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方法文章

各向异性聚合物人工抗原呈递细胞的制备及其在CD8+ T细胞活化中的应用

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DOI：

10.3791/58332

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2018年10月12日

 ,  ,  , 
1Biomedical Engineering, Translational Tissue Engineering Center, Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Biomedical Engineering, Translational Tissue Engineering Center, Institute for Nanobiotechnology, Ophthalmology, Oncology, Neurosurgery, Materials Science and Engineering, Chemical and Biomolecular Engineering, and the Bloomberg-Kimmel Institute for Cancer Immunotherapy, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种可快速、可重复地制备具有可调控大小、形状及表面蛋白呈递能力的仿生可降解人工抗原呈递细胞（aAPC）的实验方案，用于T细胞扩增。 离体 或 体内.

摘要

人工抗原呈递细胞（aAPC）因其强大的T细胞刺激能力，成为一种极具前景的免疫调节平台。与基于细胞的aAPC相比，无细胞基质具有显著优势，包括能够精确控制信号呈递参数以及aAPC表面的物理特性，从而调控其与T细胞的相互作用。由各向异性颗粒（特别是椭球形颗粒）构建的aAPC已被证明比球形颗粒在刺激T细胞方面更为有效，这归因于其更强的结合能力、更大的T细胞接触表面积，以及更低的非特异性摄取和更优的药代动力学特性。尽管对各向异性颗粒的兴趣日益增加，但即使是诸如薄膜拉伸等已被广泛接受的各向异性颗粒制备方法，在实际操作和可重复性方面仍面临挑战。

为此，我们描述了一种快速、标准化制备可生物降解的各向异性颗粒基人工抗原呈递细胞（aAPC）的方案，该aAPC具有可调控的尺寸、形状及信号呈递特性，适用于T细胞扩增。 离体 或 体内，以及表征其大小、形态和表面蛋白含量并评估其功能的方法。该制备各向异性人工抗原呈递细胞（aAPC）的方法具有可扩展性和可重复性，非常适合用于生成aAPC "现成的" 免疫疗法

引言

人工抗原呈递细胞（aAPC）作为免疫调节剂已展现出良好的应用前景，因其能够引发强烈的抗原特异性T细胞反应。这些平台的关键在于其能高效地呈递T细胞活化所必需的关键信号。无细胞aAPC相较于基于细胞的aAPC更具吸引力，因为其制备更简便、成本更低，在放大生产和临床转化过程中面临的挑战更少，并且可降低基于细胞治疗的相关风险。此外，无细胞aAPC还可高度精确地调控与T细胞相互作用的表面信号呈递参数及其物理特性1。

人工抗原提呈细胞（aAPC）必须模拟T细胞活化所必需的至少两种信号。信号1提供抗原识别，当T细胞受体（TCR）识别并结合携带其同源抗原的MHC I类或II类分子时触发，最终通过TCR复合物传导信号。为了绕过对抗原特异性的要求，aAPC系统通常携带针对CD3受体的激动型单克隆抗体，以非特异性地激活TCR复合物。此外，可溶性MHC的重组形式，特别是MHC多聚体，也已被用于aAPC表面以提供抗原特异性。2,3信号2是一种调控T细胞活性的共刺激信号。为了提供T细胞活化所需的共刺激信号，通常通过人工抗原呈递细胞（aAPC）表面呈递的激动型抗体刺激CD28受体，尽管其他共刺激受体（如4-1BB）也已被成功靶向4信号1和信号2蛋白通常被固定在刚性颗粒表面以合成人工抗原呈递细胞（aAPC）。历史上，aAPC由多种材料制备而成，包括聚苯乙烯4,5 右旋糖酐铁6较新的系统采用可生物降解的聚合物，如聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），以制备可高效偶联信号蛋白的人工抗原呈递细胞（aAPC），适用于直接给药 体内，并可促进包封的细胞因子或可溶性因子的持续释放，以增强T细胞活化7,8.

