本方案描述了将玻璃窗植入小鼠脊髓以通过活体显微镜观察的方法。
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摘要
摘要
本方案描述了一种用于小鼠脊髓活体成像的脊髓椎板切除术及玻璃窗植入方法。in vivo 成像过程中采用集成式数字蒸发器，以低流量异氟烷实现稳定的麻醉状态。手术中去除单个椎体棘突，并将市售盖玻片覆盖于薄层琼脂糖床之上。随后使用组织粘合剂和牙科水泥将3D打印的塑料背板固定于相邻的椎体棘突上。通过使用稳定平台，可减少呼吸和心跳引起的运动伪影。该快速、无需夹具的方法特别适用于急性多光子荧光显微镜观察。文中还提供了代表性数据，展示了该技术在表达eGFP:Claudin-5（一种紧密连接蛋白）的转基因小鼠脊髓血管两光子显微成像中的应用。
引言
表达荧光蛋白的转基因动物模型与活体显微镜技术相结合，为研究生物学与病理生理学过程提供了强大的平台。将这些技术应用于脊髓成像时，需要采用专门的实验方案来制备脊髓样本。其中一种策略是实施椎板切除术并植入脊髓观察窗。理想的用于显微成像的椎板切除术方案应具备以下关键特征：保持组织原有的结构与功能、成像视野的稳定性、操作时间短以及结果可重复。一个特别的挑战在于如何抑制由呼吸和心跳引起的组织运动对成像视野造成的干扰。多种 离体 和 体内 已报道有多种策略可实现这些目标1,2,3,4,5. 大多数 体内 方法包括夹住脊柱两侧2,4 并常伴随植入刚性金属装置3,4 用于手术期间及后续成像应用中的稳定性。夹紧脊柱可能影响血流，并诱导血脑屏障（BBB）蛋白重塑。
该方法旨在以最小侵入性操作和改善实验结果为前提，使活体小鼠的完整脊髓可用于光学成像。我们描述了一种单侧椎板切除联合盖玻片植入手术，并结合使用一种微创的椭圆形塑料3D打印背板，仍可实现良好的机械稳定性。背板通过牙科水泥直接粘附于椎体的前部和后部棘突。背板配备有带螺孔的侧向延伸臂，可通过金属臂牢固地连接至显微镜载物台。该设计有效地将完整的前后椎体锚定于显微镜载物台上，从而抵抗由呼吸和心跳引起的运动伪影。本方法已针对胸椎第12节（T12）单个椎体的椎板切除术进行了优化，省去了其他稳定策略中所使用的夹具。 体内 成像。该操作快速，每只小鼠约需30分钟。
本方案可用于研究血脑屏障（BBB）的疾病机制。血脑屏障是一种由内皮细胞、血管平滑肌、周细胞和星形胶质细胞足突组成的动态微血管系统，为中枢神经系统（CNS）提供高度选择性的环境。所提供的代表性数据展示了该方案在转基因小鼠中的应用，这些小鼠经基因工程改造后表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）：Claudin-5，一种血脑屏障紧密连接蛋白。所提供的背板打印文件也可根据其他应用进行定制。
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方案
所有实验均遵循伊利诺伊大学芝加哥分校机构动物照护与使用委员会的方案。本实验为终末性操作。
1. 试剂准备
- 制备人工脑脊液（aCSF），其中包含 125 mM NaCl、5 mM KCl、10 mM 葡萄糖、10 mM HEPES、2 mM MgCl2·6H2O、2 mM CaCl2·2H2O，溶于 ddH2O 中。经无菌滤器过滤后，分装成单次使用量并冷冻保存。使用前在水浴中将 aCSF 加热至 39 °C。
- 将 2% 低熔点琼脂糖溶于 aCSF 中，在 65 °C 水浴中加热至完全溶解。在进行椎板切除术期间，将已融化的琼脂糖分装样品置于 39 °C 水浴中冷却，以便在步骤 5.2 中接近生理温度时即可使用。
注意：琼脂糖溶液可分装成单次用量，于 -20 °C 保存。 - 用抑菌水配制无菌的 50 mg/mL 卡洛芬，4 °C 保存。
- 用 70% 乙醇清洗盖玻片，再用 ddH2O 洗涤三次，置于无尘容器中干燥保存。
2. 背板3D打印
- 使用 3D CAD 软件创建符合 图 1 所示尺寸的模型。其内部为椭圆形，相对于打印机而言底部表面最宽，并通过放样切割形成对侧表面较小的椭圆形管腔。两个带孔的伸出臂向两侧延伸，用于连接固定叉形背板。根据此 3D 结构生成三角化的 3D 网格文件（.STL 文件）。
注意：参见 图 1B‒D 以及 补充文件 1 和 2。 - 将三角化的 3D 网格文件上传至 3D 打印机。
- 使用 0.4 mm 热端喷嘴和 0.2 mm 层高进行背板打印。选择喷嘴温度为 205 °C，热床温度为 45 °C，打印速度为 45 mm/s。
