调控膀胱癌侵袭的过程为生物标志物和治疗策略的开发提供了机遇。本文介绍一种膀胱癌侵袭模型，该模型结合了肿瘤类球体的三维培养、延时成像和共聚焦显微镜技术。该技术可用于定义侵袭过程的特征，并用于治疗药物的筛选。
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本文内容
摘要
摘要
膀胱癌是一个重要的健康问题。据估计，今年美国将有超过16,000人死于膀胱癌。尽管75%的膀胱癌为非浸润性，且不易发生转移，但约有25%会进展为浸润性生长模式。高达一半的浸润性癌症患者将发展为致命的转移性复发。因此，理解膀胱癌浸润性进展的机制对于预测患者预后并防止致命性转移至关重要。本文介绍了一种三维癌症浸润模型，该模型可整合肿瘤细胞和间质成分，以模拟膀胱肿瘤微环境中发生的in vivo条件。该模型提供了利用延时成像实时观察浸润过程的机会，可通过共聚焦免疫荧光成像研究参与其中的分子通路，并可筛选具有抑制浸润潜力的化合物。尽管本实验方案聚焦于膀胱癌，但类似的方法也可能用于研究其他肿瘤类型的浸润与运动能力。
引言
侵袭是癌症进展中的关键步骤，与转移密切相关，并且与患者的生存率降低和预后不良相关。在人类膀胱癌中，这是全球每年导致约16.5万人死亡的泌尿系统最常见恶性肿瘤，癌症的分期、治疗方案和预后直接取决于是否存在侵袭1。大约75%的膀胱癌病例为非肌层浸润性，通常采用局部切除进行治疗。相比之下，肌层浸润性膀胱癌（约占所有病例的25%）属于侵袭性强的肿瘤，具有较高的转移率，需采用积极的多模式综合治疗2,3。因此，深入了解触发侵袭的分子通路，对于更准确地评估侵袭性进展的风险以及开发能够阻止侵袭性进展的治疗干预措施至关重要。
肿瘤侵袭性进展发生在一个复杂的三维（3-D）环境中，涉及肿瘤细胞与其他肿瘤细胞、间质、基底膜以及包括免疫细胞、成纤维细胞、肌细胞和血管内皮细胞在内的多种细胞类型的相互作用。可渗透支持系统（例如，Transwell）常被用于定量分析癌细胞的侵袭能力4，但这些系统存在局限性，因其无法实现对侵袭过程的实时显微监测，且难以回收样本以进行后续染色和分子分析。建立一种用于研究侵袭的三维膀胱肿瘤类球体系统具有重要意义，因为它既可整合明确的微环境组分，又具备体外（in vitro）系统的操作便利性。
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方案
1. 培养肿瘤类球体
- 细胞系培养
- 在常规贴壁细胞培养条件下培养人膀胱癌细胞，并置于含5% CO₂的37 °C培养箱中维持培养2. 将细胞维持在 <90% 汇合度。
注意：本方案中使用的培养基为含4.5 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、110 mg/L丙酮酸钠的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），并全程添加10%胎牛血清（FBS）。 - 实验开始前一天，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化细胞，定量细胞浓度，并将1 × 10⁶个细胞接种于培养容器中。6 6 孔超低吸附培养板中每孔加入 3 mL 培养基悬浮细胞。
- 在37 °C下，于低吸附条件下孵育细胞，时间不少于16小时。此孵育时间应足以使大多数膀胱癌细胞系聚集成球状体。
注意：可使用倒置明场显微镜观察类球体的形成。类球体的最佳大小和数量可能因具体实验而异，但我们发现直径在50 µm至150 µm之间的类球体通常适用于使用20倍物镜进行延时成像。 - 为将其他细胞类型（如成纤维细胞或免疫细胞）引入类球体，可按所需比例（1:1，1:10， 等等在超低吸附培养板中孵育 ≥16 小时，37 °C 条件下培养，以形成多种细胞类型的球状体。
- 在常规贴壁细胞培养条件下培养人膀胱癌细胞，并置于含5% CO₂的37 °C培养箱中维持培养2. 将细胞维持在 <90% 汇合度。
- 由原发性肿瘤生长
....