除了必要的信号蛋白的存在外，在人工抗原呈递细胞（aAPC）与T细胞相互作用过程中，受体在足够大的表面积上发生结合对于T细胞的活化至关重要。因此，aAPC的物理参数（如尺寸和形状）会显著改变其可接触的接触面积，进而影响其刺激T细胞的能力。研究表明，微米级的aAPC比纳米级的aAPC在刺激T细胞方面更为有效。9,10然而，纳米级人工抗原呈递细胞（nano-aAPC）可能具有更优的生物分布特性以及更佳的淋巴结引流能力，从而增强其功能表现 体内 微小人工抗原呈递细胞11形状是基于颗粒的 aAPC 系统中另一个受关注的变量。最近研究表明，各向异性 aAPC 在刺激 T 细胞方面优于各向同性颗粒，主要归因于其与靶细胞的相互作用增强，同时非特异性细胞摄取减少。细胞优先结合到椭球形颗粒的长轴上，而较大的曲率半径和平坦的表面使得 aAPC 与 T 细胞之间的接触面积更大12椭球形颗粒的长轴也不利于吞噬作用，导致其在体内的循环时间较球形颗粒更长。 体内 给药12,13由于这些优势，椭球形颗粒可介导抗原特异性T细胞更显著的扩增 体外 和 在体 与球形颗粒相比，该效应在微米和纳米尺度上均有观察到12,13有多种策略可用于制备各向异性颗粒，但薄膜拉伸是一种简单且被广泛接受的方法，可用于制备多种不同形状的颗粒。14合成后，将颗粒铸造成薄膜，并在高于颗粒材料玻璃化转变温度的条件下进行一维或二维拉伸。随后溶解薄膜以回收颗粒。尽管各向异性颗粒日益受到关注，目前基于颗粒的 aAPC 制备方法仍主要局限于各向同性体系，且改变颗粒形状的方法往往难以实施，与某些 aAPC 合成策略不兼容，并缺乏精确性和可重复性15我们的薄膜拉伸技术可手动或自动操作，能够快速制备由多种可生物降解聚合物合成的各向异性微粒，并在一维或二维方向上拉伸至目标长径比。15.

基于我们之前的研究，我们开发了一种可生物降解的颗粒载体方法，并结合可扩展的薄膜拉伸技术，以标准化方式快速制备具有可调控大小和形状的人工抗原呈递细胞（aAPC），用于T细胞扩增 离体 或 体内我们的蛋白质偶联策略可用于将任意目标蛋白质以特定密度连接至颗粒表面的羧基基团，从而使该人工抗原呈递细胞（aAPC）系统具有高度灵活性。我们还描述了表征aAPC的粒径、形貌及表面蛋白质含量的方法，并介绍了评估其功能活性的实验方案。 体外该方案可轻松调整以扩增免疫细胞 离体 或 体内 用于多种免疫治疗应用。

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方案

本文所述所有方法均已获得约翰斯·霍普金斯大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 可调尺寸球形PLGA颗粒的制备

