用于软骨再生的脂肪组织来源基质血管组分制备的临床方案

摘要

本文介绍了一种制备脂肪组织来源的基质血管组分的方案，并将其应用于骨关节炎患者，通过再生类似软骨的组织以改善膝关节功能。

摘要

骨关节炎（OA）是最常见的致残性疾病之一。 近年来，已有大量研究尝试通过使用不同形式的间充质干细胞（MSCs）来改善膝关节功能。在韩国，骨髓浓缩物和脐带血来源的干细胞已获得韩国食品药品管理局（KFDA）批准用于软骨再生。此外，KFDA也已批准将脂肪组织来源的基质血管组分（SVF）用于人体患者的关节注射。自体脂肪组织来源的SVF除了含有间充质干细胞外，还包含细胞外基质（ECM）。ECM可分泌多种细胞因子，这些细胞因子与透明质酸（HA）以及经氯化钙激活的富血小板血浆（PRP）共同作用，可能有助于MSCs再生软骨并改善膝关节功能。本文介绍了一种通过在OA患者体内再生类似软骨组织以改善膝关节功能的操作方案。该方案的效果最早于2011年报道，随后又有若干补充性研究发表。该方案包括通过抽脂术获取自体脂肪抽吸物，并将其与胶原酶混合。随后对脂肪抽吸物-胶原酶混合物进行切割和均质化处理，以去除可能在注射过程中堵塞针头的大块纤维组织。之后将混合物进行孵育，以获得脂肪组织来源的SVF。最终得到的脂肪组织来源SVF含有脂肪组织来源的MSCs以及ECM残余成分，将其与HA及经氯化钙激活的PRP联合后注射至患者膝关节内。文中包含三例接受本方案治疗的患者案例，结果显示膝关节疼痛、肿胀及活动范围均有所改善，并有MRI证据显示出现了类似透明软骨的组织。

引言

间充质干细胞（MSCs）具有再生软骨的能力^1,2,3,4,5,6。这些细胞可从多种来源轻松获取，包括骨髓、脐带血和脂肪组织等。在这些来源中，脂肪组织是唯一一种在临床条件下无需体外扩增即可获得足够数量MSCs以实现软骨再生的来源^7,8。自体骨髓来源的基质血管组分（SVF）也易于获取，但未经培养扩增的骨髓中所含干细胞数量非常少^7,8。脐带血可能含有足够数量的MSCs，但其并非自体SVF的 readily available 来源。

目前已有多种用于临床应用的脂肪组织处理方法以获取基质血管组分（SVF）。其中，Zuk et al.^5,6 开发并验证的利用胶原酶从脂肪组织中获取间充质干细胞（MSCs）的方法被广泛接受。该胶原酶法已针对骨科领域的临床应用进行了改良。为适用于临床环境，整个系统必须为封闭式系统，以在保证无菌性的同时维持操作便利性。本文介绍的一项特定改良措施是对抽吸脂肪组织进行均质化处理。较小尺寸的抽吸脂肪组织相较于较大尺寸者能更快地被消化，从而导致脂肪组织分解不均。此外，较大尺寸的抽吸脂肪组织可能产生纤维组织，在关节注射过程中容易堵塞注射器和针头^9,10。为避免上述问题，可在与胶原酶孵育前，通过剪切和研磨的方式对抽吸脂肪组织进行均质化处理。经此处理后获得的脂肪组织来源SVF，其细胞外基质（ECM）的均一性可能高于未经均质化处理的抽吸脂肪组织¹¹。SVF中被降解的ECM成分可发挥支架作用¹²。

2009年，韩国食品药品管理局（KFDA）允许在医疗机构内由医生进行 минималь操作 处理的自体脂肪组织来源的基质血管组分（SVF）用于临床¹³。此后，自体脂肪组织来源的SVF已被用作一种潜在治疗剂，通过促进类软骨组织再生，以改善骨关节炎（OA）患者的膝关节功能^{10,14,15,16,17,18}。

