% 多聚甲醛溶液固定 S2R+ 细胞。
注意：PEM 缓冲液通常配制成 2× 储存液，可在 4 °C 下保存数月。 - 用移液器吸除 Fog 处理的 S2R+ 细胞中的细胞培养基，并立即加入 1.5–2.0 mL 的 10% 多聚甲醛溶液。在室温下孵育 15 分钟。
注意：固定后的细胞可在固定液中于 4 °C 下保存数天；但必须在转移至 4 °C 前，在室温下完成最初的 15 分钟固定步骤。 - 用移液器吸除 10% 多聚甲醛溶液，并妥善处理该有机废液。通过向 35 mm 玻底培养皿中轻柔加入 1.5–2.0 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞。吸除旧的 PBS，再用 1.5–2.0 mL 新鲜 PBS 重复更换两次，以去除残留的固定液。
注意：从本步骤开始，必须确保细胞始终不干燥。 - 用含 0.1% 非离子型去垢剂的 PBS（PBST）稀释的 5% 正常山羊血清约 200 µL，在室温下封闭细胞 20 分钟。
注意：通常封闭液中所用血清应与二抗来源物种相匹配。 - 将一抗用 PBST 稀释，配制一抗溶液。使用约 200 µL 体积，足以完全覆盖玻底培养皿的玻璃区域。
- 用移液器吸除封闭液，直接将一抗溶液加至培养皿的玻璃区域。在室温下孵育 1 小时，或选择在 4 °C 下过夜孵育。
- 若在 4 °C 下过夜孵育，需用封口膜包裹 35 mm 玻底培养皿，防止蒸发。
- 用移液器吸除一抗溶液，向 35 mm 玻底培养皿中加入 1.5–2.0 mL 新鲜 PBS 进行清洗。吸除 PBS 后，重复此清洗步骤两次，每次均使用 1.5–2.0 mL 新鲜 PBS。
- 将二抗用 PBST 稀释，配制二抗溶液。200 µL 体积足以刚好覆盖培养皿的玻璃区域。
- 直接将二抗溶液加至培养皿的玻璃区域。在室温下孵育 1 小时，或在 4 °C 下过夜孵育。
- 若进行过夜孵育，需用封口膜包裹 35 mm 培养皿，防止蒸发。
- 用移液器吸除二抗溶液，向培养皿中加入 1.5–2.0 mL 新鲜 PBS 清洗细胞。吸除旧 PBS 后，按相同操作再重复清洗两次。
- 加入足量抗荧光淬灭封片剂，覆盖 35 mm 玻底培养皿的玻璃区域，以保存已固定并染色的细胞。
- 将样品置于 4 °C 避光保存。
注意：即使妥善保存，荧光信号仍会随时间缓慢衰减。为获得最佳成像效果，建议在一周内完成成像。
7. 细胞收缩力检测的成像与定量分析
- 使用带有相差、微分干涉（DIC）或荧光成像功能的标准倒置显微镜，对固定后的 S2R+ 细胞进行成像。采用 20X 或 40X 放大倍数，根据细胞密度捕获 10 - 30 个无重叠的细胞视野图像，目标是每种实验条件下获取至少 200 个或更多细胞的图像。
- 使用标准细胞计数器，对每个采集的视野中收缩（相位暗、呈圆顶状）和未收缩的细胞数量进行计数并记录。
注意：最好由两位研究人员独立对每个视野中的收缩和未收缩细胞进行计数；或者，同一位研究人员可对同一细胞视野图像计数三次，从而计算出每个视野中收缩与未收缩细胞的平均数量。 - 按照步骤 4.2 所述方法，为每种实验条件准备多个 Con-A 包被的玻璃底培养皿。通过反复吹打细胞培养基，使贴壁不牢的 S2R+:Sqh-EGFP 细胞脱落，并将其接种至 35 mm 玻璃底培养皿中，使细胞融合度达到 50% - 70%。让细胞贴壁 30 - 45 分钟。
- 使用转盘共聚焦显微镜、扫场共聚焦显微镜或光片显微镜，以 60X - 100X 放大倍数对活体 S2R+:Sqh-EGFP 细胞进行成像。从含有已贴壁 S2R+:Sqh-EGFP 细胞的玻璃底培养皿中移除所有 Shield 和 Sang M3 培养基。
- 使用移液器将步骤 5.2 - 5.5 中预混好的 Fog-Myc 条件培养基与新鲜 Shield 和 Sang M3 培养基按预定比例直接灌流至玻璃底培养皿的玻璃区域，注意避免扰动培养皿在物镜下的位置。连续成像 12 - 15 分钟，以捕捉 S2R+:Sqh-EGFP 细胞收缩的起始及完整过程。