  1. 颗粒合成材料的制备
    1. 配制5% w/w的聚乙烯醇（PVA）溶液。
      1. 将500 mL去离子水（DI水）加入带有磁力搅拌子的锥形瓶中，置于磁力搅拌加热板上，以500 rpm转速搅拌，并用温度计监测温度。用锡箔纸覆盖瓶口以防止蒸发。
      2. 当水温升至约70 °C时，分批缓慢加入共25 g的PVA，每加一次需等待PVA完全溶解后再加入下一批。
      3. 待所有PVA完全溶解后（通常需30–60分钟），让溶液冷却并进行无菌过滤。4 °C保存以备后续使用。
    2. 配制含10% w/w PVA和2% w/w甘油的成膜溶液。
      1. 将500 mL去离子水加入带有磁力搅拌子的锥形瓶中。在室温下加入8 mL甘油，通过反复吹打混合均匀。
      2. 将锥形瓶置于磁力搅拌加热板上，以500 rpm转速搅拌，并用温度计监测温度。用锡箔纸覆盖瓶口以防止蒸发。
      3. 当溶液温度升至约70 °C时，分批缓慢加入共50 g的PVA，每加一次需等待PVA完全溶解后再加入下一批。
      4. 待所有PVA完全溶解后（通常需60分钟），让溶液冷却，并使用孔径为0.22 μm的瓶顶式真空过滤系统进行无菌过滤。室温保存以备后续使用。
    3. 配制50 mL的1% w/w PVA溶液。取40 mL去离子水和10 mL已配制的5% PVA溶液（步骤1.1.1制得），加入100–150 mL烧杯中。
    4. 配制100 mL的0.5% w/w PVA溶液。取90 mL去离子水和10 mL的5% PVA溶液，加入150–250 mL烧杯中。
    5. 向0.5% PVA溶液中加入磁力搅拌子，置于通风橱内的搅拌板上，室温下以500 rpm转速搅拌。
  2. 微粒合成
    1. 称取100 mg聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）至闪烁瓶中，加入5 mL二氯甲烷（DCM）溶解。涡旋振荡以促进PLGA溶解。
    2. 将匀浆器插入50 mL的1% PVA溶液中，使匀浆器探头尽可能接近烧杯底部但不接触。开启匀浆器并调节至所需转速——5 μm直径颗粒使用3,200 rpm，3 μm颗粒使用5,000 rpm，1 μm颗粒使用15,000 rpm（匀浆速度越高，所得颗粒越小）。达到设定转速后，立即将PLGA溶液加入烧杯中，匀浆1分钟。
    3. 匀浆完成后，将含1% PVA的PLGA微粒溶液倒入置于搅拌板上的100 mL 0.5% PVA溶液中，在通风橱内持续搅拌至少4小时，以促进溶剂挥发。
    4. 用去离子水洗涤颗粒3次。
      1. 将颗粒溶液转移至50 mL离心管中，以3,000 × g离心5分钟。弃去上清液，加入约20 mL去离子水。
      2. 通过涡旋振荡重悬颗粒。重悬后，用去离子水将离心管补至50 mL。
      3. 重复上述洗涤步骤两次。
  3. 纳米颗粒合成
    1. 称取200 mg PLGA至闪烁瓶中，加入5 mL DCM溶解。涡旋振荡以促进PLGA溶解。
    2. 将盛有50 mL 1% PVA溶液的烧杯置于装有冰的容器中。将超声探头插入烧杯中，尽可能接近底部但不接触。启动超声，立即加入PLGA溶液。以12 W功率超声2分钟，以生成直径约为200 nm的纳米颗粒。
    3. 超声完成后，将含1% PVA的PLGA纳米颗粒溶液倒入置于搅拌板上的100 mL 0.5% PVA溶液中，在通风橱内持续搅拌至少4小时，以促进溶剂挥发。
    4. 将颗粒溶液转移至50 mL离心管中，以3,000 × g离心5分钟以去除微米级颗粒。弃去上清液，将剩余物转移至高速离心管中。
    5. 用去离子水洗涤颗粒3次。每次以40,000 × g离心15分钟。弃去上清液，通过涡旋振荡将颗粒重悬于去离子水中。重复上述洗涤步骤两次。

