本文介绍一种通过固定、封片、成像及成像后处理等步骤，在成年黑腹果蝇（Drosophila）腿部中利用荧光蛋白可视化轴突投射的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
关于神经元特化的大多数研究都是在遗传和生理上易于操作的模型中进行的，例如 C. elegans、Drosophila 幼虫和鱼类，这些生物均以波动式运动（如爬行或游泳）作为其主要的运动方式。然而，要更深入地理解单个运动神经元（MN）的特化过程——至少在为疾病治疗提供依据方面——则需要一个同样易于操作且能更好地模拟脊椎动物复杂附肢运动模式的系统。成年 Drosophila 的行走运动系统轻松满足了所有这些标准，因为在该模型中，不仅可以利用大量强大的遗传工具，还能在附肢运动的生理背景下，研究数量较少且易于区分的腿部运动神经元（每条腿约50个运动神经元）的特化过程。本文中，我们描述了一种在成年果蝇中可视化腿部肌肉神经支配的实验方案。
引言
与脊椎动物的肢体类似，Drosophila 成虫腿部也具有分节结构。每只果蝇的腿部包含14块肌肉，每块肌肉由多个肌纤维组成1,2。成虫腿部运动神经元（MNs）的细胞体位于腹神经索（VNC）每侧的T1（前胸）、T2（中胸）和T3（后胸）神经节中，腹神经索在结构上类似于脊椎动物的脊髓（图1）。每个神经节中约有50个运动神经元，它们投射至同侧腿部四个节段（基节、转节、股节和胫节）的肌肉（图1）3。重要的是，每个成虫腿部的运动神经元都具有独特的形态特征，且这种形态在不同个体间高度保守3,4。所有这些独特的运动神经元均起源于11个干细胞，即神经母细胞（NBs），这些细胞在幼虫阶段产生腿部运动神经元3,4。在幼虫阶段结束时，所有未成熟的终末分裂后运动神经元在变态过程中发生分化，形成特定的树突分支结构和轴突终末靶区，从而确立其独特的形态3,4。此前，我们验证了一个假设，即转录因子（TFs）的组合编码决定了每个 Drosophila 成虫腿部运动神经元的独特形态5。作为模型，我们采用了11个神经母细胞谱系之一的B谱系，该谱系可产生7个运动神经元，并证明在终末分裂后的成虫腿部运动神经元中表达的转录因子组合编码决定了各自的形态特征。通过重编程运动神经元中的转录因子编码，我们能够以可预测的方式改变其形态。我们将这些转录因子称为mTFs（形态决定转录因子）5。
成年运动神经元（MNs）形态学分析中最困难的部分之一，是以高分辨率在厚且具有自发荧光的角质层中清晰显示轴突。我们通常使用膜标记的GFP对轴突进行标记，该GFP通过二元表达系统在运动神经元中表达，例如DVglut-Gal4/UAS-mCD8::GFP或DVglut-QF/QUAS mCD8::GFP，其中DVglut是在运动神经元中强表达的驱动子6。将这些工具与其他克隆技术结合使用，例如带有可抑制标记的镶嵌分析（MARCM）7、顺式MARCM（cis-MARCM）8或MARCMbow5，可将GFP的表达限制在特定的MN亚群中，从而更便于进行轴突表型分析。我们已建立了一套实验方案，旨在解决成年黑腹果蝇（Drosophila）腿部特有的若干关键问题，以完整保留腿部运动神经元轴突的形态，便于成像及后续的三维重建，这些问题包括：（1）固定成年腿部内部结构的同时，不破坏轴突形态、内源性荧光表达以及腿部肌肉组织；（2）将腿部以适当的方向安装固定，确保整体结构在盖玻片下保持完整并适合成像；（3）图像处理以同时获得角质层背景信号和轴突的荧光信号。尽管本方案详细描述了运动神经元轴突中荧光表达的检测方法，但其同样适用于节肢动物腿部神经肌肉系统的其他组分的可视化研究。
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方案
1. 腿部解剖与固定
- 取一个玻璃多孔板，在适量的孔中加入70%乙醇。将15–20只经CO2麻醉的果蝇（性别和年龄不限）放入每个孔中，用毛刷轻轻将果蝇按入乙醇溶液，直至完全浸没。
注意：此步骤旨在去除表皮的疏水性。清洗时间不得超过1分钟，否则会增加表皮的自发荧光。 - 用含0.3%非离子表面活性剂的1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤果蝇3次，每次至少保持果蝇在此溶液中10分钟。