注意：若对非肌球蛋白或肌球蛋白-pRLC 进行染色，细胞表面形成紧密的肌球蛋白环也表明具有收缩能力。若对活体 S2R+:Sqh-EGFP 细胞进行成像，EGFP 标记的 RLC 会形成类似的紧密环状结构（见 图 3），提示细胞具有收缩性。发生的形态变化将导致细胞呈现“圆顶”（"bonnet"）状的三维结构；显微镜的焦平面可能需要调整以追踪该形态变化。在对照 RNAi 条件下，通常有 30% - 50% 的细胞在加入 Fog 后发生收缩。需注意，某些 RNAi 条件可能导致细胞在无 Fog 的情况下也发生收缩。
- 使用移液器将步骤 5.2 - 5.5 中预混好的 Fog-Myc 条件培养基与新鲜 Shield 和 Sang M3 培养基按预定比例直接灌流至玻璃底培养皿的玻璃区域，注意避免扰动培养皿在物镜下的位置。连续成像 12 - 15 分钟，以捕捉 S2R+:Sqh-EGFP 细胞收缩的起始及完整过程。
结果
将 S2 细胞和 S2:Fog-Myc 细胞在 150 cm2 的组织培养瓶中培养至接近汇合状态，并用 25–75 µM CuSO4 处理 24–48 小时，以诱导 Fog-Myc 的表达（图 2）。分别采集 S2 细胞（图 2A）和 S2:Fog-Myc 细胞（图 2B）的样品，通过 Western 印迹检测 Fog-Myc 的产生情况。正如预期，在任何条件下，均未能在 S2 细胞收集的培养基中检测到 Fog-Myc。然而，在用 75 µM CuSO4 诱导 24 小时后，即可在 S2:Fog-Myc 稳定细胞系收集的培养基中检测到 Fog。表达 EGFP 标记的非肌球蛋白 II 调节轻链（GFP-RLC）的 S2R+ 细胞贴附于刀豆蛋白 A（con-A）包被的玻璃底培养皿上（图 3A 和 图 3B）。在灌注 Fog 条件培养基期间，使用配备 100X/1.4 NA 物镜的倒置显微镜进行活细胞成像。在用 Fog-Myc 处理约 5 分钟后，RLC 形成环状结构，表明非肌球蛋白 II 发生收缩。这些环状结构可通过使用针对人肌球蛋白 RLC Ser19 位点周围残基的合成磷酸化肽段产生的抗体对 S2R+ 细胞进行免疫染色观察到（图 4A 和 图 4B）。该抗体可与 Drosophila RLC 发生交叉反应。
以下是细胞经对照RNAi及针对Rho1的dsRNA处理7天后，细胞收缩力检测的一个代表性示例（图5A–5E）。S2R+细胞接种于Con-A包被的玻璃底培养皿中，并用Fog条件培养基（+Fog）或对照培养基（-Fog）处理。固定后对发生收缩的细胞数量进行定量。在经Fog条件培养基处理的对照组耗竭细胞中，可见明显的相密度增高皱褶，提示存在收缩现象（图5B）。在图5C中，经S2条件培养基处理的Rho耗竭细胞呈现出典型的边缘光滑、类似“煎蛋样”的形态。需注意的是，Rho不仅在Fog信号通路中发挥作用，也参与胞质分裂过程；因此，Rho耗竭的细胞常无法正常分裂，导致细胞体积增大和倍性升高。对照组耗竭细胞经Fog条件培养基处理后，通常有30%–50%的细胞发生收缩，而在Rho耗竭细胞中则未能观察到明显的收缩现象。
图 1：推测的 Fog 信号通路。在没有 Fog 的情况下，Gα12/13 亚基 Concertina（Cta）与其结合伴侣 Gϒ 和 Gβ 处于非活性状态，并与共受体 Mist 和 Smog 相关联。Ric-8 作为 Cta 的分子伴侣，调控其亚细胞定位。当 Fog 结合后，Cta 与 Gϒ 解离，Gβ 将 RhoGEF2 招募至细胞膜，在此处 RhoGEF2 催化小 GTP 酶 Rho1 将 GDP 交换为 GTP。结合 GTP 的 Rho1 被激活后，进一步激活 Rho 激酶（Rok），后者磷酸化非肌球蛋白的调节轻链（RLC），导致非肌球蛋白被激活，从而引发细胞收缩力。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：Fog-Myc表达的时间进程。 这些图示显示了从接近100%融合的培养瓶中收集的细胞培养基，分别为（A）对照S2细胞或（B）S2:Fog-Myc稳定细胞。