成年斑马鱼的口腔插管：一种评估生物活性化合物肠道吸收的模型

摘要

该方案描述了对成年斑马鱼进行生物制剂插管，随后解剖并制备肠道用于流式细胞术、共聚焦显微镜和定量PCR的方法。该方法可实现生物活性化合物的递送，以监测肠道吸收情况及所引发的局部免疫刺激反应。 适用于测试口服预防药物的肠道动力学。

摘要

大多数病原体通过宿主的黏膜入侵机体。在鱼类中尤其如此，因为它们持续暴露于富含微生物的水环境中。因此，开发有效的口服免疫刺激剂或疫苗递送方法，以激活免疫系统抵抗传染性疾病，具有重要意义。在设计预防性工具时，需要良好的实验模型来评估其效果。本文介绍了一种对成年斑马鱼进行口服插管的方法，以及一系列用于解剖和制备肠道样本以进行流式细胞术、共聚焦显微镜观察和定量聚合酶链式反应（qPCR）分析的操作流程。通过该方案，我们可以简单、快速地向体重约1 g的斑马鱼精确给予最高达50 µL的液体，且不会对动物造成伤害。该方法使我们能够研究荧光标记化合物经插管后由肠黏膜直接在活体（in vivo）条件下的摄取情况，以及这些生物制剂在局部部位的免疫调节能力。结合流式细胞术、组织学、qPCR以及肠道组织的共聚焦显微镜等后续分析手段，我们可以深入了解免疫刺激剂或疫苗如何穿越肠黏膜屏障，穿过黏膜下层，到达肌肉层，并对肠道黏膜免疫系统产生作用。该模型可用于测试候选口服预防制剂、递送系统，或任何经口给予的生物活性物质在局部的作用效果。

引言

本文旨在深入描述一种针对斑马鱼的简便口服插管方法，并介绍相关实用的后续操作流程。利用斑马鱼进行口服插管已成为研究感染性疾病动态、口服疫苗/免疫刺激剂、药物/纳米颗粒吸收与功效以及肠道黏膜免疫的实用模型。例如，斑马鱼口服插管已被应用于以下研究： Mycobacterium marinum 和 Mycobacterium peregrinum 感染¹. Lovmo 等 也成功利用该模型递送纳米颗粒 M. marinum 成年斑马鱼的胃肠道²此外，Chen 等 采用斑马鱼口服插管技术，证明了当以纳米颗粒包载的药物给药时 通过 胃肠道被运输穿过血脑屏障³。这些作者根据 Collymore 描述的灌胃法进行插管。 等⁴ 进行了一些修改。然而，他们并未提供详细描述口腔插管操作的实验方案。本文中，我们介绍了一种基于Collymore的成年斑马鱼口腔插管方法 等⁴ 我们还进一步包括了用于流式细胞术、共聚焦显微镜和qPCR等下游分析的肠道样本制备。

肠道尤其是其黏膜是抵御感染的第一道防线，也是营养物质吸收的主要部位<....

方案

所有涉及斑马鱼（Danio rerio）的实验程序均经巴塞罗那自治大学伦理委员会（CEEH 编号 1582）批准，并符合《涉及动物研究的国际指导原则》（EU 2010/63）。所有活体斑马鱼实验均在 26–28 °C 下进行。

1. 口腔插管设备的准备

1. 将一段长约 1 cm 的细硅胶管套在 31 G 鲁尔锁针头上，以覆盖针尖。
2. 截取一段约 2 cm 长的 10 µL 无菌滤芯吸头，取其较细的一端，套在硅胶管外作为护套。确保吸头部分伸出针头尖端之外，以避免损伤动物。
3. 将针头连接至 100 µL 鲁尔锁注射器。
   注意：每次处理之间务必先用乙醇彻底冲洗，再用磷酸盐缓冲液（PBS，见材料）充分冲洗。

2. 所需溶液

1. 使用斑马鱼饲养水配制浓度为 150 mg/L（用于麻醉）或 300 mg/L（用于安乐死）的氨基甲酸乙酯甲磺酸盐（MS-222）溶液。取 1 L 麻醉液加入小容器中，并持续供气。
2. 另取 1 L 不含 MS-222 的饲养水加入另一小容器中，用于斑马鱼复苏，并持续供气。
3. 用 10x 无菌母液配制 50 mL 的 1x PBS 缓冲液。
4. 用于流式细胞分析或肠道细胞分离时，用胶原酶 IV 型母液或粉末溶....

