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方法文章

O9-1 神经嵴细胞的培养与操作

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DOI：

10.3791/58346

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2018年10月9日

 ,  ,  , 
1Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern California

本文内容

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摘要

O9-1 是一种多能性小鼠神经嵴细胞系。本文详细描述了O9-1细胞的培养、向特定细胞类型分化，以及利用siRNA介导的基因沉默或CRISPR-Cas9基因组编辑技术对O9-1细胞进行遗传操作的逐步实验方案。

摘要

神经嵴细胞（NCCs）是一类具有迁移能力的多能干细胞，可分化为多种细胞类型，并发育形成多种组织和器官。O9-1细胞系来源于内源性小鼠胚胎神经嵴细胞，能够维持其多能性。然而，在特定培养条件下，O9-1细胞可分化为不同细胞类型，因而被广泛应用于各类研究。近期，通过结合小鼠体内实验与O9-1细胞研究，我们发现Hippo信号通路效应分子Yap和Taz在神经嵴来源的颅面发育过程中发挥重要作用。尽管O9-1细胞的培养过程较其他细胞系更为复杂，该细胞系仍是研究神经嵴细胞的有力模型。 体外在此，我们介绍一种培养O9-1细胞系以维持其干性的实验方案，以及将O9-1细胞分化为不同类型细胞（如平滑肌细胞和成骨细胞）的方案。此外，还描述了利用CRISPR-Cas9基因删除和小干扰RNA介导的基因敲低技术在O9-1细胞中进行基因功能缺失研究的实验方法。

引言

神经嵴细胞（NCCs）是一类具有显著迁移能力和短暂存在的多能干细胞样细胞，出现在胚胎发育过程中。NCCs起源于外胚层表面与神经管之间，在胚胎发育期间迁移到胚胎的其他部位1。根据其功能区域，NCCs可分为多种类型，包括颅部、躯干部、迷走部、骶部和心脏NCCs。此外，NCCs可分化为多种细胞谱系，如平滑肌细胞、成骨细胞和神经元，并形成多种组织2,3。NCCs的发育过程由一系列复杂的形态发生事件构成，并受到多种分子信号的精细调控。鉴于NCCs调控机制的复杂性及其对多种结构的重要贡献，NCC发育的失调通常会导致先天性出生缺陷，这类缺陷约占所有人類先天性出生缺陷的近30%。神经嵴发育过程中的异常可导致唇裂/腭裂、鼻部形成缺陷、各类综合征、心脏流出道缺陷，甚至婴儿死亡1,4,5,6,7。理解NCC发育的分子机制对于开发由NCC发育缺陷所致疾病的治疗方法具有重要意义。通过采用多种体外（in vitro）和体内（in vivo）研究方法8,9,10,11,12,13,14,15，NCC研究已取得显著进展。在体内研究中，已使用包括鸡、两栖类、斑马鱼和小鼠在内的动物模型来研究NCCs1。此外，人类胚胎也被用于研究早期人类胚胎发育过程中NCC的迁移过程16。在体外研究中，已使用如来源于患者皮下脂肪的人源NCCs等细胞模型来研究帕金森病17。O9-1 NCC细胞系最初来源于从E8.5小鼠胚胎中分离的内源性NCC的大规模培养18，是研究NCCs的有力细胞模型。重要的是，在非诱导分化培养条件下，O9-1细胞表现为多能干细胞样的NCCs；但在不同培养条件下，O9-1细胞可被诱导分化为不同类型的细胞，如平滑肌细胞、成骨细胞、软骨细胞和胶质细胞18。基于这些特性，O9-1细胞已被广泛应用于与NCC相关的研究，例如颅面发育缺陷的分子机制研究19,20。