2011年，Pak 首次证明，来源于脂肪组织基质血管组分（SVF）的脂肪组织来源干细胞（ASCs）在与富血小板血浆（PRP）联合注射时，可改善人类骨关节炎（OA）患者的膝关节功能，并可能促进类软骨组织的再生 ¹⁴。此外，Pak et al. 于2013年报道了涉及91例患者的安全性数据，该研究中报告的平均有效率为67%¹⁵。随后，Pak et al. 的其他研究进一步表明，对于伴有半月板撕裂和髌骨软化症的患者，膝关节功能得到改善，这可能归因于类软骨组织的再生^10,16,17,18。根据已发表的文章可知，采用本文所述方案处理每100 g脂肪组织所获得的干细胞数量，依据患者个体特征的不同，可能在1,000,000至40,000,000之间波动^{8,19,20,21,22,23}。

本文介绍了一种使用自体脂肪组织来源的基质血管组分（SVF）联合透明质酸（HA）和经氯化钙激活的富血小板血浆（PRP）治疗人类膝骨关节炎的临床方案。该临床方案的首个版本于2011年报道，采用封闭式手动系统以维持无菌环境¹⁴。此后，相同的方案在保持无菌条件的基础上进行了优化，并于2013年和2016年再次报道^10,15。本文呈现的是经过优化后的临床方案。该方案的示意图见图1。

图1：实验方案的示意图概览。 请点击此处查看此图的放大版本。

方案

本病例报告的报告批准与知情同意由明志大学机构审查委员会（MJUIRB）豁免。 此外，本临床方案符合《赫尔辛基宣言》以及韩国食品药品安全部（KFDA）的法规指南。对于相关操作，已从患者处获得知情同意。

1. 吸脂术

注意：需采用无菌技术操作。

1. 采用以下纳入标准：（1）MRI 证实为 3 期骨关节炎；（2）性别不限（男性或女性）；（3）年龄超过 18 岁；（4）具备足够的（100–110 g）脂肪组织可供抽脂；（5）不愿接受手术治疗；（6）保守治疗无效；（7）持续存在致残性疼痛。
2. 采用以下排除标准：（1）存在可能影响疼痛状况的活动性炎症或结缔组织疾病即，，系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎，纤维肌痛）；（2）可能影响疼痛状况的活动性内分泌疾病即， 甲状腺功能减退症，糖尿病）；（3）可能影响疼痛状况的活动性神经系统疾病即，， 周围神经病变、多发性硬化症）；（4）需要用药治疗的活动性肺部疾病；以及（5）近3个月内无关节内类固醇注射史。
3. 将患者带入配备生物危害A级罩的手术室，并使其仰卧。
4. 用5%聚维酮碘清洁患者的腹部区域，并使用无菌技术铺巾，暴露已清洁的腹部区域以进行吸脂术。
5. 在脐部下方约5 cm偏外侧处，使用5 mL注射器抽取不含肾上腺素的2%利多卡因，以25号、1½英寸针头在拟切口部位的左右两侧各2 mL，于表皮层注射进行局部麻醉。
6. 使用10 mL注射器（配25号、1½英寸针头）抽取5 mL肿胀液（500 mL生理盐水、40 mL 2%利多卡因、20 mL 0.5%布比卡因、0.5 mL 1:1000肾上腺素），对拟切口部位进行局部麻醉。
7. 在脐部下方约5 cm处的两侧，捏起皮肤以增加皮下层次的深度，做两个长约0.5 cm的切口。
8. 使用11号刀片刺穿隆起的皮肤，穿透至皮下层，但不要穿透腹壁。
9. 使用20 cm长、16号套管针，将700至800 mL肿胀液注入拟行吸脂术的整个下腹部皮下层进行麻醉。
10. 在完成肿胀液对整个下腹部的浸润后，准备吸脂装置：将一根3.0 mm的套管连接至60 mL（或30 mL）注射器，用于手动吸脂；或使用专为真空辅助吸脂设计的3.0 mm套管，将其连接至离心套件和密闭系统注射器（以保持无菌状态），再连接至负压机进行真空辅助吸脂。
11. 进行吸脂术以获取100–110 g脂肪组织（不含肿胀液）。吸脂过程中会同时获取含有肿胀液的脂肪组织，需将其分离并去除。
12. 为分离肿胀液，首先通过重力作用，将离心套件中的脂肪组织转移至一支60 mL注射器中，并将注射器垂直放置（即， 注射器底部为脂肪组织部分。静置5-6分钟后，脂肪组织与肿胀液将完全分离。通过按压注射器推杆上部，移除注射器底部的液体。
13. 重复上述步骤1.9-1.11，直至每膝累积获得100-110 g脂肪组织（吸脂物）。