细胞用25–75 µM CuSO4处理24–48小时。收集细胞培养基并进行SDS-PAGE和Western印迹分析。使用抗Myc抗体检测Fog-Myc。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：Fog 诱导收缩的活细胞成像。 在灌注 Fog 条件培养基期间，通过扫描场共聚焦显微镜对稳定表达 EGFP 标记的非肌肉肌球蛋白 II RLC 的 S2R+ 细胞系进行成像。时间为分钟和秒。(A) 本图显示在灌注 Fog-Myc 前（0:00）靠近细胞-盖玻片界面的焦平面图像。(B) 本图显示在细胞顶部附近焦平面拍摄的时间序列图像（0:30 - 10:00）。白色箭头指示在收缩过程中，由 EGFP-RLC 标记显示的非肌肉肌球蛋白 II 重组为收缩环的现象。比例尺为 10 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：在 Fog-Myc 诱导收缩后，磷酸化 RLC 定位于收缩环。 S2R+ 细胞经处理后固定，并使用鬼笔环肽（红色）染色肌动蛋白，使用抗磷酸化丝氨酸-19 抗体（绿色）染色磷酸化 RLC，以及 DAPI（DNA，蓝色）染色。处理条件分别为（A）对照组或（B）Fog-Myc 条件培养基。注意在加入 Fog-Myc 后，磷酸化 RLC 重组形成环状结构。请点击此处查看该图的放大版本。
图5Fog诱导的细胞收缩力测定实验的代表性定量结果 S2R+ 细胞经（处理A 和 B) 对照RNAi或(C 和 D) 针对小GTP酶Rho1的dsRNA，持续7天。此后，将细胞接种于Con-A包被的玻璃底培养皿中，并进行处理（A 和 C) 对照培养基或 (B 和 D) 雾化Myc条件培养基。比例尺代表 10 µm. (E散点图表示每种条件下收缩细胞比例的均值及95%置信区间。每个数据点代表在40倍放大倍数下每个视野中收缩细胞的比例（每个视野包含10至120个细胞），括号中的数字表示在三次独立的RNAi实验中计数的收缩与非收缩细胞的总数。星号表示通过单因素方差分析（one-way ANOVA）确定的RNAi处理与Fog处理条件之间的统计学显著差异p < 0.0001）与Tukey多重比较 事后检验 分析显示，经Rho1 RNAi处理的样本在对照组或Fog-Myc条件培养基处理下之间无统计学显著差异（n.s.）。 请点击此处以查看此图的放大版本。
讨论
本文介绍了一种基于细胞的收缩力检测方法的详细实验方案，该方法使用一种Drosophila组织培养细胞系（S2R+细胞），在Fog信号刺激下可引发非肌球蛋白II介导的收缩反应。该检测方法适用于研究Fog信号通路以及调控非肌球蛋白II收缩力的相关机制。
细胞培养注意事项：
S2R+ 细胞的培养条件对于获得本实验的可靠数据至关重要。在计划进行收缩力检测时，最好将 S2R+ 细胞培养于 Shield 和 Sang M3 昆虫培养基中。尽管 S2R+ 细胞可在其他昆虫细胞培养基中良好生长（例如，SF900 或 Schneider's 昆虫培养基）时，它们通常会失去对 Fog 的反应性。S2R+ 细胞传代次数过高（一般超过 20–25 代）后，开始降低对 RNAi 的敏感性。因此，所有实验最好使用低代次细胞。RNAi 敲低实验的另一个重要方面是选择适当的对照。常见的阴性对照包括靶向 EGFP 或 pBlueScript 的 dsRNA，二者在果蝇基因组中均无同源序列。靶向 Fog 信号通路中的蛋白（Rho、Rok、 等等。），这些基因在缺失时可阻止非肌球蛋白收缩力的激活，也可作为有用的对照。S2:Fog-Myc 细胞可在替代性细胞培养基（如 SF900）中维持培养，该培养基需添加 100 单位/毫升的青霉素和 100 µg/mL 链霉素和 0.25 两性霉素 B。请注意，在 SF900 培养基中培养细胞时无需添加胎牛血清（FBS）。细胞密度也是影响所有培养环节的关键因素 果蝇 组织培养细胞。与哺乳动物组织培养细胞不同， 果蝇-衍生的组织培养细胞在较高细胞密度下生长最佳（密度不低于 5 x 105 细胞/mL）。然而，在进行该实验时，必须注意细胞在刀豆蛋白A（con-A）包被的玻璃底培养皿上的接种密度不得超过80%汇合度，否则将影响收缩细胞的定量分析 与 未收缩的细胞将变得极为繁琐。