本文提供了详细的实验方案，用于O9-1细胞的培养、将O9-1细胞分化为不同细胞类型，以及通过CRISPR-Cas9基因组编辑和小干扰RNA（siRNA）介导的基因敲低技术对O9-1细胞进行基因功能缺失研究。作为代表性示例，文中描述了利用O9-1细胞研究Yap和Taz基因功能缺失的方法。Yap和Taz是Hippo信号通路的下游效应分子，该通路在细胞增殖、分化和凋亡中发挥关键作用。研究表明，Hippo信号通路还在多种不同组织和器官的发育与稳态维持中具有重要作用，并参与多种疾病的发病机制20,21,22,23,24,25,26,27,28。Hippo信号通路的核心组分包括肿瘤抑制因子类Sterile 20样激酶Mst1/2、含WW结构域的Savador支架蛋白以及大肿瘤抑制同源激酶Lats1/2。Hippo信号通路可抑制Yap和Taz的活性，并促进其在细胞质中的降解。当Hippo信号通路失去抑制作用时，Yap和Taz可转入细胞核，作为转录共激活因子发挥作用。我们近期的研究表明，在小鼠神经嵴细胞（NCCs）中特异性失活Hippo信号通路的效应分子Yap和Taz（使用Wnt1cre和Wnt1Cre2SOR驱动系统），会导致胚胎在E10.5时期致死，并伴随严重的颅面发育缺陷20。我们还利用O9-1细胞开展了研究，以探讨Yap和Taz在神经嵴细胞中的功能。为研究Yap和Taz在神经嵴细胞增殖与分化中的作用，我们采用siRNA在O9-1细胞中构建了Yap和Taz基因的敲低细胞系，并利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术构建了Yap基因敲除细胞系。相同的基因功能缺失策略也可应用于其他信号通路中的不同靶基因。此外，O9-1细胞还可用于基因功能获得性研究和转染实验，以研究基因功能及其调控机制。本文所述的实验方案旨在为研究人员提供指导，用于培养O9-1细胞以维持其多能性，通过不同培养条件将O9-1细胞分化为其他细胞类型，以及研究基因功能和神经嵴细胞的分子机制。

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方案

1. O9-1 细胞培养前的准备

注意：O9-1 细胞培养所用的基础培养基必须由桑多斯近交系小鼠硫鸟嘌呤/乌本苷抗性（STO）小鼠成纤维细胞进行条件化处理；因此，在开始 O9-1 细胞培养之前，需先获取 STO 细胞并按以下方法进行准备。

