本方案描述了将玻璃窗植入小鼠脊髓以通过活体显微镜观察的方法。
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本文内容
摘要
摘要
本方案描述了一种用于小鼠脊髓活体成像的脊髓椎板切除术及玻璃窗植入方法。in vivo 成像过程中采用集成式数字蒸发器，以低流量异氟烷实现稳定的麻醉状态。手术中去除单个椎体棘突，并将市售盖玻片覆盖于薄层琼脂糖床之上。随后使用组织粘合剂和牙科水泥将3D打印的塑料背板固定于相邻的椎体棘突上。通过使用稳定平台，可减少呼吸和心跳引起的运动伪影。该快速、无需夹具的方法特别适用于急性多光子荧光显微镜观察。文中还提供了代表性数据，展示了该技术在表达eGFP:Claudin-5（一种紧密连接蛋白）的转基因小鼠脊髓血管两光子显微成像中的应用。
引言
表达荧光蛋白的转基因动物模型与活体显微镜技术相结合，为研究生物学与病理生理学过程提供了强大的平台。将这些技术应用于脊髓成像时，需要采用专门的实验方案来制备脊髓样本。其中一种策略是实施椎板切除术并植入脊髓观察窗。理想的用于显微成像的椎板切除术方案应具备以下关键特征：保持组织原有的结构与功能、成像视野的稳定性、操作时间短以及结果可重复。一个特别的挑战在于如何抑制由呼吸和心跳引起的组织运动对成像视野造成的干扰。多种 离体 和 体内 已报道有多种策略可实现这些目标1,2,3,4,5. 大多数 体内 方法包括夹住脊柱两侧2,4 并常伴随植入刚性金属装置3,4 用于手术期间及后续成像应用中的稳定性。夹紧脊柱可能影响血流，并诱导血脑屏障（BBB）蛋白重塑。
该方法旨在以最小侵入性操作....
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方案
所有实验均遵循伊利诺伊大学芝加哥分校机构动物照护与使用委员会的方案。本实验为终末性操作。
1. 试剂准备
- 制备人工脑脊液（aCSF），其中包含 125 mM NaCl、5 mM KCl、10 mM 葡萄糖、10 mM HEPES、2 mM MgCl2·6H2O、2 mM CaCl2·2H2O，溶于 ddH2O 中。经无菌滤器过滤后，分装成单次使用量并冷冻保存。使用前在水浴中将 aCSF 加热至 39 °C。
- 将 2% 低熔点琼脂糖溶于 aCSF 中，在 65 °C 水浴中加热至完全溶解。在进行椎板切除术期间，将已融化的琼脂糖分装样品置于 39 °C 水浴中冷却，以便在步骤 5.2 中接近生理温度时即可使用。
注意：琼脂糖溶液可分装成单次用量，于 -20 °C 保存。 - 用抑菌水配制无菌的 50 mg/mL 卡洛芬，4 °C 保存。
- 用 70% 乙醇清洗盖玻片，再用 ddH2O 洗涤三次，置于无尘容器中干燥保存。
2. 背板3D打印
- 使用 3D CAD 软件创建符合 图 1 所示尺寸的模型。....
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结果
植入式玻璃窗结合活体双光子显微镜技术为评估中枢神经系统（CNS）蛋白质的动态变化提供了有力工具。血脑屏障（BBB）的功能完整性受到紧密连接蛋白的表达水平、亚细胞定位以及周转速率的影响7。先前的研究表明，紧密连接蛋白在稳态条件下会经历快速而动态的重塑过程8。目前所描述的椎板切除术及玻璃窗制备方法已应用于表达eGFP标记的Claudin-5转基因小鼠9，该模型具有荧光标记的紧密连接蛋白，可用于在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）多发性硬化模型中评估血脑屏障紧密连接的重塑过程10。在代表性数据中，使用激发波长为920 nm、配备40×红外物镜（0.8 NA）和绿色荧光发射滤光片的双光子显微镜对eGFP:Claudin-5进行成像（图4）。沿轴向以2 µm步长采集光学切片，深度达硬脑膜表面下100 µm。数据展示了整个血管丛中荧光标.......