- 目视评估所获得的 3D 打印背板的结构完整性（图 1E）；若出现明显结构失效（如管腔缺失、壁塌陷），则表明存在打印缺陷（图 1F）。
3. 手术准备
- 预热加热垫。
- 在化学通风橱内操作，将异氟烷加入给药注射器中，并将给药注射器连接至异氟烷装置。
- 选择一只8‒12周龄的小鼠，称量其体重。使用2%异氟烷在诱导室中进行麻醉诱导，并皮下注射5 mg/kg的卡洛芬。
- 安装鼻罩，以150 mL/min的气流速度输送2%异氟烷，以维持手术麻醉深度（图2A‒E）。用一次性吸水垫包裹加热垫，便于清洁。
- 将动物置于手术台的加热垫上，并安装鼻罩。用凡士林润滑体温计后，将其插入直肠5 mm，并用胶带将体温探头固定于尾巴上以保持稳定。为小鼠双眼涂抹眼用软膏。
- 为维持水合状态，每30分钟皮下注射200 µL乳酸林格氏液，直至实验结束。
- 用70%乙醇喷洒背部，使用电推剪去除毛发，并用聚维酮碘清洁手术部位。
4. 椎板切除术
- 将动物置于耳杆之间；耳杆用于维持小鼠头部相对于鼻罩的位置。
- 通过检查无趾间夹捏反射及呼吸节律稳定，确认动物已处于深度麻醉状态。
- 使用#11刀片在下胸部/上腰部区域的中线处做一条1.5 cm的头尾向切口（图2）。用钝齿镊子和/或戴手套的手指夹住皮肤并分离。用镊子分离并掀开皮肤下方残留的透明结缔组织。此时应暴露浅层肌层；用泡沫外科探针将其移开。
- 使用泡沫外科探针（或刮匙）清除目标椎骨（胸椎12）残余的深层肌肉组织。为安装背板，还需清除胸椎11后侧面及胸椎13前侧面的肌肉。通过外科探针施加轻柔压力，或使用电凝枪进行最小脉冲处理，以控制出血。继续用镊子将残余肌肉从肌腱处剥离。
- 肌肉清除后，用镊子小心切断肌腱。完成此步骤后，应有足够的空间用于观察和操作脊髓。检查椎间区域的硬脊膜、半透明的椎板骨、骨下方中央浅表血管以及前放射状动脉是否均已清晰可见。
- 用温热的aCSF润湿该区域。使用微型钻头沿脊髓长轴方向进行反复直线运动，以逐步磨薄椎板骨（图2，图3）。如需要，可使用滑动平台旋转手术台以提高操作的人体工学舒适度（例如，右利手操作者可在钻孔步骤中逆时针旋转手术平台）。
注意：所用滑动平台由上层铝板构成，相对于固定底板可滑动±15 mm。 - 用镊子轻轻夹住浅表棘突并抬起椎骨；骨组织应能轻松抬起。若遇阻力，需重复使用钻头进一步磨薄骨质，必要时可使用虹膜剪，操作时注意将剪刀尖朝上，避免损伤组织。
注意：为保持硬脊膜完整，切勿牵拉骨组织。 - 使用#4镊子清除任何骨碎片。用外科探针施加轻柔而持续的压力以控制出血。用温热的aCSF冲洗组织，切勿使组织干燥。
5. 盖玻片植入
- 将一片 3 mm 的硼硅酸盐盖玻片轻轻覆盖在暴露的脊髓上。
- 确保琼脂糖已冷却至 39 °C。使用小刮刀将温热的 2% 琼脂糖/aCSF 溶液涂抹于盖玻片边缘，利用毛细作用使其渗入盖玻片下方。
注意：当温度低于 39 °C 时，琼脂糖可能开始凝胶化。若发生此情况，可使用水浴或微波炉重新加热。部分操作者倾向于先滴加一滴琼脂糖，再将盖玻片覆盖其上。 - 在完整相邻椎体的暴露骨性关节突表面（胸椎第 11 节和胸椎第 13 节椎体棘突处）涂抹组织粘合剂。在椎板切除部位周围、邻近肌腱及横突上，再以环形方式额外涂抹组织粘合剂。
注意：组织粘合剂对于后续步骤中牙科水泥的牢固粘附至关重要。关节突可为背板提供天然的稳定支撑位点（图 3）。与关节突的粘附将形成最强的固定点。 - 在瓷质调拌盘中将牙科水泥与加速剂混合。使用小刮刀将牙科水泥转移至组织粘合剂层上。利用牙科水泥将背板粘附于手术区域，确保背板居中覆盖观察窗。静置 10 分钟使牙科水泥固化。
注意：背板牢固粘附于前、后关节突，是植入装置结构稳定性的基础。 - 使用额外的牙科水泥填充背板内部基底以及背板与组织界面的下方区域。
注意：额外涂抹牙科水泥可增强粘附性，并降低显微镜物镜浸没液（生理盐水）从背板底部渗漏的风险。 - 将叉形背板固定夹推进至观察窗上方的适当位置。使用螺钉将背板固定于背板固定夹中。
注意：本方案使用了定制加工的背板固定夹（图 2G‒H）。 - 向背板上滴加生理盐水以检测是否渗漏。若发现液体渗出，应先干燥该区域，再补充涂抹牙科水泥。
6. 成像前准备
- 将动物转移到手术平台上的光学台。
注意：我们的手术平台、背板固定器和异氟烷鼻罩固定器可作为一个整体单元在手术站与双光子成像站之间转运，同时持续施用异氟烷麻醉图 2D,H）。类似的装置可由商用的持针叉、横梁和支撑柱组装而成（例如ThorLabs）。进行活体显微成像时，显微镜物镜与光学平台之间应至少保留11英寸的空间，以容纳手术平台的高度。 - 使用不锈钢安装柱和沉孔夹持叉将手术平台固定在光学平台上。