结果

使用我们自制的口服插管装置，成功对不同性别的斑马鱼（平均体重：1.03 ± 0.16 g）进行了多种重组蛋白纳米颗粒（细菌包涵体）的插管给药（图1）。我们成功完成了口服插管操作，并实现了较低的平均死亡率（6.8%）（表1）。斑马鱼分别接受30 µL或50 µL纳米颗粒悬浮液的插管给药，插管后24小时内计算死亡率。实验由两名操作者完成，其中R在斑马鱼口服插管方面的经验少于J。结果表明，即使新手操作者也能独立完成口服插管实验，并通过本方案轻松实现较高的存活率。根据我们的经验，最佳斑马鱼体重为1 g，但我们已成功对低至0.5 g的个体完成插管。

为了更好地了解荧光纳米颗粒IBs^TNFα（一种以包涵体形式存在的重组细胞因子蛋白纳米结构）是否通过我们的方法递送至斑马鱼体内，并被斑马鱼肠道摄取，我们进行了流式细胞分析。将纳米颗粒（100 µg/鱼，5.......

讨论

本方案是对 Collymore 等人先前描述的经口插管技术的改进et al.⁴。本方案详细描述了经口插管方法，并包括为后续分析准备肠道的步骤。我们的方法提高了操作斑马鱼的速度，使单人能够快速完成整个操作流程，且不同操作者之间的差异较小。本方案与之前方法的一个主要区别在于，我们不仅通过观察动物健康状况（例如，无出血）以及所给予液体是否泄漏来评估经口插管实验的成功与否，还通过后续分析（流式细胞术、共聚焦显微镜和定量 PCR）检测生物活性纳米颗粒在肠道中的摄取情况来加以验证。我们发现，经插管给予的荧光标记纳米颗粒存在于肠道中。

从实际应用角度来看，插管设备成本低廉、精确且可重复使用：基本装置由一个可重复使用的100 µL玻璃（例如，Hamilton）注射器连接一根31 G针头构成，针头顶部带有一段硅胶管。一段剪裁过的无菌吸头套在硅胶管上，每次给药均可更换新的吸头。注射器可重复使用，细针头使得对小型鱼类进行插管的成功率很高。此外，也可将剪裁过的无菌吸头直接套在针头上而不使用硅胶管，从而更便.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硅胶管	Dow Corning	508-001	内径 0.30 mm，外径 0.64 mm
鲁尔锁针头	Hamilton	7750-22	31 G，Kel-F 接头
鲁尔锁注射器	Hamilton	81020/01	100 μL，Kel-F 接头
滤芯式移液器吸头	Nerbe Plus	07-613-8300	10 μL
MS-222	Sigma Aldrich	E10521	粉末
10x PBS	Sigma Aldrich	P5493
滤纸	Filter-Lab	RM14034252
胶原酶	Gibco	17104019
DMEM	Gibco	31966	杜氏改良伊格尔培养基
青霉素和链霉素	Gibco	15240
细胞筛	Falcon	352360
CellTrics 滤膜	Sysmex Partec	04-004-2326 (Wolflabs)	孔径 30 µm 的滤膜，带 2 mL 储液池
组织冷冻包埋剂（O.C.T. 化合物）	SAKURA	4583
冷冻切片用塑料模具	SAKURA	4557	一次性乙烯基模具，25 mm × 20 mm × 5 mm
载玻片	Thermo Scientific	10149870	SuperFrost Plus 载玻片
盖玻片	Labbox	COVN-024-200	24´24 mm
多聚甲醛（PFA）	Sigma-Aldrich	158127
Atto-488 NHS 酯	Sigma-Aldrich	41698
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S5761
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Maxwell RSC simplyRNA 组织试剂盒	Promega	AS1340
1-巯基甘油/匀浆液	Promega	Maxwell RSC simplyRNA 组织试剂盒内含	将 20 μL 1-巯基甘油加入 1 mL 匀浆液中（终浓度 2%）
垂直实验室旋转混合仪	Suministros Grupo Esper	10000-01062
冷冻切片机	Leica	CM3050S
匀浆器	KINEMATICA	Polytron PT1600E
流式细胞仪	Becton Dickinson	FACS Canto
5 mL 圆底管	Falcon	352058
共聚焦显微镜	Leica	SP5
通风橱	Kottermann	2-447 BST
Nanodrop 1000	Thermo Fisher Scientific	ND-1000	分光光度计
Agilent 2100 生物分析系统	Agilent	G2939A	RNA 生物分析仪
Maxwell 仪器	Promega	AS4500
iScript cDNA 合成试剂盒	Bio-rad	1708891
CFX384 实时荧光定量 PCR 检测系统	Bio-Rad	1855485
iTaq 通用 SYBR Green Supermix 试剂盒	Bio-rad	172-5120
水	Sigma-Aldrich	W4502
冻存管	Thermo Fisher Scientific	375418	CryoTube 冻存管
封片剂	Sigma-Aldrich	F6057	含 DAPI 的 Fluoroshield 封片剂