2. 可调控形状的聚合物微粒的制备

  1. 将PLGA颗粒洗涤三次后，将其重悬于约1 mL去离子水中。将成膜溶液加入颗粒中，使颗粒的终浓度为2.5 mg/mL。
  2. 将颗粒悬液以每份10 mL加入75 × 50 mm矩形培养皿中，用于一维拉伸；或以每份15 mL加入100 × 100 mm方形培养皿中，用于二维拉伸。用移液器去除气泡或将气泡推至边缘，然后在化学通风橱中过夜自然干燥成膜。
  3. 薄膜干燥后，用镊子从塑料培养皿中取出薄膜，并用剪刀剪下边缘部分。将边缘部分保存至50 mL锥形管中，用于制备球形颗粒。
    1. 将薄膜装载到自动薄膜拉伸装置上，方法是将薄膜固定在铝块上。对于一维拉伸，将薄膜的两个短边置于氯丁橡胶片之间，并将其固定在拉伸仪一个轴向的两个铝块上（图2）；使用内六角扳手将金属夹具拧紧在橡胶上方，以固定薄膜。对于二维拉伸，将薄膜的四个边缘分别固定在四个铝块上，以实现双轴拉伸（图2）。
    2. 测量并记录一维拉伸时铝块间单轴方向的薄膜长度，或二维拉伸时两个轴向的薄膜长度。根据所需的折叠拉伸倍数，计算薄膜在一个或两个方向上需要拉伸的距离。
    3. 将装载薄膜的拉伸装置放入90 °C烘箱中，用10分钟时间使薄膜升至设定温度。在烘箱内放置一个大烧杯，并加入少量水。
    4. 拉伸薄膜。
    5. 拉伸完成后，将拉伸装置从烘箱中取出，让薄膜在室温下冷却20分钟。
    6. 对于一维拉伸，从拉伸装置边缘处剪下薄膜。对于二维拉伸，剪下并在两个轴向上均匀拉伸的中心方形区域薄膜并保存。将薄膜放入锥形管中，每管放置2片，其余部分弃去。
    7. 向每个锥形管中加入约25 mL去离子水，涡旋振荡直至薄膜完全溶解。
    8. 薄膜完全溶解后，用去离子水洗涤颗粒3次。
      1. 对于微米颗粒，将锥形管加水至50 mL，以3000 × g离心5分钟，倾去上清液，加入约20 mL去离子水，涡旋重悬颗粒。
      2. 对于纳米颗粒，将颗粒转移至高速离心管中，以40,000 × g离心15分钟，倾去上清液，加入约20 mL去离子水，涡旋重悬颗粒。
    9. 第三次洗涤后，将颗粒重悬于约1 mL去离子水中。记录微量离心管的重量，并将颗粒加入管中。在-80 °C冰箱中冷冻1小时，或在液氮中快速冷冻。冷冻完成后，将颗粒冷冻干燥过夜。
    10. 冷冻干燥完成后，称量微量离心管中颗粒的总重量，减去先前记录的空管重量，得到冻干颗粒的净重。

3. 表面蛋白偶联以构建人工抗原呈递细胞

  1. 配制2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液。将MES溶于水，配制成0.1 M的溶液，并用1 M氢氧化钠（NaOH）滴定调节pH至6.0。
  2. 用涡旋振荡法将冻干的PLGA/PBAE微/纳米颗粒以20 μg/mL的浓度重悬于MES缓冲液中。取900 μL MES缓冲液加入聚丙烯微量离心管中，再向管中加入100 μL颗粒溶液。
  3. 配制EDC/NHS溶液。将40 mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）和48 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶于1 mL MES缓冲液中。
  4. 向颗粒中加入100 μL EDC/NHS溶液，涡旋混匀。
  5. 将离心管置于翻转混合仪上，室温孵育30分钟。
  6. 以5,000 × g离心5分钟沉淀微粒，或以17,000 × g离心5分钟沉淀纳米颗粒。弃去上清液，通过涡旋振荡（微粒）或以2–3 W超声5秒（纳米颗粒）将颗粒重悬于1 mL PBS中。
  7. 对于微粒，向颗粒中加入8 μg目标信号1蛋白和10 μg抗小鼠CD28抗体（克隆号37.51）；对于纳米颗粒，加入16 μg信号1蛋白和20 μg抗小鼠CD28抗体。加入PBS使管内总体积达到1.1 mL。
  8. 将离心管置于翻转混合仪上，4 °C过夜孵育。
  9. 次日洗涤颗粒。以5,000 × g离心5分钟沉淀微粒，或以17,000 × g离心5分钟沉淀纳米颗粒。弃去上清液，通过涡旋振荡（微粒）或以2–3 W超声5秒（纳米颗粒）将颗粒重悬于1 mL无菌PBS中。重复洗涤两次。
  10. 将颗粒重悬于培养基中至所需浓度，用于立即使用。如需长期保存，将颗粒以10 mg/mL浓度重悬于100 mM蔗糖溶液中，冷冻、冻干后于-80 °C保存。

