基于水凝胶微室阵列（HMCA）培养板的癌细胞侵袭分析与抗转移药物筛选

摘要

介绍了一种基于HMCA的成像板，用于进行侵袭实验。该成像板可促进三维（3D）肿瘤类球体的形成，并可检测癌细胞向细胞外基质（ECM）中的侵袭。侵袭实验的定量通过半自动分析实现。

摘要

癌症转移被认为是导致90%癌症死亡的原因。转移是一个多阶段过程，起始于肿瘤细胞侵入邻近组织。因此，侵袭是转移过程中的关键步骤，使得对侵袭过程的研究以及抗转移药物的开发具有重要意义。为满足这一需求，亟需开发三维 体外 最接近地模拟实体瘤及其微环境结构的模型 体内 一方面要能够模拟肿瘤侵袭的复杂状态，同时又要具备可重复性、稳健性，并适用于高产量和高通量检测。目前大多数侵袭实验依赖于复杂的微流控技术，这类技术适用于基础研究，但不适合大规模药物筛选。其他基于孔板装置的实验通常在每个孔中仅放置单个类球体，耗材量大，且每种条件下的样本量较低。本实验方案的目标是建立一种简单且可重复的仿生三维细胞体系，用于大规模肿瘤类球体侵袭能力的分析。我们开发了一种基于HMCA成像板的三维侵袭模型，用于肿瘤侵袭研究及抗转移药物的筛选。该装置可在每个孔内生成大量均一的类球体（每种条件下的样本量高），并将其置于细胞外基质（ECM）成分中，同时实现对类球体的连续、同步观察与单个类球体水平的定量分析，适用于中等通量的抗转移药物筛选。本文以HeLa和MCF7类球体的制备为例，展示单细胞侵袭与集体性侵袭模式。我们比较了细胞外基质成分透明质酸（HA）对围绕HeLa类球体的胶原中侵袭能力的影响。最后，我们将漆黄素（Fisetin，侵袭抑制剂）作用于HeLa类球体，将一氧化氮（NO，侵袭激活剂）作用于MCF7类球体。实验结果通过自主开发的软件进行分析，该软件支持半自动、简便且快速的数据处理，便于多参数评估。

引言

癌症死亡主要归因于转移性细胞扩散至远端部位。目前许多癌症治疗研究致力于靶向抑制或预防转移性病灶的形成以及系统性转移疾病的进展¹。癌细胞迁移是肿瘤转移过程中的关键步骤，因此，研究癌症侵袭级联过程极为重要，也是发现抗转移治疗药物的先决条件。

使用动物模型作为研究转移性疾病的研究工具，往往成本高昂，且并不总能代表人类肿瘤的真实情况。此外，细胞外微环境的拓扑结构、力学特性及化学组成会显著影响癌细胞的行为²。由于体内（in vivo）模型本质上无法分离并控制影响癌症侵袭和转移的特定参数，因此迫切需要可调控的仿生体外（in vitro）模型。

为了转移至远端器官，癌细胞必须表现出可迁移和侵袭的表型特征，这些特征可作为治疗的靶点。然而，由于大多数体外癌细胞模型无法模拟实体瘤的真实特征³，因此检测具有生理相关性的表型极为困难。此外，肿瘤内部存在的表型异质性决定了必须在单个组分分辨率水平上分析肿瘤迁移，以发现针对特定表型的治疗方法，例如靶向异质性肿瘤中具有启动转移能力的细胞亚群⁴。

细胞运动性和集体迁移的研究主要在上皮细胞的单层培养体系中进行....

方案

1. HMCA 平板压印

注意：本方案中所用聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章和HMCA成像板的设计与制备全过程已在我们先前的文章中有详细描述^15,16。PDMS印章（负型结构）用于压印HMCA（正型结构），每个孔中包含约450个微腔（MC）（图1A）。如图1B所示，每个微腔呈倒置的截角方形锥体结构（高度：190 µm，小底面积：90 µm × 90 µm， 大底面积： 370 µm × 370 µm）。HMCA板用于3D肿瘤类球体的制备与培养，随后用于侵袭实验。此外，也可使用商用印章进行HMCA的制备。

1. 配制6%低熔点琼脂糖（LMA）溶液。将LMA粉末和无菌磷酸盐缓冲液（PBS）（每10 mL PBS中加入0.6 g LMA）加入带有磁力搅拌子的玻璃瓶中。将玻璃瓶置于加热板上，边加热至80 °C边搅拌数小时，直至形成均匀溶液。使用前将溶液保持在70 °C。
2. 将PDMS印章放入烘箱中预热至70 °C，保持温热状态直至使用。或者，使用商用印章并按照其说明操作。
3. 将商用6孔玻璃底培养板置于预热至75 °C的干浴仪上，静置数分钟，直至培养板完全升温。