- 将新鲜的生理盐水加入背板的孔中。将水浸物镜浸入孔内的液体中。
- 使用透射光或落射荧光观察以确定目标区域并调焦。切换至激光扫描模式并进行 体内 根据组织中荧光染料所对应的双光子激光激发波长、二向色镜和带通滤光片进行成像6.
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结果
植入式玻璃窗结合活体双光子显微镜技术为评估中枢神经系统（CNS）蛋白质的动态变化提供了有力工具。血脑屏障（BBB）的功能完整性受到紧密连接蛋白的表达水平、亚细胞定位以及周转速率的影响7。先前的研究表明，紧密连接蛋白在稳态条件下会经历快速而动态的重塑过程8。目前所描述的椎板切除术及玻璃窗制备方法已应用于表达eGFP标记的Claudin-5转基因小鼠9，该模型具有荧光标记的紧密连接蛋白，可用于在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）多发性硬化模型中评估血脑屏障紧密连接的重塑过程10。在代表性数据中，使用激发波长为920 nm、配备40×红外物镜（0.8 NA）和绿色荧光发射滤光片的双光子显微镜对eGFP:Claudin-5进行成像（图4）。沿轴向以2 µm步长采集光学切片，深度达硬脑膜表面下100 µm。数据展示了整个血管丛中荧光标...
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讨论
本文所述方法可通过玻璃窗实现对小鼠脊髓的稳定成像。该方法已应用于评估表达荧光血脑屏障紧密连接蛋白的转基因 eGFP:Claudin5+/- 小鼠中血脑屏障（BBB）的重塑过程，但同样适用于对脊髓中任何荧光蛋白或细胞的研究。
已开发出多种椎板切除和脊髓稳定的方法。所有方案均旨在成像过程中及实施窗口以实现对目标结构可视化时，对脊髓进行固定。不同可用方案在切除椎骨的数量以及侵入程度方面存在差异（例如， 将组件粘附于浅表骨表面，如本方案所述 与 嵌入得更深）。Davalos 和 Akassoglou2 采用可拆卸夹具固定小鼠脊柱两侧及尾基部，建立了一种用于稳定脊髓的椎板切除方法。这种悬吊动物的创新策略减轻了因肺部扩张撞击手术台所导致的部分胸段移位。为形成容纳浸液以用于水浸物镜显微镜观察的腔室，使用明胶密封圈构建边缘例如 在脊髓周围制作了琼脂糖密封圈，并用aCSF填充。密封圈边缘可能在成像过程中被破坏，但可在实验结束时轻松擦除，以便关闭创口并进行后续重复成像。该方法已被广泛采用
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
S.E. Lutz 获得美国国立卫生研究院转化科学促进国家中心资助（项目编号 KL2TR002002）以及伊利诺伊大学芝加哥分校医学院启动资金的支持。Simon Alford 获得 RO1 MH084874 项目资助。本内容由作者全权负责，不代表 NIH 的官方观点。作者感谢哥伦比亚大学医学中心神经病学系的 Dritan Agalliu 提供 Tg eGFP:Claudin-5 小鼠，并在手术方案和成像应用的开发方面提供了科学讨论和指导。作者感谢加州大学欧文分校神经生物学与行为系的 Sunil P. Gandhi 设计了第一代立体定位装置和动物体温控制器原型，就手术方案进行了讨论，并提供了双光子显微镜技术的培训。作者还感谢 W. Nuhsbaum 公司的 Steve Pickens 协助定制手术用体视显微镜，以及 Whale Manufacturing 公司的 Ron Lipinski 负责加工立体定位组件。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3D 打印机 | Raise3D | Pro2 | 用于打印背板 |
| PLA 3D 打印耗材 | Inland | PLA+-175-B | 黑色塑料 3D 打印材料 |
| 3D CAD 软件 | Dassault Systemes | Solidworks software | 用于设计 3D 形状 |
| 3D 打印机软件 | Raise3D | Ideamaker software | 用于与 3D 打印机进行交互的软件 |
| 3D 打印椭圆形背板 | custom | 稳定成像视野 | |
| 手术解剖显微镜 | Leica | M205 C | 配备 Leica FusionOptics、Planapo 0.63x M 系列物镜和滑动载物台 |
| 显微镜相机 | Leica | MC170 | 用于可视化手术区域的高清彩色相机 |