4. aAPC 的表征与评估

  1. aAPC 大小和形状的表征图3)
    1. 通过扫描电子显微镜（SEM）成像颗粒来表征微粒的粒径与形态。进行SEM成像时，将冻干颗粒均匀分散于粘附在铝制载物台上的导电碳胶带上，并使用金-钯合金进行溅射镀膜。
    2. 使用图像分析软件分析颗粒的尺寸和长径比。
    3. 使用标尺条设置比例尺，测量颗粒直径以确定粒径。重复测量约100个颗粒，计算平均粒径并生成粒径分布直方图。
    4. 通过测量颗粒长轴和短轴的长度，并将长轴长度除以短轴长度，计算其长径比。对每种形状的约50个颗粒重复该操作，以确定每种形状颗粒的平均长径比，并绘制直方图。
    5. 通过透射电子显微镜（TEM）成像纳米颗粒，表征其粒径与形貌。使用图像分析软件分析纳米颗粒的尺寸和长径比，具体方法见5.1.2。或者，采用动态光散射（DLS）或纳米颗粒追踪分析（NTA）测量球形纳米颗粒的粒径。
  2. 蛋白质偶联效率
    1. 根据方法1-3制备人工抗原呈递细胞（aAPC），但在第3.7步中使用荧光标记的信号1蛋白和抗小鼠CD28抗体。完成偶联和洗涤后，将aAPC重悬于1 mL PBS中，终浓度为2 mg/mL aAPC。
    2. 在黑色聚苯乙烯96孔微孔板中配制蛋白质标准品。在板的第一孔中，将5 μg荧光标记的信号1蛋白加入PBS，沿板排进行10个1:2倍比稀释，最后一孔留空。重复此步骤，用荧光标记的抗CD28蛋白制备另一组标准品。
    3. 将100 μL aAPC溶液用移液器加入黑色聚苯乙烯微孔板的各个孔中，每组设三个复孔。
    4. 在适当的波长下使用荧光酶标仪读取荧光值。利用蛋白质标准品的荧光读数为每种荧光抗体生成标准曲线。根据标准曲线计算各样品孔中信号1和抗CD28的浓度，进而计算表面蛋白含量和偶联效率图 4A, 图 5A).
  3. 评估aAPC用于 体外 CD8+ T细胞的刺激
    1. 制备B’培养基（RPMI培养基添加L-谷氨酰胺、10%胎牛血清、1%非必需氨基酸溶液、1%丙酮酸钠、1% MEM维生素溶液、92 μM β-巯基乙醇、10 ng/mL环丙沙星和30 U/mL IL-2）。
    2. 通过暴露于二氧化碳处死一只C57BL/6小鼠。
    3. 根据先前建立的方案从小鼠中采集脾脏16. 将脾脏收集至含有10–15 mL PBS的50 mL锥形管中。使用研磨杵将脾脏通过70 µm细胞滤筛研磨入另一50 mL锥形管中。研磨过程中，用40 mL PBS冲洗滤筛。
    4. 以 300 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将脾细胞重悬于 4 mL Ack 溶血缓冲液中以裂解红细胞。静置 1 分钟后，加入 PBS 至管内总体积为 20 mL。
    5. 以 300 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 1 mL PBS 中。使用血细胞计数板对细胞进行计数。
    6. 在300 × g条件下离心5分钟，弃上清后将细胞重悬于适量细胞分离缓冲液中。使用CD8+ T细胞阴性选择分离试剂盒，按照制造商提供的操作说明从单细胞悬液中分离CD8+ T细胞。
    7. 磁分离后，以300 × g离心5分钟收集CD8+ T细胞，弃去细胞分离缓冲液。用1 mL PBS重悬细胞并进行细胞计数。根据制造商说明书，用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记细胞。
    8. 在96孔U型底组织培养板的每孔中，加入8,333个CD8+ T细胞和0.0833 mg（或所需剂量）的aAPC，用150 μL B’培养基悬浮，进行孵育。
    9. 37 °C 培养 7 天。培养 3-4 天后，向每孔加入 75 μL 新鲜培养基以更换培养液。
    10. 孵育3天后，使用流式细胞仪分析CFSE标记的细胞以评估增殖情况。流式细胞术CFSE直方图中的每个峰代表一个细胞世代，这是由于每次细胞分裂后CFSE信号随之稀释所致。
    11. 7天后，使用血细胞计数板对每个孔中的细胞数量进行计数。计数前，用台盼蓝溶液对死细胞进行染色，并在最终细胞计数中排除死细胞。将最终细胞浓度标准化至初始浓度，以计算扩增倍数。图4 和 图5).