  1. 活跃的STO细胞培养
    1. 通过配制完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），添加7%胎牛血清（FBS）（胚胎干细胞培养级）、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素和2 mM L-谷氨酰胺，制备用于培养活跃STO细胞的培养基（括号内为终浓度）。
      注意：STO培养基用于培养活跃的STO饲养层细胞。青霉素、链霉素和L-谷氨酰胺在储存过程中可能产生沉淀；使用前需用移液器充分溶解。
    2. 在室温下用0.1%明胶对标准100 mm细胞培养皿进行包被，持续30分钟。孵育结束后，吸除多余的明胶。包被后应立即使用该培养皿。
      注意：也可用STO培养基覆盖培养皿，并将其置于湿润培养箱中以防止干燥（此方法仅适用于短期保存，不适用于预包被培养皿的长期储存）。
    3. 将STO细胞在37 °C水浴中快速解冻；打开前用70%乙醇擦拭冻存管，随后立即将整管细胞转移至离心管中。
    4. 将STO培养基逐滴加入离心管中；细胞悬液与培养基的体积比为1:10。
    5. 在室温下以180 x g离心3分钟。
    6. 轻轻吹打混匀，将细胞转移至明胶包被的培养皿中。
    7. 将STO细胞置于标准培养箱（37 °C，5% CO2）中培养24小时。
    8. 接种24小时后（仅在细胞贴壁后）更换培养基，并弃去旧培养基。
    9. 每天在显微镜下观察STO细胞，并在细胞融合度达到80%时进行传代。
      1. 开始STO细胞传代前，在室温下用0.1%明胶对培养皿进行包被30分钟（明胶体积为该容器中生长培养基体积的一半）。
      2. 传代STO细胞时，吸除生长培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次（每次加入与生长培养基等体积的PBS）。
      3. 吸除PBS，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液（根据容器大小调整体积），然后在37 °C孵育5分钟。
        注意：对于100 mm培养皿，使用10 mL生长培养基和3 mL胰蛋白酶溶液；对于150 mm培养皿，使用20 mL生长培养基和8 mL胰蛋白酶溶液。洗涤缓冲液的使用体积等于生长培养基的体积。
      4. 用等体积的STO培养基中和胰蛋白酶活性。将STO细胞以1:3至1:10的比例接种至新培养皿中。
        注意：常见的扩增方案为：从一个冻存管扩增至一个100 mm培养皿，再扩增至一个150 mm培养皿，随后扩增至四个150 mm培养皿，最终扩增至16个150 mm培养皿。
  2. STO细胞的失活与冻存
    1. 为配制2倍浓度冻存液，向STO培养基中加入以下成分（括号内为终浓度）：20% FBS、20%二甲基亚砜（DMSO）。
    2. 混合后，用孔径0.22 µm滤器过滤除菌，4 °C保存至使用。应在使用当天配制2倍浓度冻存液，并丢弃未用完的冻存液。
    3. 用PBS配制浓度为0.5 mg/mL的丝裂霉素C溶液。为使丝裂霉素C充分溶解于PBS中，将瓶子固定在涡旋振荡器上，低速涡旋约45分钟，直至颗粒完全溶解。
      注意：丝裂霉素C对光敏感且难溶。
      警示：丝裂霉素C具有急性毒性，可能致癌。操作时必须佩戴适当的个人防护装备。
    4. 向现有培养基中加入终浓度为0.01 mg/mL的丝裂霉素C，以失活STO细胞。在标准培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育2小时。
    5. 用20 mL PBS对经丝裂霉素C处理后的培养皿（150 mm）洗涤两次。
    6. 吸除PBS溶液，加入8 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液进行细胞解离，并在标准湿润培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育5分钟。
    7. 加入8 mL STO培养基中和胰蛋白酶活性。
    8. 将细胞悬液转移至离心管中。可将多个培养皿的细胞合并至同一离心管中以节省时间。在180 x g下离心5分钟。
    9. 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于5 mL PBS中。
    10. 取10 µL细胞悬液，使用血细胞计数板进行细胞计数。计数中央网格区域的细胞数，将所得数值乘以104，即得每1 mL中的细胞数量。重复计数两次，取平均值作为每毫升细胞数的最终估算值。
    11. 在180 x g下离心5分钟。
    12. 吸除PBS，向细胞沉淀中加入等体积（按体积比1:1）的STO培养基和2倍浓度冻存液。调整总体积，使终细胞浓度为4 x 106 个细胞/mL（此浓度适用于一个100 mm培养皿）。
      注意：例如，来自四个150 mm培养皿共获得60 x 106个细胞，按每支冻存管4 x 106个细胞分装，每管含1 mL细胞悬液。四个培养皿共可获得约15支冻存管（60/4=15）。向细胞沉淀中加入7.5 mL STO培养基和7.5 mL 2倍浓度冻存液，重悬后分装至每支冻存管1 mL。
    13. 通过缓慢吹打使冻存液与细胞沉淀充分混匀。将1 mL细胞悬液分装至每支冻存管中，并做好相应标记。
    14. 将冻存管放入带盖的聚苯乙烯盒中（该装置可提供缓慢降温速率，有助于提高细胞存活率）。将盒子转移至-80 °C冰箱中至少24小时，之后再将冻存管转移至液氮中保存。
      注意：为获得最佳效果，应尽量缩短细胞计数时间，以及从向细胞中加入2倍浓度冻存液到将冻存管转移至-80 °C冰箱之间的时间间隔。

