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方法文章

用于研究膀胱癌侵袭及评估治疗药物的三维细胞培养系统

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DOI：

10.3791/58345

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2018年9月13日

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1Departments of Internal Medicine, Hematology/Oncology Division, Rogel Cancer Center, University of Michigan Medical Center, 2Department of Urology, Division of GU Oncology, Rogel Cancer Center, University of Michigan Medical Center, 3Departments of Surgery and Pathology, Perlmutter Cancer Center, NYU Langone Health

本文内容

摘要

调控膀胱癌侵袭的过程为生物标志物和治疗策略的开发提供了机遇。本文介绍一种膀胱癌侵袭模型，该模型结合了肿瘤类球体的三维培养、延时成像和共聚焦显微镜技术。该技术可用于定义侵袭过程的特征，并用于治疗药物的筛选。

摘要

膀胱癌是一个重要的健康问题。据估计，今年美国将有超过16,000人死于膀胱癌。尽管75%的膀胱癌为非浸润性，且不易发生转移，但约有25%会进展为浸润性生长模式。高达一半的浸润性癌症患者将发展为致命的转移性复发。因此，理解膀胱癌浸润性进展的机制对于预测患者预后并防止致命性转移至关重要。本文介绍了一种三维癌症浸润模型，该模型可整合肿瘤细胞和间质成分，以模拟膀胱肿瘤微环境中发生的in vivo条件。该模型提供了利用延时成像实时观察浸润过程的机会，可通过共聚焦免疫荧光成像研究参与其中的分子通路，并可筛选具有抑制浸润潜力的化合物。尽管本实验方案聚焦于膀胱癌，但类似的方法也可能用于研究其他肿瘤类型的浸润与运动能力。

引言

侵袭是癌症进展中的关键步骤，与转移密切相关，并且与患者的生存率降低和预后不良相关。在人类膀胱癌中，这是全球每年导致约16.5万人死亡的泌尿系统最常见恶性肿瘤，癌症的分期、治疗方案和预后直接取决于是否存在侵袭1。大约75%的膀胱癌病例为非肌层浸润性，通常采用局部切除进行治疗。相比之下，肌层浸润性膀胱癌（约占所有病例的25%）属于侵袭性强的肿瘤，具有较高的转移率，需采用积极的多模式综合治疗2,3。因此，深入了解触发侵袭的分子通路，对于更准确地评估侵袭性进展的风险以及开发能够阻止侵袭性进展的治疗干预措施至关重要。

肿瘤侵袭性进展发生在一个复杂的三维（3-D）环境中，涉及肿瘤细胞与其他肿瘤细胞、间质、基底膜以及包括免疫细胞、成纤维细胞、肌细胞和血管内皮细胞在内的多种细胞类型的相互作用。可渗透支持系统（例如，Transwell）常被用于定量分析癌细胞的侵袭能力4，但这些系统存在局限性，因其无法实现对侵袭过程的实时显微监测，且难以回收样本以进行后续染色和分子分析。建立一种用于研究侵袭的三维膀胱肿瘤类球体系统具有重要意义，因为它既可整合明确的微环境组分，又具备体外（in vitro）系统的操作便利性。

在本实验方案中，我们描述了一种利用基于胶原蛋白的凝胶基质结合共聚焦显微镜的三维球状体侵袭实验系统，用于研究人膀胱癌细胞的侵袭过程，使研究人员能够实时监测细胞的运动性与侵袭行为（图1A）。该系统具有良好的可变性和适应性，可经修改后用于研究多种肿瘤微环境/肿瘤相互作用模型。该系统可适用于大多数膀胱癌细胞系或原代膀胱肿瘤组织，并可加入其他间质细胞，如癌症相关成纤维细胞和免疫细胞5,6,7。本方案所描述的基质由I型胶原蛋白组成，但也可根据需要进行调整，加入纤连蛋白、层粘连蛋白或其他胶原蛋白等分子。根据所用显微镜和系统的性能，可对侵袭过程进行长达72小时或更长时间的连续观察。在侵袭发生前、过程中及完成后，对嵌入三维基质中的肿瘤进行固定和免疫荧光染色，可检测侵袭性细胞中上调表达的蛋白质，从而提供其他三维培养模型通常无法获得或难以获取的关键信息。该系统还可用于筛选抑制侵袭的化合物，并阐明这些化合物所影响的信号通路。