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结果

自动化的二维薄膜拉伸装置示意图见图1。一维薄膜拉伸装置的示意图和描述见Ho等人的研究17。该拉伸装置采用标准铣削和机械加工技术，由铝制部件构成。与一维拉伸装置类似，二维拉伸装置包含金属夹具和导轨。双向丝杠用于将直线运动转换为旋转运动。丝杠通过机械螺纹与具有足够扭矩的相同步进电机相连。8根步进电机控制线可焊接到8针耐高温安费诺连接器上，以便于在烘箱中进行薄膜拉伸时与控制台连接。必须使用足够长度的聚四氟乙烯（PTFE）涂层导线将步进电机连接至控制台中的驱动器。推荐的计算机控制系统如图1A所示。两个电机必须通过耐高温导线连接至两个独立的驱动器。这两个驱动器随后需连接至微控制器，以实现与计算机的通信。驱动器应连接至微控制器的X轴和Y轴输出端口。驱动器和微控制器均需外接电源。在将电源连接至这三个组件之前，建议在每个供电连接之间插入一个4 A的保险丝，以防止电流过载对组件造成损坏。最后，可通过并行端口输入，使用DB25...

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讨论

本方案详细描述了一种用于精确制备各向异性聚合物微粒的通用方法。此处介绍的薄膜拉伸技术具有可扩展性、高度可重复性且成本低廉。其他用于制备各向异性微粒的技术存在诸多局限性，包括成本高、通量低以及微粒尺寸受限。薄膜拉伸法的另一优势在于，微粒在合成后才被改造为各向异性结构，因此可与多种微粒尺寸和合成方法兼容。图1展示了自动化二维拉伸装置的设置。该装置也可在不使用电子元件的情况下，通过手动旋转螺钉，使薄膜达到所需的拉伸程度。然而，我们发现自动化过程比手动操作更加一致且快速15。目前已开发出多种合成各向异性微粒的技术，例如微流控方法17,18,19、逐层涂覆法21以及其他自下而上的合成方法21,22