2. O9-1 细胞培养

  1. 制备O9-1细胞培养的基础培养基：在DMEM中加入以下成分（括号内为终浓度）：15% 胎牛血清（FBS）、0.1 mM 最低必需培养基（MEM）非必需氨基酸、1 mM 丙酮酸钠、55 μM β-巯基乙醇、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、2 mM L-谷氨酰胺、103 每毫升含单位白血病抑制因子（LIF；使用前立即加入，切勿加入储备瓶）和25 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF；使用前立即加入，切勿加入储备瓶）。
  2. 使用0.22 µm孔径滤器对基础培养基进行过滤除菌，并用铝箔包裹以避光。
  3. 收集经灭活的STO细胞的条件培养基。
    注意：仅在获得灭活的STO细胞后继续操作。从STO细胞培养板收集的O9-1基础培养基此后称为条件化基础培养基。
    1. 按照上述方法快速解冻灭活的STO细胞（一支冻存管，内含4 x 106 细胞量适用于一个100 mm培养皿，收集10天后可获得约100 mL条件化基础培养基。使用STO培养基将灭活的STO细胞接种至明胶包被的培养皿中。在标准湿润培养箱中（37 °C，5% CO₂）孵育过夜，使细胞贴壁。2).
    2. 解冻STO细胞24小时后，弃去现有的STO培养基，更换为基础培养基。
      注意：不要将LIF和bFGF添加至失活的STO细胞培养皿中；仅添加至O9-1细胞培养皿中。
    3. 每24小时更换培养基，使用O9-1基础培养基，并将STO细胞培养板中的基础培养基收集至瓶中。用铝箔包裹装有条件培养基的瓶子以避光。将收集的所有培养基于4 °C保存。
      注意：由于细胞已被灭活，其外观可能不如采集后数天时健康；此现象属正常预期。
    4. 可选地，为检测污染，将每天收集的基底培养基分别置于用锡箔纸包裹的不同试管中（而非同一瓶内）。使用24孔板，将每日的培养基各取1 mL加入各个孔中，于标准培养箱中过夜培养，随后在显微镜下检查是否存在细菌污染。
      注意：若无污染，培养基保持红色；若存在细菌污染，则变为黄色。
    5. 收集条件培养基10天后，弃去STO细胞。合并（如适用）所有收集的条件培养基，并通过孔径0.22 µm滤器过滤除菌，收集至无菌瓶中。用铝箔包裹瓶子以避光。将过滤后的条件培养基于4 °C保存，自过滤之日起最长保存一个月。

3. O9-1 细胞的维持

注意：O9-1 工作基础培养基是在使用前立即向滤膜除菌的条件化基础培养基中添加 LIF（终浓度为 103 单位/mL）和 bFGF（终浓度为 25 ng/mL）后配制而成，应避光保存于 4 °C。