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方案

1. 培养肿瘤类球体

  1. 细胞系培养
    1. 在常规贴壁细胞培养条件下培养人膀胱癌细胞，并置于含5% CO₂的37 °C培养箱中维持培养2. 将细胞维持在 <90% 汇合度。
      注意：本方案中使用的培养基为含4.5 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、110 mg/L丙酮酸钠的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），并全程添加10%胎牛血清（FBS）。
    2. 实验开始前一天，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化细胞，定量细胞浓度，并将1 × 10⁶个细胞接种于培养容器中。6 6 孔超低吸附培养板中每孔加入 3 mL 培养基悬浮细胞。
    3. 在37 °C下，于低吸附条件下孵育细胞，时间不少于16小时。此孵育时间应足以使大多数膀胱癌细胞系聚集成球状体。
      注意：可使用倒置明场显微镜观察类球体的形成。类球体的最佳大小和数量可能因具体实验而异，但我们发现直径在50 µm至150 µm之间的类球体通常适用于使用20倍物镜进行延时成像。
    4. 为将其他细胞类型（如成纤维细胞或免疫细胞）引入类球体，可按所需比例（1:1，1:10， 等等在超低吸附培养板中孵育 ≥16 小时，37 °C 条件下培养，以形成多种细胞类型的球状体。
  2. 由原发性肿瘤生长
    注意：肿瘤类球体也可来源于原发性膀胱肿瘤，例如由致癌物诱导的膀胱肿瘤模型所形成的肿瘤8例如，可将喂食N-丁基-N-(4-羟丁基)亚硝胺（BBN）后小鼠产生的膀胱肿瘤取出，切碎成小块（约0.5 mm）3使用无菌外科器械进行操作。该系统也可用于研究经消化处理的人类膀胱癌原代样本。
    1. 收集并清洗 0.5 mm3 5 mL 冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中离心肿瘤组织块，200 x g 4 °C下离心5分钟。重复洗涤步骤一次。
    2. 通过离心收集肿瘤组织块，离心条件为 200 x g 4 °C下离心10分钟。弃去上清液，加入5 mL含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基。将肿瘤类球体与培养基的混合物转移至6孔超低吸附培养板中。37 °C孵育至少16小时后，包埋于胶原基质中（见步骤2.3）。

2. 准备三维培养室

  1. 根据制造商说明，将1型胶原蛋白（源自大鼠尾部）用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM稀释，配制成2 mg/mL的混合液。
    1. 简言之，根据制造商说明，通过轻柔吹打，将胶原蛋白与适量的1 N NaOH溶液及DMEM混合，以达到生理pH值。
    2. 混合胶原蛋白与DMEM后，需在凝固前迅速将胶原蛋白-DMEM混合液涂布于腔室载玻片的孔中（多数应用中，使用1.5号盖玻片的腔室载玻片效果最佳），每孔200 µL。将包被好的腔室载玻片于室温静置15分钟。
      注意：可根据实验目的，在胶原蛋白基质中添加其他细胞外基质成分（如纤连蛋白或层粘连蛋白）以调整基质组成。
  2. 从6孔超低吸附培养板中，轻柔吹打500 µL含有类球体（或肿瘤组织块，若使用原代肿瘤样本）的培养基至一个空的1.5 mL微量离心管中。静置2分钟，使类球体沉降至管底。
  3. 小心移除上清液。另取一管已与含10% FBS的DMEM混合的1型胶原蛋白（2 mg/mL），迅速加入500 µL至含有类球体的管中。通过缓慢吹打，轻柔混匀类球体与胶原蛋白。
  4. 取250 µL类球体/胶原蛋白混合液加入已预先包被胶原蛋白的腔室载玻片孔中。使含有类球体的胶原蛋白基质完全凝固（约在37 °C下30分钟）。
  5. 待胶原蛋白基质完全凝固后，向每孔加入1 mL含10% FBS的DMEM（图1B）。将腔室载玻片置于37 °C、含5% CO2 的培养箱中孵育，直至准备成像。