| 滑动载物台 | Leica | 10446301 | 滑动载物台由两块金属板构成。底板固定，上板在润滑界面上滑动，以实现旋转和线性移动 |
| 手术台和稳定叉 | Whale Manufactoring | custom | 用于椎板切除术 |
| SomnoSuite 低流量异氟烷输送系统 | Kent Scientific | SS-01 | 配备集成数字蒸发器的手术麻醉给药装置 |
| 不锈钢 1.5 英寸安装柱 | ThorLabs | P50/M | 用于将手术台安装到双光子成像用光学平台 |
| 适用于 1.5" 安装柱的沉头夹紧叉 | ThorLabs | PF175 | 用于在双光子成像过程中将手术台支架稳定固定在光学平台上 |
| 理想骨科微型钻 | Harvard apparatus | 72-6065 | 用于椎板切除术中减薄骨组织 |
| 水浴锅 | Fisher Scientific | 15-462-10 | 用于加热生理盐水 |
| 电凝枪 | FST | 18010-00 | 用于电凝轻微出血 |
| 加热垫 | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” 硅胶加热器，带 20” 铁氟龙导线，10W，5V |
| K 型热电偶直肠探头 | Physitemp | RET3 | 用于测量小鼠体温 |
| 凡士林 | Sigma | 8009-03-8 | 润滑直肠探头 |
| 反馈调节式温控器 | custom | NA | 市售替代品包括 Physitemp TCAT 系列 |
| PVA 外科眼用棉签 | Beaver-visitec international | 40400-8 | 用于吸除血液 |
| 电动剃毛器 | Wahl | 41590-0438 | 用于修剪小鼠毛发 |
| 刀片，#11 | FST | 14002-14 | 手术工具 |
| 镊子，#5 | FST | 11254-20 | 手术工具 |
| 镊子，#4 | FST | 14002-14 | 手术工具 |
| 钛制齿状镊 | WPI | 555047FT | 手术工具 |
| 钛制虹膜剪 | WPI | 555562S | 手术工具 |
| Vetbond 组织粘合剂 | 3M | 084-1469SB | 用于为牙科丙烯酸材料处理组织表面 |
| 陶瓷混合托盘 | Jack Richeson | 420716 | 用于混合牙科丙烯酸剂与加速剂 |
| Orthojet 牙科丙烯酸材料 | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | 用于将背板永久粘合至组织 |
| 小型圆形盖玻片，#1 厚度，3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | 光学窗口 |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | 用于 aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | 用于 aCSF |
| 葡萄糖 | Fisher Scientific | 50-99-7 | 用于 aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 用于 aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | 用于 aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | 用于 aCSF |
| 卡洛芬 | Rimadyl | QM01AE91 | 镇痛 |
| 抑菌水 | Henry Schein | 2587428 | 卡洛芬的稀释剂 |
| 异氟烷 | Henry Schein | 11695-6776-2 | 麻醉 |
| 乳酸林格液 | Baxter | 0338-0117-04 | 用于小鼠补液 |
| 高电渗流动琼脂糖 | Sigma | A9793 | 凝胶点 34–37 摄氏度 |
| 眼科润滑软膏 | Akwa Tears | 68788-0697 | 防止角膜干燥 |
| MOM 双光子显微镜 | Sutter |
参考文献
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重印与许可