2. 使用无菌封闭系统制备ASC/ECM混合物

1. 在通过重力分离肿胀液并收集每套60 mL离心套件50–55 g脂肪抽吸物后，将2套装有无菌封闭系统的离心套件放入离心机容器桶中，以1600 × g离心 g 5分钟，使脂肪抽吸物浓缩，并将液体与脂肪组织分离。在此进一步浓缩过程中，脂肪抽吸物在某些情况下可能产生脂肪油。
2. 小心操作，避免晃动，取下离心套件顶部的安全帽和底部的塞子。
3. 通过缓慢按压离心套件推杆的顶部来移除底部液体。
4. 在另一支60 mL注射器中，溶解10 mg胶原酶（5 mg针对结缔组织的特异性胶原酶）²⁴ 以及5 mg针对脂肪组织的胶原酶²⁵用50 mL生理盐水冲洗。
5. 将约25–30 mL浓缩脂肪抽吸物与溶解的胶原酶混合（使用针对结缔组织的胶原酶，5 mg） 以及5 mg专用于脂肪组织的胶原酶）按1:1（v:v）的比例，通过专用连接器将60 mL注射器与离心套件连接。
6. 将浓缩的脂肪抽吸物与胶原酶通过推杆或推注器在60 mL注射器与离心套件之间反复推注，充分混匀内容物。
7. 将脂肪抽吸物与胶原酶的混合物重新转移至60 mL注射器中。
8. 将每个装有混合物的60 mL注射器连接至含有刀片的组织匀浆器。
9. 将一个空的60 mL注射器连接到匀浆器的另一端。
10. 通过匀浆器将混合物推入另一个60 mL注射器中，重复4-6次，以切割和切碎脂肪抽吸物。
11. 通过专用连接器将均质化的脂肪抽吸物和胶原酶混合物转移回60 mL离心套件
12. 将离心管套件放入容器中，置于已预热至 37 °C 的培养箱内。
13. 将两个离心试剂盒与匀浆混合物在37 °C孵育40分钟，同时以45 rpm转速旋转。
14. 孵育40 min后，以无菌操作方式将容器从培养箱中取出，然后取出离心套件并放入离心机中。
15. 将混合物在800 x g下离心 g 5分钟，以分离脂肪组织来源的基质血管组分（SVF）。
16. 离心后，通过移除柱塞顶部的注射器帽，并在柱塞开口处连接一个30 mL注射器，从每个离心套件中移除上清液（包含胶原酶和消化的脂肪组织） 通过 注射器锁定连接
17. 缓慢下压30 mL注射器的筒部，使上清液流入30 mL注射器中。
18. 将30 mL注射器筒完全下压至离心套件底部剩余3-4 mL处，仅保留最后3-4 mL的脂肪组织来源SVF。弃去上清液。
19. 从柱塞顶部取下30 mL注射器，并用5%葡萄糖乳酸林格液（D5LR）充满注射器。
20. 将装有 D5LR 的 30 mL 注射器连接至柱塞开口上方，向含有 3-4 mL 脂肪组织来源 SVF 的离心套件中加入 D5LR 至总体积达 55 mL。
21. 移除30 mL注射器，盖紧柱塞，再次以300 x g离心离心套件 g 4 分钟。
22. 重复步骤 2.17–2.21，共进行 4 次洗涤。所使用的胶原酶为异源性。因此，大部分胶原酶可通过 4 次洗涤去除。然而，为符合美国食品药品监督管理局（FDA）的批准要求，可能需要对方案进行优化，以彻底清除终体积中的胶原酶残留；尽管目前胶原酶残留量可能已低至对患者无任何临床不良反应的程度。
23. 4之后^th 离心后，为获得最终用于注射的SVF，移除离心套件底部开口处的安全帽和塞子，切勿摇晃或翻转离心套件。
24. 使用特制连接器将一个20 mL注射器连接到离心套件的底部开口。
25. 反复抽拉注射器活塞数次，以混匀已沉降到离心管底部的细胞。
26. 移除含有ASCs和ECM以及其他细胞和组织的SVF总液体体积（通常每次离心套件用于膝关节注射时约为3-4 mL）。