细胞收缩力检测的关键要点与替代方法：
Fog 是触发非肌球蛋白 II 收缩性的配体，其生成是本实验的关键组成部分。fog 基因编码一个由 730 个氨基酸组成的蛋白质，预测分子量约为 ~78 kDa26。疏水性分析显示，Fog 氨基末端含有一段由 12 个疏水残基组成的区域，可能作为分泌信号序列发挥作用。此外，其编码序列还包含多个潜在的 N- 和 O-连接糖基化位点，进一步提示 Fog 是一种分泌蛋白26。支持这一观点的是，Fog 被定位于正在发生顶端收缩的表皮前体细胞中的分泌囊泡内16。在培养基中加入硫酸铜后可诱导 Fog-Myc 的表达，抗 Fog 或抗 Myc 抗体可从诱导培养的细胞上清中检测到一条 150-kD 的蛋白条带，而在未转染 Fog-Myc 构建体的 S2 细胞诱导上清中则无法检测到该条带。该分子量高于 Fog 预测的 80-kD 分子量，提示 S2 细胞的分泌机制可能在胞吐前对 Fog 蛋白进行了糖基化修饰。由于 Fog 纯化过程可能存在批次间差异，建议在所有实验中使用同一批次的 Fog 条件培养基。制备大量浓缩的 Fog-Myc 培养基有助于在多轮实验中保持结果的一致性。
该实验的成功还取决于能否准确识别已发生收缩的细胞。虽然可通过荧光显微镜观察肌动蛋白或非肌球蛋白II的染色来识别收缩细胞，但最可靠的方法仍是通过相差显微镜或微分干涉相差（DIC）显微镜来识别和定量收缩细胞。在大多数标准光学显微镜上，使用20X至40X的放大倍数即可实现准确计数。尽管本方案中使用的是玻璃底培养皿，但该实验也可在涂有刀豆球蛋白A（con A）的标准1.5号玻璃盖玻片上进行。为减少每次实验所需的Fog用量，可在封口膜上放置盖玻片，并在35 mm的组织培养皿中加入Fog。固定质量是该实验的关键环节，固定不良的细胞可能导致假阳性结果。使用新鲜的固定液，并确保细胞固定后始终不干燥，将获得更可靠的结果。最后，计数大量细胞至关重要。通常情况下，在灌注Fog后，仅有30%至50%的未处理或对照RNAi处理的细胞会发生收缩。然而，S2R+细胞本身存在基础水平的收缩，因此需要计数大量细胞，以确保收缩细胞比例的任何变化均源于实验处理。此外，某些参与调控非肌球蛋白II收缩力的蛋白的缺失，即使在无Fog的情况下，也可能导致过度收缩。本文所展示的数据来自三次连续RNAi处理实验，共计数了超过3,600个细胞，且使用的是同一批Fog条件培养基。
细胞收缩力检测的应用：
该收缩力检测方法若与RNAi筛选技术相结合，可为研究细胞信号转导、形态发生及细胞收缩力提供一个强大的系统。此前，该方法已被用于鉴定两个Fog共受体之一21。通过对138种G蛋白偶联受体（GPCRs）在S2R+细胞中进行RNAi介导的靶向筛选，并按照本文所述方案检测其对Fog的响应能力，研究人员发现了一个此前功能未知的单一基因，即现称为Mist的基因。进一步研究表明，Mist不仅在S2R+细胞中Fog诱导的细胞收缩过程中发挥必需作用，而且在发育中Drosophila的原肠胚形成过程中也至关重要21。此外，该检测还被用于证明Ric-8（一种非经典鸟苷酸交换因子）也是Fog信号通路的一个组分27。一系列结合收缩力检测的上位性RNAi实验表明，Ric-8可与Gα12/13亚基Cta相互作用，并介导其在细胞内的定位，这对Fog诱导的细胞收缩至关重要31。