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讨论
本文所述方法可通过玻璃窗实现对小鼠脊髓的稳定成像。该方法已应用于评估表达荧光血脑屏障紧密连接蛋白的转基因 eGFP:Claudin5+/- 小鼠中血脑屏障（BBB）的重塑过程，但同样适用于对脊髓中任何荧光蛋白或细胞的研究。
已开发出多种椎板切除和脊髓稳定的方法。所有方案均旨在成像过程中及实施窗口以实现对目标结构可视化时，对脊髓进行固定。不同可用方案在切除椎骨的数量以及侵入程度方面存在差异（例如， 将组件粘附于浅表骨表面，如本方案所述 与 嵌入得更深）。Davalos 和 Akassoglou2 采用可拆卸夹具固定小鼠脊柱两侧及尾基部，建立了一种用于稳定脊髓的椎板切除方法。这种悬吊动物的创新策略减轻了因肺部扩张撞击手术台所导致的部分胸段移位。为形成容纳浸液以用于水浸物镜显微镜观察的腔室，使用明胶密封圈构建边缘例如 在脊髓周围制作了琼脂糖密封圈，并用aCSF填充。密封圈边缘可能在成像过程中被破坏，但可在实验结束时轻松擦除，以便关闭创口并进行后续重复成像。该方法已被广泛采用
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
S.E. Lutz 获得美国国立卫生研究院转化科学促进国家中心资助（项目编号 KL2TR002002）以及伊利诺伊大学芝加哥分校医学院启动资金的支持。Simon Alford 获得 RO1 MH084874 项目资助。本内容由作者全权负责，不代表 NIH 的官方观点。作者感谢哥伦比亚大学医学中心神经病学系的 Dritan Agalliu 提供 Tg eGFP:Claudin-5 小鼠，并在手术方案和成像应用的开发方面提供了科学讨论和指导。作者感谢加州大学欧文分校神经生物学与行为系的 Sunil P. Gandhi 设计了第一代立体定位装置和动物体温控制器原型，就手术方案进行了讨论，并提供了双光子显微镜技术的培训。作者还感谢 W. Nuhsbaum 公司的 Steve Pickens 协助定制手术用体视显微镜，以及 Whale Manufacturing 公司的 Ron Lipinski 负责加工立体定位组件。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3D 打印机 | Raise3D | Pro2 | 用于打印背板 |
| PLA 3D 打印耗材 | Inland | PLA+-175-B | 黑色塑料 3D 打印材料 |
| 3D CAD 软件 | Dassault Systemes | Solidworks software | 用于设计 3D 形状 |
| 3D 打印机软件 | Raise3D | Ideamaker software | 用于与 3D 打印机进行交互的软件 |
| 3D 打印椭圆形背板 | custom | 稳定成像视野 | |
| 手术解剖显微镜 | Leica | M205 C | 配备 Leica FusionOptics、Planapo 0.63x M 系列物镜和滑动载物台 |
| 显微镜相机 | Leica | MC170 | 用于可视化手术区域的高清彩色相机 |
| 滑动载物台 | Leica | 10446301 | 滑动载物台由两块金属板构成。底板固定，上板在润滑界面上滑动，以实现旋转和线性移动 |
| 手术台和稳定叉 | Whale Manufactoring | custom | 用于椎板切除术 |
| SomnoSuite 低流量异氟烷输送系统 | Kent Scientific | SS-01 | 配备集成数字蒸发器的手术麻醉给药装置 |
| 不锈钢 1.5 英寸安装柱 | ThorLabs | P50/M | 用于将手术台安装到双光子成像用光学平台 |
| 适用于 1.5" 安装柱的沉头夹紧叉 | ThorLabs | PF175 | 用于在双光子成像过程中将手术台支架稳定固定在光学平台上 |
| 理想骨科微型钻 | Harvard apparatus | 72-6065 | 用于椎板切除术中减薄骨组织 |
| 水浴锅 | Fisher Scientific | 15-462-10 | 用于加热生理盐水 |
| 电凝枪 | FST | 18010-00 | 用于电凝轻微出血 |
| 加热垫 | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” 硅胶加热器，带 20” 铁氟龙导线，10W，5V |
| K 型热电偶直肠探头 | Physitemp | RET3 | 用于测量小鼠体温 |
| 凡士林 | Sigma | 8009-03-8 | 润滑直肠探头 |
| 反馈调节式温控器 | custom | NA | 市售替代品包括 Physitemp TCAT 系列 |
| PVA 外科眼用棉签 | Beaver-visitec international | 40400-8 | 用于吸除血液 |
| 电动剃毛器 | Wahl | 41590-0438 | 用于修剪小鼠毛发 |
| 刀片，#11 | FST | 14002-14 | 手术工具 |
| 镊子，#5 | FST | 11254-20 | 手术工具 |
| 镊子，#4 | FST | 14002-14 | 手术工具 |
| 钛制齿状镊 | WPI | 555047FT | 手术工具 |
| 钛制虹膜剪 | WPI | 555562S | 手术工具 |
| Vetbond 组织粘合剂 | 3M | 084-1469SB | 用于为牙科丙烯酸材料处理组织表面 |
| 陶瓷混合托盘 | Jack Richeson | 420716 | 用于混合牙科丙烯酸剂与加速剂 |
| Orthojet 牙科丙烯酸材料 | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | 用于将背板永久粘合至组织 |
| 小型圆形盖玻片，#1 厚度，3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | 光学窗口 |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | 用于 aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | 用于 aCSF |
| 葡萄糖 | Fisher Scientific | 50-99-7 | 用于 aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 用于 aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | 用于 aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | 用于 aCSF |
| 卡洛芬 | Rimadyl | QM01AE91 | 镇痛 |
| 抑菌水 | Henry Schein | 2587428 | 卡洛芬的稀释剂 |
| 异氟烷 | Henry Schein | 11695-6776-2 | 麻醉 |
| 乳酸林格液 | Baxter | 0338-0117-04 | 用于小鼠补液 |
| 高电渗流动琼脂糖 | Sigma | A9793 | 凝胶点 34–37 摄氏度 |
| 眼科润滑软膏 | Akwa Tears | 68788-0697 | 防止角膜干燥 |
| MOM 双光子显微镜 | Sutter |
参考文献
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. Journa....
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重印与许可