3. 采用无菌技术制备PRP

1. 在准备ASCs和ECM的同时，抽取30 mL自体血，并加入2.5 mL抗凝剂柠檬酸葡萄糖溶液A。
2. 将采集的血液转移至60 mL离心套件中。
3. 以730 × g 离心5分钟，去除上清液并转移至新的60 mL离心套件中；再以1300 × g 离心4分钟，获得3–4 mL富血小板血浆（PRP）。
4. 在注射前立即向PRP中加入3%（w/v）氯化钙，按10:2（PRP:氯化钙，v:v）的比例激活PRP。
5. 向经氯化钙激活的PRP中加入0.5%（w/v）透明质酸（HA）作为支架材料。这些含有ECM的ASCs、经氯化钙激活的PRP以及HA共同构成ASC/ECM混合物。

4. 基于ASC/ECM混合物的治疗

1. 用5%聚维酮碘清洁患者的膝关节，并以无菌方式铺巾。
2. 触诊膝关节前方，定位胫骨与股骨之间的关节间隙。
3. 用稀释的利多卡因（1 mL 1% 利多卡因与 4 mL 生理盐水混合）从皮肤至关节囊外侧进行表皮麻醉。
4. 用稀释的罗哌卡因麻醉关节囊内部（将1 mL 0.75%罗哌卡因与3 mL生理盐水混合稀释）。
5. 通过注射器连接器将2 mL HA与含有6-8 mL SVF的20 mL注射器混合。
6. 使用注射器-注射器连接器，将0.4 mL氯化钙加入已制备好的3-4 mL自体PRP中，该PRP已盛装于一支5 mL注射器内并准备就绪。
7. 将3.5–4.5 mL PRP/氯化钙加入5 mL注射器中，与20 mL注射器中的8–10 mL HA/SVF混合物混合 通过 注射器对注射器连接器
8. 立即使用38毫米长、18号针头，将混合液（约12–15 mL）缓慢注入膝关节的胫股前关节腔内，可选择在超声引导下或无超声引导下进行。
9. 注射后，将4×4棉纱布折叠4次，覆盖于注射部位并施加压力，再用胶带固定折叠后的4×4纱布进行包扎。
10. 指导患者保持静止60分钟，以促进细胞贴壁。
11. 指导患者从诊所出院后至少1周内限制活动。
12. 3 周内返回诊所，再接受三次经氯化钙激活的 PRP 注射。

5. 治疗后随访

1. 在治疗后第2、4、16（或18、22）周评估患者的疼痛改善情况（采用视觉模拟评分法，VAS）及功能改善情况（采用物理治疗相关参数）。按照先前所述方法^26,27测定功能评分指数（FRI）、VAS以及关节活动范围（ROM）。
2. 治疗后3个月通过MRI随访患者。