注意： 加入洗涤剂有助于更好地固定腿部，可能是因为其能增强固定剂渗入腿部内部。 - 将一个多孔板置于冰上，并同时准备一管4%多聚甲醛（PFA）溶液。
注意： 必须使用16%无乙醇PFA储备液新鲜配制4% PFA溶液，这一步至关重要。 - 使用镊子去除果蝇的头部和腹部，注意不要损伤胸部节段或腿部。
注意：去除腹部后更便于抓握果蝇并进行腿部解剖。 - 用镊子从胸部节段上分离腿部，并将腿部放入含有4% PFA的孔中。操作时，用精细镊子的尖端在基节与胸部连接处轻轻但有力地推动，直至腿部脱落。
- 在4 °C条件下用4% PFA固定腿部过夜（总时间约20小时）。
- 用含0.3%非离子表面活性剂的1× PBS溶液洗涤腿部，每次20分钟，共洗5次。
- 将洗涤缓冲液替换为封片介质。在封片前，让腿部在封片介质中至少浸泡一天，以确保介质完全渗透至腿部内部。
注意：如果封片介质黏度过高，可用1× PBS将其稀释至80%，因为黏度的突然变化可能导致表皮塌陷，破坏腿部整体结构。根据所使用的Gal4驱动系，果蝇样品可在4 °C下于封片介质中保存1至3周后再进行封片。
2. 腿部固定
- 在载玻片左侧放置约 20 µL 的 70% 甘油，并用一块 22 x 22 mm 的正方形盖玻片覆盖2 盖玻片（图2A, B）。用移液器沿盖玻片右侧边缘附近一条与之平行的直线，滴加约 10 µL 封片剂。然后在载玻片右侧更远的位置再添加 30 µL 封片剂（图2C).
注意：当在腿部上方加盖盖玻片时（见下文），封片介质会缓慢扩散至盖玻片下方并环绕腿部，而不会移动其位置。 - 用精细镊子将腿从溶液中提起，轻轻放置在左侧盖玻片附近的封片介质上。对每条腿重复此操作，并自上而下依次排列。图 2D).
- 用镊子尖端间夹持的一滴培养基将腿部提起并转移。以两种方式摆放腿部：外侧向上或向下。
- 当所有腿（最多可安装6–8条腿）正确对齐后，将第二块盖玻片覆盖在腿上，使该盖玻片轻微地搭在先前放置的盖玻片上 （图2E） 以在盖玻片与组织之间留出空间，并防止腿部受损（图 2G).
注意：也可使用贴片小室或正畸蜡在盖玻片与载玻片之间制造间隙。 - 使用指甲油固定盖玻片每个角落的位置（图 2F).
注意：组织现已准备好进行成像。
3. 成像
- 使用488 nm激光器和两个探测器同时设置单条光路，以同时获取GFP荧光和角质层自发荧光信号。在软件光路窗口的光谱窗口中，通过范围控制或滑块显示，将一个探测器（探测器1）的检测范围设置为498–535 nm，另一个探测器（探测器2）的检测范围设置为566–652 nm。
注意：通常情况下，探测器1应为GaAsP探测器，探测器2应为光电倍增管。498–535 nm通道可最佳检测GFP信号，但也会检测到角质层的自发荧光；而566–652 nm通道仅检测角质层的自发荧光（图3A）。 - 使用20X或25X油浸物镜，分辨率为1024 × 1024像素，位深度为12位，Z轴步进设为1 µm。像素驻留时间设为约1.58 µs，图像平均帧数为2帧。使用高数值孔径的物镜。
- 根据所使用的共聚焦显微镜和成像软件设置所有其他参数。
- 确保566–652 nm探测器获得的角质层信号比498–535 nm探测器更明亮。为此，两个探测器应使用相同的488 nm激光功率。利用饱和标记，首先调节探测器1的增益，以获得足够明亮的GFP信号（图3B、D）。然后调节探测器2的增益，确保具有高强度角质层信号的区域（如腿部边缘、关节处）在该探测器中产生饱和信号（图3C、E）。
- 若腿部伸展且过大，无法在单幅图像中完整成像，可使用显微镜成像软件中的拼接或位置功能。
- 使用显微镜配套的专有成像软件或ImageJ/FIJI免费软件对最终图像进行重建（见下文）。
4. 成像后处理
- 在 ImageJ/FIJI 中打开共聚焦图像栈。
- 使用 FIJI 中的 Bioformats 插件（插件｜Bio-Formats｜Bio-formats 导入器）打开来自专有成像软件包的非 .TIF 格式图像9。
- 通过选择 图像｜颜色｜拆分通道 将各通道分离。
注：如果图像来自多个位置且需要重新拼接，请使用 FIJI 中的配对拼接插件（插件 > 拼接 > 配对拼接）10,11。 - 为从 GFP 信号中减去表皮信号，打开图像计算器（处理｜图像计算器）：将检测器 1 的图像栈选为图像 1（GFP + 表皮）（图 4A），在操作窗口中选择 减去，并将检测器 2 的图像栈选为图像 2（表皮）（图 4B）。结果仅保留内源性 GFP 信号（GFP）（图 4C）。