结果

独特的HMCA成像板用于3D肿瘤球体的侵袭实验。整个实验过程，从球体形成到侵袭过程及后续操作，均在同一块板内完成。在球体形成阶段，将HeLa细胞接种至阵列基底中，细胞依靠重力沉降进入水凝胶微孔（MCs）。具有非黏附性/低黏附特性的水凝胶微孔可促进细胞间的相互作用，从而形成3D肿瘤球体。 图2A 显示细胞在使用 150 × 10 后沉降于 MCs 中³ 细胞/毫升上样溶液（即，每个微腔（MC）约含16个细胞的计算值）。显然，每个微腔中的细胞占据数在阵列中分布并不均匀，统计得到的平均分布为每个微腔14.78 ± 3.60个细胞。表格中 图2B 总结了整个HMCA板上每个微腔（MC）的细胞分布情况。微腔内细胞分布的平均变异系数（CV）为43.33%，微腔间为24.37%。细胞占据率的差异至关重要，直接决定了所形成类球体的大小及其在整块板上的均一性。为了降低或最小化因每个微腔中细胞数量不同而带来的变异性，结果分析以单个单元.......

讨论

已有充分文献记载，具有复杂三维多细胞结构的生物体与常用的二维单层培养细胞存在显著差异，这凸显了在药物筛选中使用更能模拟生物体功能和生理过程的细胞模型的重要性。近年来，多细胞球体、类器官培养、类器官以及器官芯片等三维多细胞模型已被引入标准化药物发现流程中⁸。然而，三维多细胞模型的高度复杂性在很大程度上影响了其稳定性、并行化操作以及数据分析能力，而这些因素对于检测效率至关重要。

对侵袭能力的定量评估通常通过测量细胞穿过水凝胶材料的运动来进行。为了利用传统的微孔板测量肿瘤侵袭，通常将大量癌细胞接种于圆底孔板中，并通过离心迫使细胞聚集^21,22。这类孔板限制了相邻孔之间细胞/类球体的相互作用，而圆底结构则影响光学质量，使成像过程变得复杂。在其他方法中，单个细胞被随机包埋于水凝胶内，在三维环境中生长并发挥功能，但并不一定发育成成熟的类球体^23,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6 个带 14 mm 微孔和 #1.5 盖玻片的微孔玻璃底培养板	Cellvis	P06-14-1.5-N	用于HMCA压印的商用玻璃底板
UltraPure 低熔点琼脂糖	Invitrogen	16520100	6% 琼脂糖溶液加热至 80 °使用前，将1%琼脂糖溶液加热至37℃ °C
胰蛋白酶EDTA溶液B	生物工业公司	03-052-1A	37℃预热 °使用前需冷藏
DMEM培养基，高糖	生物工业公司	01-055-1A	37℃预热 °使用前置于 C
特殊新生小牛血清（NBCS）	生物工业公司	04-122-1A	热灭活
DPBS（10倍浓度），无钙，无镁	生物工业公司	02-023-5A	使用前保持在冰上
NaOH，无水	Sigma-Aldrich	S5881-500G	用于配制 1 M NaOH 溶液
来自大鼠尾部的Cultrex I型胶原蛋白，5 mg/mL	Trevigen	3440-100-01	使用前置于冰上保存
透明质酸钠盐	Sigma-Aldrich	H5542-10MG	使用前保持在冰上
漆黄素	Sigma-Aldrich	F505-100MG	添加至培养基中的侵袭抑制剂
DETA/NO	Enzo Life Sciences	alx-430-014-m005	添加至培养基中的NO供体
PI	Sigma-Aldrich	P4170	在极低浓度下使用，无需洗涤步骤
Dymax 5000-EC 紫外线泛光灯完整系统（含光屏蔽罩） &和 Dymax 400 瓦特 EC 电源	Dymax 公司	PN 39823	用于HMCA平板的紫外线灭菌
倒置IX81显微镜	Olympus		用于自动图像采集
显微镜用培养箱	生命成像服务		对需要图像采集的延时实验至关重要，已预调至37℃ °C，5% CO2 并维持湿润的环境
亚微米电动载物台类型 SCAN-IM	Marzhauser Wetzlar GmbH		用于预设图像采集区域，实现自动图像采集
14位，ORCA II C4742-98 冷却相机	滨松光子学		高度敏感，适用于成像
用于PI检测的荧光滤光片组	Chroma Technology Corporation		滤光片组参数：激发滤光片 530-550 nm，二向色镜 565 nm 长通，发射滤光片 600-660 nm
奥林巴斯 Cell^P 操作软件	奥林巴斯		用于控制显微镜、电动载物台、相机及图像采集的软件
Matlab R2014B 分析软件	Mathworks		用于开发内部图像分析图形用户界面
Excel 软件	微软		用于数据管理、计算、绘图及统计分析