O9-1 是一种多能性小鼠神经嵴细胞系。本文详细描述了O9-1细胞的培养、向特定细胞类型分化，以及利用siRNA介导的基因沉默或CRISPR-Cas9基因组编辑技术对O9-1细胞进行遗传操作的逐步实验方案。
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摘要
摘要
神经嵴细胞（NCCs）是一类具有迁移能力的多能干细胞，可分化为多种细胞类型，并发育形成多种组织和器官。O9-1细胞系来源于内源性小鼠胚胎神经嵴细胞，能够维持其多能性。然而，在特定培养条件下，O9-1细胞可分化为不同细胞类型，因而被广泛应用于各类研究。近期，通过结合小鼠体内实验与O9-1细胞研究，我们发现Hippo信号通路效应分子Yap和Taz在神经嵴来源的颅面发育过程中发挥重要作用。尽管O9-1细胞的培养过程较其他细胞系更为复杂，该细胞系仍是研究神经嵴细胞的有力模型。 体外在此，我们介绍一种培养O9-1细胞系以维持其干性的实验方案，以及将O9-1细胞分化为不同类型细胞（如平滑肌细胞和成骨细胞）的方案。此外，还描述了利用CRISPR-Cas9基因删除和小干扰RNA介导的基因敲低技术在O9-1细胞中进行基因功能缺失研究的实验方法。
引言
神经嵴细胞（NCCs）是一类具有显著迁移能力和短暂存在的多能干细胞样细胞，出现在胚胎发育过程中。NCCs起源于外胚层表面与神经管之间，在胚胎发育期间迁移到胚胎的其他部位1。根据其功能区域，NCCs可分为多种类型，包括颅部、躯干部、迷走部、骶部和心脏NCCs。此外，NCCs可分化为多种细胞谱系，如平滑肌细胞、成骨细胞和神经元，并形成多种组织2,3。NCCs的发育过程由一系列复杂的形态发生事件构成，并受到多种分子信号的精细调控。鉴于NCCs调控机制的复杂性及其对多种结构的重要贡献，NCC发育的失调通常会导致先天性出生缺陷，这类缺陷约占所有人類先天性出生缺陷的近30%。神经嵴发育过程中的异常可导致唇裂/腭裂、鼻部形成缺陷、各类综合征、心脏流出道缺陷，甚至婴儿死亡1,4,5,6,7。理解NCC发育的分子机制对于开发由NCC发育缺陷所致疾病的治疗方法具有重要意义。通过采用多种体外（in vitro）和体内（in vivo....
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方案
1. O9-1 细胞培养前的准备
注意：O9-1 细胞培养所用的基础培养基必须由桑多斯近交系小鼠硫鸟嘌呤/乌本苷抗性（STO）小鼠成纤维细胞进行条件化处理；因此，在开始 O9-1 细胞培养之前，需先获取 STO 细胞并按以下方法进行准备。
- 活跃的STO细胞培养
- 通过配制完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），添加7%胎牛血清（FBS）（胚胎干细胞培养级）、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素和2 mM L-谷氨酰胺，制备用于培养活跃STO细胞的培养基（括号内为终浓度）。
注意：STO培养基用于培养活跃的STO饲养层细胞。青霉素、链霉素和L-谷氨酰胺在储存过程中可能产生沉淀；使用前需用移液器充分溶解。 - 在室温下用0.1%明胶对标准100 mm细胞培养皿进行包被，持续30分钟。孵育结束后，吸除多余的明胶。包被后应立即使用该培养皿。
注意：也可用STO培养基覆盖培养皿，并将其置于湿润培养箱中以防止干燥（此方法仅适用于短期保存，不适用于预包被培养皿的长期储存）。 - 将STO细胞在37 °C水浴中快速解冻；打开前用70%乙醇擦拭冻存管，随后立即将整管细胞转移至离心管中。
- 将STO培养基逐滴加入离心管中；细胞悬液与培养基的体积比为1:10。
- 在室温下以180 x g
- 通过配制完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），添加7%胎牛血清（FBS）（胚胎干细胞培养级）、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素和2 mM L-谷氨酰胺，制备用于培养活跃STO细胞的培养基（括号内为终浓度）。
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结果
我们进行基因敲低和基因敲除实验的目的是研究Yap和Taz在O9-1细胞中功能丧失所产生的效应。在开展基因敲低和基因敲除实验之前，必须按照前述方法准备好基础培养基并培养O9-1细胞（例如，基底膜基质需完全覆盖整个培养板，如图1所示；O9-1细胞需从液氮中复苏，如图2所示）。我们按照前述方法进行基因敲低实验，同时对Yap和Taz进行敲低。将等量的Yap siRNA和Taz siRNA加入至制造商推荐的终体积中。在对照组培养板中加入等体积的非靶向siRNA。
A Yap-null O9-1细胞系是通过删除exon 3生成的 Yap 通过使用 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术，如 Wang 所述.......