- 将此图像栈（GFP）与从检测器 2 获得的“仅表皮”图像栈（图 4B）重新合并（图像｜颜色｜合并通道），以获得包含组织特异性 GFP 信号和表皮信号的 RGB 图像，有助于识别腿部节段内的轴突分支（图 4D）。
- 调整每幅图像的对比度和亮度（图像｜调整｜亮度/对比度），然后生成单个 RGB 图像（图像｜类型｜RGB 颜色）。
注：为生成 Z 栈的最大投影（图像｜栈｜Z 投影…），对 GFP 信号使用最大强度投影，对表皮信号使用平均强度投影，可在合并两个通道前调整其亮度。
- 或者，可在 ImageJ/FIJI 中使用宏自动执行减法和图像处理。将补充文件 1 中的文本复制到宏编辑器中（插件｜新建｜宏），将宏保存至插件文件夹，并重启 ImageJ/FIJI 一次，以便使用该宏。
- 使用宏时，先打开共聚焦图像栈，并打开亮度/对比度窗口（图像｜调整｜亮度/对比度）。然后运行宏（插件｜宏｜运行），并按照提示操作。
- 当提示指定操作（图像计算器窗口）时，选择图像 1 为栈 1（GFP），图像 2 为栈 2（表皮），操作选择 减去。
注：该宏将生成处理后 GFP 信号的最大投影图像（栈 1 的 MAX_Result）、表皮的平均投影图像（AVG_stack2）、GFP 栈减去表皮栈后的结果（栈 1 的 Result）、以及未处理的表皮栈（stack2）。 - 当提示调整对比度时，使用亮度/对比度窗口中的控件，分别调整 GFP 最大投影图像和表皮平均投影图像的亮度/对比度，以生成一个 RGB 合并图像，其中 GFP 显示为绿色，表皮显示为灰色。合并栈 1 的结果与栈 2，以类似方式生成可用于下一阶段的 GFP 与表皮合并图像栈。
- 为三维可视化腿部结构，使用专用 3D 软件处理新生成的图像栈（图 4E）。
- 使用 3D 软件打开 RGB 图像栈（参见 材料表）。在弹出的对话框中，选择模式转换部分中的所有通道，并输入体素大小（像素体积）。
注：所有必要信息均包含在所使用的专有显微镜软件生成的图像文件中。 - 在通道 2 模块（GFP 信号）上右键单击，选择 显示｜volren。然后在 volren 模块 上左键单击。在属性部分（屏幕左下角）左键点击“编辑”，并选择 volrengreen.col。在通道 1 模块（表皮信号）上右键单击，选择 显示｜volren。然后在 volren 模块 上左键单击。在 属性部分 左键点击 高级，并选择 ddr（一种类似透明X光片的显示方式），然后调整伽马值以观察表皮背景（图 4E）。
- 为生成三维旋转，右键单击项目图像栈模块，选择 动画｜旋转，然后在旋转模块上左键单击。
- 在 属性 部分点击 使用边界框中心。在旋转模块上右键单击，选择 计算｜视频生成器。在 视频生成器 模块上单击鼠标左键。在 属性 部分左键点击 高级（位于属性部分右上角）。
- 在 文件名 字段中填写视频旋转的名称。在 质量 字段中输入 1（最高质量）。若希望旋转时长为 8.3 秒，则将 帧数 保持为 200（可通过增减该数值调节旋转速度）。然后点击 应用（属性部分左下角的绿色按钮）（参见 视频 1）。
- 使用 3D 软件打开 RGB 图像栈（参见 材料表）。在弹出的对话框中，选择模式转换部分中的所有通道，并输入体素大小（像素体积）。
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结果
如图4所示，该方法可实现对成年Drosophila腿部GFP标记的轴突及其终末分支的优异成像。重要的是，可获得干净的GFP信号，且无腿部角质层自身荧光的干扰。角质层的信号可与GFP信号叠加，以确定轴突在腿部的定位（图4E、图1和视频1）。关键在于必须获得固定良好的腿部样本。图5展示了固定良好（图5A）与固定不良（图5B）腿部的示例。在固定良好的样本中，腿部内部结构颜色均匀，可见呈深色的气管。每条腿节中央均有一条主气管（紧邻主神经干），并可见许多较细的分支；而在固定不良的样本中，跗节和胫节内存在深色物质，股节和基节中的气管系统则不清晰。此类情况下，荧光蛋白信号通常会降解，表现为强度极低或完全缺失。其次，...