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结果
成功构建侵袭性膀胱癌肿瘤类球体需要从细胞系或原发肿瘤中形成大小合适的肿瘤类球体。图2A展示了由四种人膀胱癌细胞系（UM-UC9、UM-UC13、UM-UC14、253J和UM-UC18）形成的大小合适的类球体。图2B展示了来自BBN诱导的小鼠膀胱肿瘤的肿瘤类球体，该类球体被包埋于胶原基质中。这些类球体按上述方法进行包埋，并使用配备活细胞成像功能的显微镜采集代表性图像。UM-UC9、UM-UC13、UM-UC14和UM-UC18类球体成像采用20倍物镜，而小鼠膀胱肿瘤类球体则使用5倍和10倍物镜进行观察。
人膀胱细胞系类球体在培养24–72小时后（图2A）以及小鼠BBN原发性膀.......
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讨论
本文介绍了一种三维肿瘤球体模型，可实现对膀胱癌侵袭过程的实时观察，而膀胱癌侵袭对于癌症进展和转移至关重要。该系统可整合多种间质和细胞成分，使研究人员能够更真实地模拟膀胱癌侵袭发生的组织微环境。膀胱癌肿瘤球体可通过多种来源制备，例如细胞系（包括适用于研究影响侵袭过程信号通路的基因修饰细胞系）以及小鼠原位肿瘤（本文中已描述）。该模型未来还可能被用于人类原位肿瘤的分析。根据所使用的成像系统，可实时监测荧光信号，或在不同时间点通过固定样本并进行免疫荧光染色来检测。该系统还可用于测试潜在的侵袭抑制剂。因此，该模型是一种多功能且强大的工具，可用于评估膀胱癌生物学特性。
配备气候室的共聚焦显微镜系统，可提供温度控制、湿度控制和CO2供应，是构建本方案所述模型的关键设备。
已有大量报道表明，三维培养可提供特殊的微环境，更接近地模拟细胞生物学和癌症研究中的天然组织19,20许多研究依赖于可渗透膜插入式检测，.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
作者感谢密歇根大学Howard Crawford博士实验室为本研究提供的技术支持以及材料和设备，同时感谢Alan Kelleher提供的技术支持。
本工作由密歇根大学罗格尔癌症中心核心资助 CA046592-26S3、NIH K08 CA201335-01A1（PLP）、BCAN YIA（PLP）以及 NIH R01 CA17483601A1（DMS）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 人膀胱癌细胞系 UM-UC9、UM-UC13、UM-UC14、UM-UC18、253J | |||
| DMEM 细胞培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| 抗生素-抗真菌剂（100 倍浓度） | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红 | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar 超低吸附 6 孔板 | Corning | 3471 | |
| 常规倒置显微镜 | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | 用于细胞培养和类球体观察 |
| 大鼠尾部 I 型胶原蛋白，高浓度 | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II 多孔腔载玻片 | Thermo Fisher Scientific | 155382 | |
| 共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | LSM800 | 配备气候腔、多点成像和 Z 轴层扫功能的共聚焦显微镜 |
| 冷冻切片机 | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 图像处理软件 | Carl Zeiss | ||
| 多聚甲醛溶液 | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| ImmEdge 疏水屏障 PAP 笔 | Vector Laboratories | H4000 | |
| O.C.T. 包埋剂 | Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
| Hoechst 33342 溶液 | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| 抗 ATDC（Trim29）抗体 | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| 抗细胞角蛋白 14 抗体 | Abcam | ab7800 | |
| 抗波形蛋白抗体 | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond | 封片剂 |
参考文献
- American Cancer Society. The Society. , Atlanta, GA. (2018).
- Knowles, M. A., Hurst, C. D. Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 25-41 (2015).
- DeGeorge, K. C., Holt, H. R., Hodges, S. C.
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