  1. O9-1细胞的复苏
    1. 缓慢解冻基底膜基质的储备瓶（例如，Matrigel）在 4 °C 下孵育过夜以制备分装样品。
    2. 向5 mL储存的基底膜基质中加入5 mL含10%胎牛血清的DMEM，使用预先在-20 °C保存的低温枪头吹打混匀。将原瓶和分装管保持在冰上。根据实验需求，将混合物分装为不同体积（0.5 mL或1 mL），并进行冷冻。避免对基底膜基质进行多次冻融。
      注意：基底膜基质在室温下会迅速聚合；操作时应使用预冷的移液器吸头，并保持离心管处于低温状态，以避免意外聚合。
    3. 在实验开始前2小时，将基底膜基质的一份 aliquot 置于4 °C或冰上解冻。基质不宜在4 °C长期保存。
    4. 使用经滤膜除菌的含10% FBS的DMEM将基底膜基质稀释至终浓度为0.5 mg/mL，用于包被培养板。在室温下用基底膜基质（0.5 mg/mL）包被培养板，持续1小时。确保基质完全覆盖板面（如图所示 图1).
    5. 吸取基底膜基质时倾斜培养板，避免接触包被表面；将板在37 °C下干燥30分钟。切勿过度干燥已包被的板。
      注意：所有培养基和试剂准备就绪后方可进行后续操作（包括预处理的基础培养基、经无菌过滤的含10% FBS的DMEM、LIF和bFGF）。
    6. 将冻存管置于37 °C水浴中快速复苏O9-1细胞，缓慢旋转冻存管直至溶液完全变为液体，立即进行下一步操作。
    7. 将冻存管中的全部细胞悬液（约1 mL）转移至15 mL离心管中。加入5倍体积含10%胎牛血清（FBS）的DMEM（使用0.22 µm滤器过滤除菌），重悬细胞。
    8. 180 × g 离心 3 分钟 g吸弃上清液，注意不要扰动细胞沉淀。用含有LIF和bFGF的条件化基础培养基重悬细胞沉淀（通过轻敲管壁），并用血细胞计数板进行细胞计数。
      注意：添加了LIF和bFGF的条件化基础培养基对于维持O9-1细胞系的多能性至关重要。添加培养基时需谨慎，以避免细胞发生非预期的分化。
    9. 将种子细胞以每平方厘米10,000至15,000个细胞的密度接种2 接种至6孔板中。将细胞置于标准细胞培养孵箱（37 °C，5% CO₂）中孵育，使其贴壁并生长。2过夜培养后更换培养基。
    10. 确保细胞贴壁后再进行换液操作（健康贴壁细胞的形态应如图中所示） 图2).
    11. 复苏O9-1细胞后的第二天务必更换培养基（使用添加LIF和bFGF的条件化基础培养基）。
  2. O9-1 细胞传代
    1. 当 O9-1 细胞达到 80% 汇合度时，解冻基底膜基质，并按上述方法制备基底膜基质包被的培养板。向培养容器中加入添加了白血病抑制因子（LIF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的条件化基础培养基。或者，可加入不含胎牛血清（FBS）的 DMEM 以防止基底膜基质干燥，并置于标准加湿培养箱中保存，保存时间不超过 3 天。
    2. 用 2 mL 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）对含有 O9-1 的孔（6 孔板）清洗两次，并轻轻吹打，避免细胞丢失。
    3. 用1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA在37 °C下消化细胞3 min。加入等体积含10%胎牛血清的DMEM中和胰蛋白酶。反复吹打液体，使其覆盖孔板表面，尽可能将细胞从培养板上吹打下来。
      注意：胰蛋白酶浓度为0.05%，而非0.25%。使用DPBS从原液中稀释。
    4. 消化细胞时避免产生气泡。
    5. 将所有细胞溶液转移至离心管中，在180 x g条件下离心3分钟 g吸弃上清液，勿扰动细胞沉淀。用添加了LIF和bFGF的条件化基础培养基，通过轻柔吹打重悬离心管中的细胞沉淀。
    6. 使用血细胞计数板按照上述方法计数总细胞数。接种细胞（10,000 至 15,000 个细胞/cm²）。2) 加入按照步骤 3.1.4 至 3.1.8 所制备的包被板中。接种一个 6 孔板孔所需细胞数量为 100,000 个。
    7. 让细胞在标准细胞培养箱中贴壁并生长（37 °C，5% CO₂）2)。每次传代O9-1细胞后的第二天必须更换培养基。
  3. O9-1 细胞的冻存
    1. 为O9-1细胞制备2倍冻存培养基，将以下成分用DMEM稀释（括号内为终浓度）：40% FBS和20% DMSO。
    2. 过滤除菌2×冻存培养基，并置于4 °C保存。2×冻存培养基必须在使用当天配制，未使用部分应全部丢弃。
      注意：在O9-1细胞融合度达到80%时进行冻存。
    3. 用DPBS洗涤孔板两次；用移液器轻轻操作，避免细胞丢失。
    4. 用0.05%胰蛋白酶-EDTA在37 °C下消化细胞3分钟，然后加入等体积含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中和胰蛋白酶。反复吹打液体，使其覆盖孔板整个表面，尽可能使更多细胞从培养板上解离下来。
    5. 将所有孔板内容物转移至离心管中，在180 x g条件下离心3分钟 g吸弃上清液，加入 2 mL PBS，轻轻拍打重悬。
    6. 使用10 µL细胞悬液，按照上述方法用血细胞计数板进行细胞计数。
    7. 离心细胞悬液，180 × g，3 分钟 g吸弃上清液，调整所需基础培养基的量，然后加入等体积的2x冻存培养基。
      注意：细胞在浓度为 1 x 106 细胞/mL（每支冻存管1 mL）。
    8. 将细胞转移至冻存管并做好相应标记。将冻存管放入带盖的聚苯乙烯盒中，于-80 °C缓慢冷却至少24小时，随后转移至液氮中保存。
      注意：为获得最佳效果，应尽量缩短细胞计数时间，以及加入2倍冻存液与将冻存管转移至-80 °C之间的时间间隔。