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讨论
成年果蝇及其他节肢动物的角质层含有大量深色色素，是观察其体内结构的主要障碍。此外，角质层具有强烈的自发荧光，固定后这一现象会更加严重。这两个特性对于观察具有外骨骼动物体内荧光染料或分子的分布极为不利。
我们所描述并常规在实验室中使用的方法，能够获得成年黑腹果蝇（Drosophila）腿部轴突走行及其终末结构清晰而详细的图像。重要的是，该方法可获得干净的GFP信号，完全不受腿部角质层自身荧光的干扰。这一特性对于利用三维成像程序观察和定量分析轴突分支的三维结构至关重要。通过该方法，可对来自多只果蝇腿部的数据进行比较。该技术可轻松适用于其他荧光蛋白信号的观察，并可推广用于成年其他节肢动物中轴突的成像研究。
该实验步骤的两个关键方面是：i）获得强烈的GFP信号，以及ii）对腿部进行适当的固定。对于后者，我们通常能获得良好的固定效果，但仍偶尔会出现个别腿部固定不充分的情况。因此，该步骤尚需改进，或许可通过添加促进试剂渗透的助剂（如二甲基亚砜），或采用其他固定方法（例如微波固定，前提是其能保持GFP荧光），但我们除使用含...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Robert Renard 准备果蝇培养基。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金 NS070644（资助给 R.S.M.）、美国肌萎缩侧索硬化症协会（ALS Association，#256）、法国医学研究基金会（FRM，#AJE20170537445）以及 ATIP-Avenir 计划对 J.E. 的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 无水乙醇 | Fisher | E/6550DF/17 | 分析纯级 |
| 非离子型表面活性剂去垢剂 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100，分子生物学用 |
| 精细镊子 | Sigma-Aldrich | F6521 | 珠宝匠镊子，Dumont No. 5 |
| 玻璃多孔板 | Electron Microscopy Sciences | 71563-01 | 9孔Pyrex板，100 mm × 85 mm |
| PFA | Thermofisher | 28908 | Pierc 16% 甲醛（w/v），无甲醇 |
| 甘油 | Fisher BioReagents | BP 229-1 | 甘油（分子生物学级） |
| 间隔垫片 | Sun Jin Lab Co | IS006 | iSpacer，四孔，每孔工作体积约12 μL，直径7 mm，深度0.18 mm |
| 22 mm × 22 mm 方形盖玻片 | Fisher Scientific | FIS#12-541-B | No.1.5-厚度0.16 至 0.19 mm |
| 封片介质 | Vector Laboratories | H-1000 | Vectashield 抗荧光淬灭封片介质 |
| 共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | LSM780；所用物镜 LD LCI Plan-Apochromat 25X/0.8 Imm Korr DIC M27 (油/ 硅油/甘油/水 浸没) (420852-9871-000) | |
| 成像软件 | Carl Zeiss | ZEN 2011 | |
| 三维图像软件 | ThermoFisher Scientific | Amira 6.4 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | ImageJ/FIJI |
参考文献
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- Enriquez, J., Rio, L. Q., Blazeski, R., Bellemin, S., Godement, P., Mason, C. A., Mann, R. S. Differing Strategies Despite Shared Lineages of Motor Neurons and Glia to Achieve Robust Development of an Adult Neuropil in Drosophila. Neuron. 97 (3), 538-554 (2018).
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