3. 活细胞延时成像

  1. 按照制造商的说明开启共聚焦显微镜，并确保气候箱达到 37 °C 且供应 5% CO₂2.
    注意：我们的显微镜和培养腔通常需要1小时才能达到系统平衡。
  2. 将腔室载玻片小心转移至显微镜上连接的载玻片适配器中。
  3. 使用低倍物镜定位目标类球体例如，5倍）并使用高倍物镜开始成像（在本方案中，大多数活细胞成像采用20倍物镜，因其成像质量更佳）。
    注意：对于原发性膀胱肿瘤样本，可能需要使用5倍和10倍物镜以覆盖更大的成像区域。在进行延时成像时，成像时间间隔设置为30分钟，并采用Z轴层扫技术对整个类球体进行成像。通常情况下，使用20倍物镜时Z轴切片间距设置为4 µm，Z轴总扫描距离约为200 µm。若细胞或组织表达荧光蛋白标记物，可同时获取微分干涉差（DIC）图像和荧光图像。
  4. 进行24–72小时的延时成像。
    注意：孵育时间取决于细胞类型和实验需求。

4. 用于冷冻组织切片的含癌球状体样本块的制备

  1. 使用小镊子小心地将胶原凝胶块及类球体从腔室载玻片中取出，放入塑料组织学模具中。
  2. 用1×PBS短暂冲洗胶原凝胶，随后在室温下用PBS配制的4%多聚甲醛（PFA）固定30分钟。
    注意：PFA具有潜在致癌性，操作时应格外小心。
  3. 将胶原凝胶置于摇床上，用1.5 mL 1×PBS洗涤15分钟。更换PBS后，重复此洗涤步骤3次。
  4. 在新的塑料组织学模具底部涂布一层薄薄的（约3 mm）最佳切削温度（OCT）包埋剂。将已固定并洗涤的胶原凝胶置于OCT包埋剂上，然后小心地用OCT包埋剂填满模具，完全包埋整个凝胶，同时避免产生气泡。
  5. 将模具置于4 °C环境中1小时。
  6. 将含有样品和OCT包埋剂的模具放置于漂浮在液氮中的100 mm培养皿上，使样品迅速完全冷冻。
  7. 将冷冻后的样品块储存于-80 °C，以备后续使用。

5. 冷冻切片肿瘤类器官的免疫荧光成像

  1. 将冷冻样品块从 -80 °C 冰箱转移至冰冻切片机的 -20 °C 冷室中。
  2. 设置切片间隔为 7 µm，进行常规冷冻切片。确保切下的样品平整贴附于载玻片上，无皱褶或气泡。
    1. 染色前将载玻片存放于 -80 °C 冰箱中。
      注意：可根据实验需求调整切片间隔。
  3. 室温下将载玻片空气干燥 1 小时。
  4. 用含 0.5% Triton X-100 的 PBS 处理样品，透化 15 分钟。
  5. 用 PBS 洗涤样品 3 次，每次 10 分钟。
  6. 使用疏水屏障笔在载玻片上围绕样品画出疏水性边界。
  7. 用封闭液（含 5% 牛血清白蛋白（BSA）的 1x PBS）在室温下处理样品 1 小时。
  8. 向载玻片上的每个样品加入 40 µL 含一抗的溶液（含 5% BSA 的 1x PBS，一抗稀释比例为 1:100）。
  9. 将载玻片在 37 °C 孵育 1 小时，或在室温下孵育过夜（孵育时间和条件根据一抗种类而定）。
  10. 用 PBS 洗涤样品 3 次，每次 15 分钟。
  11. 向载玻片上的每个样品加入 40 µL 含二抗的溶液（含 5% BSA 的 1x PBS，二抗稀释比例为 1:300）。
  12. 用 PBS 洗涤样品 3 次，每次 15 分钟。
  13. 用 Hoechst 33342 溶液（1 µg/mL，用 PBS 稀释）在室温下染色 10 分钟，随后用 PBS 洗涤 5 分钟。
  14. 用封片剂封片，并加盖合适尺寸的盖玻片。将载玻片置于室温避光环境中 24 小时，然后进行共聚焦显微镜观察。