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

EBA（DGE-1746891）和 KRR（DGE-1232825）感谢美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目的支持。RAM 感谢美国国立卫生研究院国家癌症研究所国家研究服务奖（F31CA214147）以及大学科学家成就奖励奖学金的支持。作者感谢美国国立卫生研究院（R01EB016721 和 R01CA195503）、防盲研究组织 James 与 Carole Free 催化剂奖以及约翰·霍普金斯大学 Bloomberg-Kimmel 癌症免疫治疗研究所提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
聚乙烯醇，分子量 25000，88% 水解Polysciences, Inc.02975-500
甘油Sigma-AldrichG9012
数字温度计吸虫N/A型号名称：Fluke 52 II
浸入式温度探头扁虫N/A型号名称：Fluke 80PK 22
数字加热板 &和搅拌器Benchmark ScientificH3760-HS
多点搅拌器赛默飞世尔科技50093538
Resomer RG 504 H，聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)Sigma-Aldrich719900
二氯甲烷Sigma-AldrichD65100
匀浆器IKA 0003725001
超声波破碎仪声学 & 材料有限公司N/A型号：VC 505
超声破碎仪隔音罩声学 & 材料有限公司N/A部件编号：630-0427
超声波破碎探头声学 & 材料有限公司N/A货号：630-0220
超声波细胞粉碎仪微探头声学 &安普&材料公司N/A部件编号：630-0423
高速离心机贝克曼库尔特N/A型号：J-20XP（已停产），替代型号：J-26XP
高速离心机转子贝克曼库尔特369691型号：JA-17
高速聚碳酸酯离心管赛默飞世尔科技3118-005050 mL，螺旋盖
矩形一次性培养皿VWR International25384-32275 x 50 x 10 毫米
方形一次性培养皿VWR International10799-140100 mm × 100 mm
叶片 纯化的抗小鼠 CD3 抗体ε 抗体Biolegend100314
InVivoMab 抗小鼠 CD28 抗体，克隆号 37.51Bio X CellBE0015-1
N-(3-二甲氨基丙基)-N′盐酸乙基碳化二亚胺Sigma-AldrichE6383
N-羟基琥珀酰亚胺钠盐Sigma-Aldrich56485
MESSigma-AldrichM3671
Alexa Fluor 488 抗小鼠 CD3 抗体Biolegend100212
APC 抗小鼠 CD28 抗体Biolegend102109
康宁 96孔固体聚苯乙烯微孔板Sigma-AldrichCLS3915平底，黑色聚苯乙烯
蛋白低吸附管，1.5 mLEppendorf22431081
RPMI 1640 培养基（含 L-谷氨酰胺）赛默飞世尔科技11875093
胎牛血清Sigma-AldrichF4135热灭活，经无菌过滤
环丙沙星Sigma-Aldrich17850
2-巯基乙醇Sigma-AldrichM6250
重组人IL-2（无载体）Biolegend589102
丙酮酸钠（100 mM）赛默飞世尔科技11360070
MEM非必需氨基酸溶液（100X）赛默飞世尔科技11140050
MEM维生素溶液（100倍浓缩）赛默飞世尔科技11120052
CD8a+ 小鼠T细胞分离试剂盒Miltenyi Biotech130-104-075
CellTrace CFSE 细胞增殖试剂盒赛默飞世尔科技C34554
LS 柱Miltenyi Biotech130-042-401
MidiMACS 分离器Miltenyi Biotech130-042-302
MACS 多功能支架Miltenyi Biotech130-042-303
流式细胞仪Accuri C6
Synergy 2 多功能微孔板检测仪BioTek
autoMACS 运行缓冲液Miltenyi Biotec130-091-221
细胞筛赛默飞世尔科技22363548无菌，70 µm 尼龙网
ACK裂解缓冲液赛默飞世尔科技A1049201
C57BL/6J（Black 6）小鼠杰克逊实验室000664雄性，至少7周大
U型底组织培养板VWR353227无菌的96孔组织培养处理聚苯乙烯板
40 V 直流电源ProbotixLPSK-4010
PTFE涂层导线穆瑟602-5858-100-01这适用于100英尺的线轴，但使用等效的导线也可行
步进电机驱动器ProbotixMondoStep5.6
IDC 连接器套件ProbotixIDCM-10-12
微控制器ProbotixPBX-RF
4A 保险丝Radio Shack2701026相同规格的保险丝同样适用
DB25 公对公电缆ProbotixDB25-6
USB-A 转 USB-B 数据线订书钉2094915等效电缆同样适用
8针Amphenol连接器，公头与母头穆瑟654-97-3100A-20-7P 和 654-97-3106A20-7S
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参考文献

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各向异性聚合物人工抗原呈递细胞的制备及其在CD8+ T细胞活化中的应用
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