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方法文章

成年斑马鱼的口腔插管：一种评估生物活性化合物肠道吸收的模型

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DOI：

10.3791/58366

⸱

2018年9月27日

 ,  , 
1Institute of Biotechnology and Biomedicine (IBB-UAB), Universitat Autònoma de Barcelona, 2Department of Cell Biology, Animal Physiology and Immunology, Universitat Autònoma de Barcelona

本文内容

摘要

该方案描述了对成年斑马鱼进行生物制剂插管，随后解剖并制备肠道用于流式细胞术、共聚焦显微镜和定量PCR的方法。该方法可实现生物活性化合物的递送，以监测肠道吸收情况及所引发的局部免疫刺激反应。 适用于测试口服预防药物的肠道动力学。

摘要

大多数病原体通过宿主的黏膜入侵机体。在鱼类中尤其如此，因为它们持续暴露于富含微生物的水环境中。因此，开发有效的口服免疫刺激剂或疫苗递送方法，以激活免疫系统抵抗传染性疾病，具有重要意义。在设计预防性工具时，需要良好的实验模型来评估其效果。本文介绍了一种对成年斑马鱼进行口服插管的方法，以及一系列用于解剖和制备肠道样本以进行流式细胞术、共聚焦显微镜观察和定量聚合酶链式反应（qPCR）分析的操作流程。通过该方案，我们可以简单、快速地向体重约1 g的斑马鱼精确给予最高达50 µL的液体，且不会对动物造成伤害。该方法使我们能够研究荧光标记化合物经插管后由肠黏膜直接在活体（in vivo）条件下的摄取情况，以及这些生物制剂在局部部位的免疫调节能力。结合流式细胞术、组织学、qPCR以及肠道组织的共聚焦显微镜等后续分析手段，我们可以深入了解免疫刺激剂或疫苗如何穿越肠黏膜屏障，穿过黏膜下层，到达肌肉层，并对肠道黏膜免疫系统产生作用。该模型可用于测试候选口服预防制剂、递送系统，或任何经口给予的生物活性物质在局部的作用效果。

引言

本文旨在深入描述一种针对斑马鱼的简便口服插管方法，并介绍相关实用的后续操作流程。利用斑马鱼进行口服插管已成为研究感染性疾病动态、口服疫苗/免疫刺激剂、药物/纳米颗粒吸收与功效以及肠道黏膜免疫的实用模型。例如，斑马鱼口服插管已被应用于以下研究： Mycobacterium marinum 和 Mycobacterium peregrinum 感染1. Lovmo 等 也成功利用该模型递送纳米颗粒 M. marinum 成年斑马鱼的胃肠道2此外，Chen 等 采用斑马鱼口服插管技术，证明了当以纳米颗粒包载的药物给药时 通过 胃肠道被运输穿过血脑屏障3。这些作者根据 Collymore 描述的灌胃法进行插管。 等4 进行了一些修改。然而，他们并未提供详细描述口腔插管操作的实验方案。本文中，我们介绍了一种基于Collymore的成年斑马鱼口腔插管方法 等4 我们还进一步包括了用于流式细胞术、共聚焦显微镜和qPCR等下游分析的肠道样本制备。

肠道尤其是其黏膜是抵御感染的第一道防线，也是营养物质吸收的主要部位5。当黏膜屏障内的上皮细胞和抗原呈递细胞感知到危险信号时，会立即触发先天免疫反应。随后，T细胞和B淋巴细胞建立起高度特异性的适应性免疫反应6,7。口服疫苗的研发目前是疫苗学领域的一个重点方向。由于黏膜相关淋巴组织（MALT）中的免疫细胞具有特异性反应能力，这类疫苗可有效保护机体暴露部位8,9。在水产养殖中，与注射疫苗相比，黏膜疫苗具有明显优势：适用于大规模免疫接种、所需人力较少、对鱼类造成的应激更小，并且可用于幼鱼接种。然而，黏膜疫苗候选物必须在口服环境中不被降解，并成功到达肠道的第二段。此外，它们还必须穿过黏膜屏障，进入抗原呈递细胞（APCs），以诱导局部和/或全身性免疫反应10。因此，在口服疫苗的开发过程中，评估候选口服抗原及其递送系统在黏膜部位的摄取情况以及所引发的免疫反应至关重要。

在生物医学领域，建立一种用于检测化合物经口插管后生物学效应的模型正受到越来越多的关注。哺乳动物与硬骨鱼类在多个解剖学和生理学特征上具有保守性，这些特征在两侧对称动物谱系之间得以保留11。该口服插管模型结合后续分析手段，不仅可作为研究人类生物学机制的工具，也可作为生物制剂或其他化合物在活体（in vivo）条件下进行测试的平台。

经口插管操作可由一名操作者完成， 例如成功给予最多50 µL的蛋白质纳米颗粒悬液 适用于体重为1 g的鱼类，且具有高存活率。该操作设置简单、快速，1小时内可完成30条鱼的插管。肠道制备方案是获取高质量细胞和组织样本以进行后续分析的关键。文中提供了下游应用结果示例，显示该方案在获取肠道吸收相关数据以及分离高质量RNA用于qPCR方面的有效性。该方案对于需要合适模型来研究口服预防药物或其他化合物在肠道内动态过程的研究人员具有重要应用价值。

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方案

所有涉及斑马鱼（Danio rerio）的实验程序均经巴塞罗那自治大学伦理委员会（CEEH 编号 1582）批准，并符合《涉及动物研究的国际指导原则》（EU 2010/63）。所有活体斑马鱼实验均在 26–28 °C 下进行。