Drosophila 组织培养非常适合初学者，因为细胞可在室温下轻松维持，无需 CO2 或缓冲细胞培养基，只要保持适当的细胞培养密度，细胞状态就十分稳定。该细胞收缩力检测已在本科生细胞生物学课程的实验环节中成功实施，参与的学生此前几乎没有细胞培养或显微镜操作经验。本文所述的细胞收缩力检测是一种强大的基于细胞的工具，可用于基因发现，或用于探究 Fog 信号通路，有助于我们更深入地理解顶端收缩和非肌球蛋白 II 收缩性等发育过程。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢Rogers实验室和Applewhite实验室的成员、Greta Glover，以及里德学院2018年春季细胞生物学课程的学生们，他们为本实验方案的开发做出了贡献。此外，作者感谢Ritz实验室的成员对本文稿的仔细阅读和编辑。本出版物中报道的研究工作得到了美国国家科学基金会（资助号716964）以及里德学院生物学系对D.A.A.和A.R.的资助支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| S2R+ 细胞 | Drosophila Genomics Resorce Center | 150 | 细胞系，经 Fog 处理后表现出收缩性 |
| S2:Fog-myc 细胞 | Drosophila Genomics Resorce Center | 218 | 细胞系，在 pMT 启动子下表达 Fog-myc |
| S2R+ :Sqh-EGFP 细胞 | Drosophila Genomics Resorce Center | 196 | 细胞系，稳定表达与 EGFP 标签融合的 Sqh（非肌球蛋白 II 的调节轻链） |
| Shield and Sang M3 | Sigma-Aldrich | S3652 | 细胞培养基 |
| SF900 昆虫培养基 | Thermofisher Scientific | 12658019 | 替代性细胞培养基 |
| Schneider’s 昆虫培养基 | Thermofisher Scientific | 21720024 | 替代性细胞培养基 |
| 胎牛血清 | Thermofisher Scientific | 16000044 | 培养基添加剂 |
| 抗生素-抗真菌剂（100X） | Thermofisher Scientific | 15240112 | 抗菌/抗真菌培养基添加剂 |
| 刀豆蛋白 A | MP Biomedicals | 150710 | 用于包被培养皿和盖玻片以促进细胞黏附 |
| 玻璃底培养板 | Maktek | P35G-1.5-10 | 用于实验以及细胞的固定和染色 |
| 玻璃盖玻片 | Corning | 2940-225 | 可替代玻璃底培养皿 |
| 蛋白浓缩器 | Millipore | UFC903008 | 分子量截留值为 30,000，用于浓缩培养基 |
| 25 cm²、75 cm²、150 cm² 组织培养瓶 | Genessee | 25-204,25-206,25-208,25-210 | 用于细胞培养 |
| 6 孔和 12 孔组织培养板 | Genessee | 25-105, 25-106 | 用于细胞培养 |
| 荧光封片剂 | Dako | S3023 | 用于保存固定后的细胞 |
| 32% 多聚甲醛 | EMS | 15714-S | 用于细胞固定 |
| Pipes | EMS | 19240 | 用于细胞固定中的 PEM 缓冲液 |
| 抗 Myc 抗体 | Drosophila Hybirdoma Bank | cat# 9E10 | 用于检测 Fog-Myc |
| 磷酸化丝氨酸-19 抗体 | Cell Signaling | 3671 | 针对调节轻链（RLC）丝氨酸 19 位点磷酸化的抗体 |
| 488-鬼笔环肽、568-鬼笔环肽 | Thermofisher Scientific | A12379, A12380 | 用于 F-肌动蛋白染色 |
| Hawk-VT 多点阵列扫描共聚焦系统 | VisiTech International | 用于 S2R+:Sqh 细胞的活细胞成像 | |
| Eclipse TE300 倒置显微镜 | Nikon | 用于 S2R+:Sqh 细胞的活细胞成像 |
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