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结果

成功构建侵袭性膀胱癌肿瘤类球体需要从细胞系或原发肿瘤中形成大小合适的肿瘤类球体。图2A展示了由四种人膀胱癌细胞系（UM-UC9、UM-UC13、UM-UC14、253J和UM-UC18）形成的大小合适的类球体。图2B展示了来自BBN诱导的小鼠膀胱肿瘤的肿瘤类球体，该类球体被包埋于胶原基质中。这些类球体按上述方法进行包埋，并使用配备活细胞成像功能的显微镜采集代表性图像。UM-UC9、UM-UC13、UM-UC14和UM-UC18类球体成像采用20倍物镜，而小鼠膀胱肿瘤类球体则使用5倍和10倍物镜进行观察。

人膀胱细胞系类球体在培养24–72小时后（图2A）以及小鼠BBN原发性膀...

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讨论

本文介绍了一种三维肿瘤球体模型，可实现对膀胱癌侵袭过程的实时观察，而膀胱癌侵袭对于癌症进展和转移至关重要。该系统可整合多种间质和细胞成分，使研究人员能够更真实地模拟膀胱癌侵袭发生的组织微环境。膀胱癌肿瘤球体可通过多种来源制备，例如细胞系（包括适用于研究影响侵袭过程信号通路的基因修饰细胞系）以及小鼠原位肿瘤（本文中已描述）。该模型未来还可能被用于人类原位肿瘤的分析。根据所使用的成像系统，可实时监测荧光信号，或在不同时间点通过固定样本并进行免疫荧光染色来检测。该系统还可用于测试潜在的侵袭抑制剂。因此，该模型是一种多功能且强大的工具，可用于评估膀胱癌生物学特性。

配备气候室的共聚焦显微镜系统，可提供温度控制、湿度控制和CO2供应，是构建本方案所述模型的关键设备。

已有大量报道表明，三维培养可提供特殊的微环境，更接近地模拟细胞生物学和癌症研究中的天然组织19,20许多研究依赖于可渗透膜插入式检测，...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

作者感谢密歇根大学Howard Crawford博士实验室为本研究提供的技术支持以及材料和设备，同时感谢Alan Kelleher提供的技术支持。

本工作由密歇根大学罗格尔癌症中心核心资助 CA046592-26S3、NIH K08 CA201335-01A1（PLP）、BCAN YIA（PLP）以及 NIH R01 CA17483601A1（DMS）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
人膀胱癌细胞系 UM-UC9、UM-UC13、UM-UC14、UM-UC18、253J
DMEM 细胞培养基Thermo Fisher Scientific11995065
胎牛血清 Thermo Fisher Scientific26140079
抗生素-抗真菌剂（100 倍浓度）Thermo Fisher Scientific15240062
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红Thermo Fisher Scientific25200056
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-AldrichA3803
磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4 Thermo Fisher Scientific10010023
Costar 超低吸附 6 孔板 Corning3471
常规倒置显微镜 Carl Zeiss491206-0001-000用于细胞培养和类球体观察
大鼠尾部 I 型胶原蛋白，高浓度 Corning354249
Nunc Lab-Tek II 多孔腔载玻片Thermo Fisher Scientific155382
共聚焦显微镜 Carl ZeissLSM800配备气候腔、多点成像和 Z 轴层扫功能的共聚焦显微镜 
冷冻切片机Leica BiosystemsCM3050 S
Zen 2 图像处理软件 Carl Zeiss
多聚甲醛溶液Electron Microscopy Sciences15710
ImmEdge 疏水屏障 PAP 笔Vector Laboratories H4000
O.C.T. 包埋剂 Thermo Fisher Scientific23730571
Hoechst 33342 溶液 Thermo Fisher Scientific62249
抗 ATDC（Trim29）抗体Sigma-AldrichHPA020053
抗细胞角蛋白 14 抗体Abcamab7800
抗波形蛋白抗体Abcamab24525
ProLong Diamond 封片剂

参考文献

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