结果

三名患者（一名87岁患有3期骨关节炎的女性、一名68岁患有3期骨关节炎的男性，以及一名60岁患有3期骨关节炎的女性）既往无显著病史，因持续性膝关节疼痛就诊，希望接受潜在的自体脂肪组织来源的基质血管组分（SVF）治疗。三名患者均经骨科医生检查膝关节，曾被建议行全膝关节置换术（TKR），但均不愿接受手术。在治疗前，三名患者均已接受过多次皮质类固醇和透明质酸（HA）注射，但均未获得持久改善。

这位87岁的韩国女性患者在就诊时，即使在静息状态下也主诉有剧烈疼痛（VAS评分为8分；图2A）。她表示在上下楼梯时疼痛加剧（[FRI：37；图2A）。体格检查发现轻度关节肿胀，活动范围（ROM）减小，并在屈曲时有压痛（图2B）。然而，未发现韧带松弛。麦克默里（McMurray）试验和阿普利（A...

讨论

2001年，Zuk et al. 通过使用胶原酶消化胶原基质，从脂肪组织中分离出干细胞⁶。随后，该研究团队证明，这些从脂肪组织中分离得到的干细胞可分化为软骨及其他中胚层来源的组织，从而证实这些干细胞具有间充质来源的特性。 

同样，本文所述方法是对原有技术进行改良后用于人体患者的实验方案。该方案的主要改进之处在于，采用封闭式注射器获取和处理脂肪抽吸物，以尽量减少组织与空气的接触，同时保持操作的便捷性。使用此类封闭式注射器获取脂肪组织 通过 吸脂术。随后，在封闭系统注射器内将吸出的脂肪组织与胶原酶混合。之后，通过在封闭系统注射器内稀释胶原酶浓度，去除混合物中的胶原酶。最终获得无菌的脂肪组织来源的基质血管组分（SVF），且该过程操作简便。 

通过采用类似方法，Pak 在 2011 年首次证明，自体脂肪组织来源的基质血管组分（SVF）可用于治疗骨关节炎（OA）患者，有望再生出类似软骨的组织。随后，Pak et al...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
5% 聚维酮碘（碘伏）	Firson Co., Ltd.	657400260
2% 利多卡因	Daehan Pharmaceutical Co.	670603480
肿胀液	Myungmoon Pharm. Co. Ltd.	N01BB01	该溶液由500 mL生理盐水、40 mL 2%利多卡因、20 mL 0.5%布比卡因和0.5 mL 1:1000肾上腺素组成。
Liberase TL 和 TM 研究级酶	Roche Applied Science	5401020001
D5LR	Dahan Pharm. Co., Ltd.	645101072	含5%葡萄糖的乳酸林格液
抗凝用枸橼酸葡萄糖溶液	Fenwal, Inc.	NDC:0942-0641	该溶液由0.8%枸橼酸、 0.22%柠檬酸钠和0.223%葡萄糖组成。
3% (w/v) 氯化钙	Choongwae Pharmaceutical Co.	644902101
0.5% (w/v) 透明质酸（Hyaluronic acid）	Dongkwang pharm. Co., Ltd.	645902030
0.25% 罗哌卡因	Huons Co., Ltd.	670600150
设备
3.0 mm 套管针	WOOJU Medical Instruments Co.	ML30200
60-mL 带锁扣注射器	BD (Becton Dickinson)	309653
离心桶套件	CPL Co., Ltd.	30-0827044
含刀片的组织匀浆器	CPL Co., Ltd.	30-0827045
旋转孵育混合仪	Medikan Co., Ltd	MS02060092
离心机	Hanil Scientific Inc.	CE1133
磁共振成像系统	Philips Medical Systems Inc.	18068
超声成像系统	Samsung Medison co., Ltd	CT-LK-V10-ICM-09.05.2007