4. O9-1 细胞的操作

  1. 在 O9-1 细胞中进行 siRNA 沉默
    1. 实验开始前，按照上述方法（步骤 3.1.4–3.1.8）解冻并用基底膜基质包被 24 孔板。复苏并接种 O9-1 细胞，使其生长至 60% 至 80% 汇合度。
    2. 根据相应孔体积，用无血清培养基稀释脂质体。将 siRNA 用无血清培养基稀释至终浓度。按照制造商推荐的比例，将稀释后的 siRNA 加入稀释后的脂质体中。用移液器充分混匀后孵育。
      注意：请遵循制造商关于使用体积、孵育时间和温度的说明。
    3. 根据制造商的建议，向细胞中加入适当体积的 siRNA-脂质复合物。
    4. 将细胞在标准细胞培养孵箱（37 °C，5% CO2）中孵育 24 小时。根据需要进行后续步骤（提取 RNA、提取蛋白质、染色等）。
      注意：siRNA 沉默的时间和浓度可能因具体实验而异。
  2. 利用 CRISPR-Cas9 基因组编辑技术在 O9-1 细胞中进行基因敲除
    注意：请参考先前发表的在哺乳动物细胞系中使用 CRISPR-Cas9 的实验方案29。此处提供的是 CRISPR-Cas9 基因组编辑及相关步骤的简化描述。
    1. 使用 sgRNA 设计工具获取 sgRNA 序列。
    2. 将 sgRNA 连接到 pSpCas9(bb)-2a-GFP 载体30。
    3. 根据制造商的建议，采用标准脂质体转染法将载体转染至 O9-1 细胞。
    4. 将细胞置于标准细胞培养孵箱中，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 24 小时。
    5. 基于 GFP/7-AAD 进行荧光激活细胞分选（FACS）。将 GFP+ 单个细胞接种至 96 孔板中。
    6. 将细胞在孵箱中继续培养 4 天。弃去含有多个克隆的孔。
    7. 使用设计用于检测缺失的引物进行 PCR。PCR 后，将 PCR 产物在琼脂糖凝胶上电泳以评估条带大小。通过 Western 印迹验证 CRISPR-Cas9 编辑实现的敲除效率（Yap 基因敲除结果示例见图 3）。

5. O9-1 细胞分化

  1. O9-1 细胞向成骨细胞的分化
    1. 配制成骨分化培养基：将以下成分加入 α-MEM 中稀释（括号内为终浓度）：0.1 μM 地塞米松、100 ng/mL 骨形态发生蛋白 2（BMP2）、50 µg/mL 抗坏血酸、10 mM β-甘油磷酸钠、10% 胎牛血清（FBS）、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素。
    2. 通过免疫染色检测分化后成骨细胞中的成骨细胞标志物骨钙素，如图4所示。
      注：也可通过其他成骨细胞标志物、茜素红染色或碱性磷酸酶染色评估成骨分化。
  2. O9-1 细胞向软骨细胞的分化
    1. 配制软骨细胞分化培养基：将以下成分加入 α-MEM 中稀释（括号内为终浓度）：5% 胎牛血清（FCS）、1% 胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、10 ng/mL 转化生长因子 β（TGF-β3）、50 μg/mL 抗坏血酸、10 ng/mL BMP2、0.1 μM 地塞米松和 1 mM 丙酮酸钠。
    2. 首先将 O9-1 细胞在成骨诱导培养基中以单层培养 3 天，随后用胰酶消化并以微团（micromass）形式在软骨细胞分化培养基中继续培养 7 天。
    3. 通过阿利新蓝染色或软骨细胞标志物检测软骨分化情况。
  3. O9-1 细胞向平滑肌细胞的分化
    1. 配制平滑肌细胞分化培养基：将以下成分加入 DMEM 中稀释（括号内为终浓度）：100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素和 10% FBS。
    2. 使用针对平滑肌细胞标志物（如平滑肌肌动蛋白，SMA）的抗体进行免疫荧光染色，评估平滑肌细胞分化，示例见图5。
  4. O9-1 细胞向胶质细胞的分化
    1. 配制胶质细胞分化培养基：将以下成分加入 DMEM/F12 中稀释（括号内为终浓度）：1× B-27 添加剂、2 mM L-谷氨酰胺、50 ng/mL BMP2、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、50 ng/mL 白血病抑制因子（LIF）和 1% 热灭活 FBS。
    2. 使用针对胶质细胞标志物（如脂肪酸结合蛋白 7，FABP7）的抗体进行免疫荧光染色，评估胶质细胞分化。

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结果

我们进行基因敲低和基因敲除实验的目的是研究Yap和Taz在O9-1细胞中功能丧失所产生的效应。在开展基因敲低和基因敲除实验之前，必须按照前述方法准备好基础培养基并培养O9-1细胞（例如，基底膜基质需完全覆盖整个培养板，如图1所示；O9-1细胞需从液氮中复苏，如图2所示）。我们按照前述方法进行基因敲低实验，同时对Yap和Taz进行敲低。将等量的Yap siRNA和Taz siRNA加入至制造商推荐的终体积中。在对照组培养板中加入等体积的非靶向siRNA。

A Yap-null O9-1细胞系是通过删除exon 3生成的 Yap 通过使用 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术，如 Wang 所述...