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讨论
神经嵴细胞（NCC）在胚胎形态发生过程中是多种组织和器官形成中具有多功能性的关键贡献者。O9-1细胞系保持了向多种不同类型细胞分化的潜能，并模拟了 体内 NCCs 的特征，使其成为一种有用的 体外 研究神经嵴细胞（NCCs）基因功能和分子调控的工具。O9-1细胞的不同状态可能对应于不同的神经嵴衍生物 体内，具体取决于 O9-1 细胞的培养条件。当在非分化培养条件下培养时，O9-1 细胞可维持在多能状态，类似于常规的干细胞培养。此类非分化的 O9-1 细胞可能对应于迁移前及迁移中的多能干细胞样神经嵴细胞（NCCs） 体内此外，在特定的分化培养条件下，O9-1细胞可分化为多种不同类型的细胞，这一特性在研究神经嵴细胞（NCCs）从多能干细胞分化为特定成熟细胞类型过程中的基因功能与调控机制方面具有重要意义。正在分化的O9-1细胞可能对应于迁移后的神经嵴衍生成细胞。 体内，其细胞命运不同，可分化为多种细胞类型。根据研究需求，可采用不同的操作和培养方式处理O9-1细胞，以实现互补 体内 使用动物模型的NCC研究。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
德克萨斯心脏研究所科学出版部的Nicole Stancel博士（经认证的科学编辑）提供了编辑支持。我们还感谢以下资助来源：美国心脏协会国家中心科学家发展奖（14SDG19840000，授予J. Wang）；德克萨斯州Rolanette和Berdon Lawrence骨病研究项目2014年Lawrence研究奖（授予J. Wang）；以及美国国立卫生研究院（DE026561和DE025873授予J. Wang，DE016320和DE019650授予R. Maxson）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 活性STO饲养层细胞 | ATCC | ATCC CRL-1503 | 亦提供丝裂霉素C灭活形式，货号 # ATCC 56-X |
| O9-1 小鼠颅神经嵴细胞系 | Millipore Sigma | SCC049 | |
| DMEM，高糖，无谷氨酰胺 | Gibco | 11960-044 | |
| DMEM，高糖 | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS（胎牛血清） | Millipore Sigma | ES-009-B | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| L-谷氨酰胺 200 mM（100倍浓缩液） | Gibco | 25030-081 | |
| 猪皮明胶 | Sigma | G1890 | |
| HBSS 中的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | |
| 不含钙和镁的DPBS（Dulbecco磷酸盐缓冲液） | Lonza | 17-512F | |
| MEM非必需氨基酸（MEM NEAA）100× | Gibco | 11140-050 | |
| 丙酮酸钠（100 mM） | Gibco | 11360-070 | |
| 2-巯基乙醇 | Sigma | M-7522 | |
| ESGRO 白血病抑制因子 (LIF) 106 单位/毫升 | 默克生命科学 | ESG1106 | |
| 重组人碱性成纤维细胞生长因子（rhFGF-basic） | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| 丝裂霉素C | 罗氏 | 10107409001 | |
| Matrigel基质 | 康宁 | 356234 | |
| DMSO（二甲基亚砜） | Millipore Sigma | MX1458-6 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | 赛默飞世尔科技 | 13778-075 | |
| Opti-MEM I (1x) | Gibco | 31985-070 | |
| 最低必需培养基，α 1×，含伊格尔盐、核糖核苷、脱氧核糖核苷 &和 L-谷氨酰胺 | 康宁 | 10-022-CV | |
| ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA | Dharmacon | L-041057 | |
| ON-TARGETplus 非靶向对照池 | Dharmacon | D-001810 | |
| ON-TARGETplus Yap1 siRNA | Dharmacon | L-046247 | |
| 胎牛血清（FCS） | |||
| ITS（胰岛素-转铁蛋白-硒） | |||
| TGF-β3 | |||
| 抗坏血酸 | |||
| BMP2（骨形态发生蛋白2） | |||
| 地塞米松 | |||
| B-27添加剂 |
参考文献
- Achilleos, A., Trainor, P. A. Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy. Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).
- Le Douarin, N. M., Dupin, E. Multipotentiality of the neural crest. Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).
- Santagati, F., Rijli, F. M.
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells
Posted by JoVE Editors on 11/30/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. The Protocol section was updated.
Step 2.1 was updated from:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
to:
Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 µM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).
Step 5.1.1 was updated from:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.
to:
To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 µM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 µg/mL streptomycin.
Step 5.2.1 was updated from:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
to:
To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 µM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.
Step 5.4.1 was updated from:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.
to:
To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.