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讨论

神经嵴细胞（NCC）在胚胎形态发生过程中是多种组织和器官形成中具有多功能性的关键贡献者。O9-1细胞系保持了向多种不同类型细胞分化的潜能，并模拟了 体内 NCCs 的特征，使其成为一种有用的 体外 研究神经嵴细胞（NCCs）基因功能和分子调控的工具。O9-1细胞的不同状态可能对应于不同的神经嵴衍生物 体内，具体取决于 O9-1 细胞的培养条件。当在非分化培养条件下培养时，O9-1 细胞可维持在多能状态，类似于常规的干细胞培养。此类非分化的 O9-1 细胞可能对应于迁移前及迁移中的多能干细胞样神经嵴细胞（NCCs） 体内此外，在特定的分化培养条件下，O9-1细胞可分化为多种不同类型的细胞，这一特性在研究神经嵴细胞（NCCs）从多能干细胞分化为特定成熟细胞类型过程中的基因功能与调控机制方面具有重要意义。正在分化的O9-1细胞可能对应于迁移后的神经嵴衍生成细胞。 体内，其细胞命运不同，可分化为多种细胞类型。根据研究需求，可采用不同的操作和培养方式处理O9-1细胞，以实现互补 体内 使用动物模型的NCC研究。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

德克萨斯心脏研究所科学出版部的Nicole Stancel博士（经认证的科学编辑）提供了编辑支持。我们还感谢以下资助来源：美国心脏协会国家中心科学家发展奖（14SDG19840000，授予J. Wang）；德克萨斯州Rolanette和Berdon Lawrence骨病研究项目2014年Lawrence研究奖（授予J. Wang）；以及美国国立卫生研究院（DE026561和DE025873授予J. Wang，DE016320和DE019650授予R. Maxson）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
活性STO饲养层细胞ATCCATCC CRL-1503亦提供丝裂霉素C灭活形式，货号 # ATCC 56-X
O9-1 小鼠颅神经嵴细胞系Millipore SigmaSCC049
DMEM，高糖，无谷氨酰胺Gibco11960-044
DMEM，高糖HycloneSH30243.01
FBS（胎牛血清）Millipore SigmaES-009-B
青霉素-链霉素Gibco15140-122
L-谷氨酰胺 200 mM（100倍浓缩液）Gibco25030-081
猪皮明胶SigmaG1890
HBSS 中的 0.25% 胰蛋白酶-EDTAGenesee Scientific25-510
不含钙和镁的DPBS（Dulbecco磷酸盐缓冲液）Lonza17-512F
MEM非必需氨基酸（MEM NEAA）100×Gibco11140-050
丙酮酸钠（100 mM）Gibco11360-070
2-巯基乙醇SigmaM-7522
ESGRO 白血病抑制因子 (LIF) 106 单位/毫升默克生命科学ESG1106
重组人碱性成纤维细胞生长因子（rhFGF-basic）R&D Systems233-FB-025
丝裂霉素C罗氏10107409001
Matrigel基质康宁356234
DMSO（二甲基亚砜）Millipore SigmaMX1458-6
Lipofectamine RNAiMAX赛默飞世尔科技13778-075
Opti-MEM I (1x)Gibco31985-070
最低必需培养基，α 1×，含伊格尔盐、核糖核苷、脱氧核糖核苷 &和 L-谷氨酰胺康宁10-022-CV
ON-TARGETplus Wwtr1 siRNADharmaconL-041057
ON-TARGETplus 非靶向对照池DharmaconD-001810
ON-TARGETplus Yap1 siRNADharmaconL-046247
胎牛血清（FCS）
ITS（胰岛素-转铁蛋白-硒）
TGF-β3
抗坏血酸
BMP2（骨形态发生蛋白2）
地塞米松
B-27添加剂

参考文献

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重印与许可

勘误


Formal Correction: Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells
Posted by JoVE Editors on 11/30/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. The Protocol section was updated.

Step 2.1 was updated from:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

to:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 µM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

Step 5.1.1 was updated from:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.

to:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 µM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 µg/mL streptomycin.

Step 5.2.1 was updated from:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

to:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 µM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

Step 5.4.1 was updated from:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

to:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

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