1. 口腔插管设备的准备

  1. 将一段长约 1 cm 的细硅胶管套在 31 G 鲁尔锁针头上，以覆盖针尖。
  2. 截取一段约 2 cm 长的 10 µL 无菌滤芯吸头，取其较细的一端，套在硅胶管外作为护套。确保吸头部分伸出针头尖端之外，以避免损伤动物。
  3. 将针头连接至 100 µL 鲁尔锁注射器。
    注意：每次处理之间务必先用乙醇彻底冲洗，再用磷酸盐缓冲液（PBS，见材料）充分冲洗。

2. 所需溶液

  1. 使用斑马鱼饲养水配制浓度为 150 mg/L（用于麻醉）或 300 mg/L（用于安乐死）的氨基甲酸乙酯甲磺酸盐（MS-222）溶液。取 1 L 麻醉液加入小容器中，并持续供气。
  2. 另取 1 L 不含 MS-222 的饲养水加入另一小容器中，用于斑马鱼复苏，并持续供气。
  3. 用 10x 无菌母液配制 50 mL 的 1x PBS 缓冲液。
  4. 用于流式细胞分析或肠道细胞分离时，用胶原酶 IV 型母液或粉末溶于含 1% v/v 青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，新鲜配制足够量的 0.15% 胶原酶 IV 型溶液（每尾鱼 1 mL）。将溶液分装至 2 mL 离心管中（每管 1 mL，对应一尾鱼），4 °C 保存，于解剖前 30 分钟取出。
  5. 用于共聚焦显微镜观察或样品固定时，在通风橱中用 PBS 新鲜配制 50 mL 的 4% 多聚甲醛（PFA）溶液，或从 -20 °C 冰箱中取出储备液解冻。
    注意：PFA 具有毒性。使用前请阅读材料安全数据表。操作时应佩戴手套和护目镜，并始终在通风橱内进行。

3. 准备荧光纳米颗粒悬浮液

  1. 根据制造商说明书，使用 Atto-488 NHS 酯（见材料表）或其他合适的荧光染料标记蛋白质纳米颗粒。
  2. 将纳米颗粒重悬于 0.1 M 碳酸氢钠缓冲液中，浓度为 2 mg/mL。
  3. 将 Atto 488 NHS 酯溶解于无胺的二甲基亚砜（DMSO）中，浓度为 2 mg/mL。保留 10 µL 等分试样用于检测标记效率（步骤 3.7–3.8）。
  4. 将纳米颗粒与 Atto 488 NHS 酯按 1:2（蛋白质:染料）的摩尔比混合，在避光条件下搅拌反应。
  5. 在室温下以 8,000 × g 离心 10 分钟，沉淀标记后的纳米颗粒，弃去上清液并保留用于检测标记效率（步骤 3.7–3.8）。
  6. 通过涡旋并反复吹打，将沉淀重悬于 1 mL 0.1 M 碳酸氢钠缓冲液中进行洗涤；随后在室温下以 8,000 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。重复此步骤 3.6 共 5 次。
  7. 将沉淀重悬于 15 mL 离心管中的 5 mL 0.1 M 碳酸氢钠缓冲液中，并将荧光纳米颗粒分装至 1.5 mL 离心管中（共 30 份）。在室温下以 8,000 × g 离心 10 分钟，弃去上清液后避光保存于 -80 °C。
  8. 使用微量分光光度计测定标记效率。
    1. 取步骤 3.3 中保留的原始 Atto 488 溶液 1 µL，用 DMSO 进一步稀释（例如，按体积比 1:20 稀释）。该稀释液用于计算步骤 3.4 中蛋白质纳米颗粒与 Atto 488 混合物的摩尔比。
    2. 取步骤 3.5 中标记反应后保留的上清液 1 µL，测定其在 501 nm 处的吸光度（abs）。标记百分比计算公式为：
      (分光光度实验中计算吸光度百分比的公式。
  9. 实验前，使用 1× PBS 溶液将纳米颗粒悬液配制至所需浓度。

4. 斑马鱼麻醉与经口插管

  1. 快速处理鱼类>0.5 g）至少在实验前48小时喂食，以排空肠道。
  2. 将鱼（12条）转移至实验用鱼缸（6 L）中，实验前一晚进行，以使其适应环境12.
  3. 充分涡旋混匀纳米颗粒溶液（例如， 2,500 rpm 和 30 s）并吸取所需体积的纳米颗粒悬浮液（例如， 20–50 µL) 注入连接保护针头的注射器中。
  4. 将鱼放入充气的150 mg/L MS-222溶液（见第2节）中，直至其沉入水箱底部且对尾鳍夹捏无反应；此过程耗时少于5分钟。
  5. 用网将麻醉后的鱼迅速转移到湿润的塑料托盘中，使鱼体呈水平方向并对准针头，立即开始口腔插管。
  6. 用一只手小心托住鱼体，另一只手使用受保护的针头轻轻张开鱼口。将针头沿食道轻柔插入，至距口部开口约1 cm处。
    注意：当移液器吸头末端通过鳃部时，操作者可能会感到轻微阻力。需注意不要过度倾斜进针角度，以免刺穿鳃部。
  7. 缓慢将纳米颗粒悬浮液注入鱼体内，确保悬浮液不会从鳃或口中流出。
  8. 轻轻取出针头，将鱼放入恢复缸中（参见第2节）。恢复通常在1分钟内完成。
  9. 仔细检查鱼类是否存在任何异常例如，鳃部出血是穿孔的征象）。
  10. 待鱼恢复后，将其放回实验鱼缸。

5. 斑马鱼肠道解剖

  1. 插管后经过一段特定时间例如， 5 小时和/或 24 小时后），用网将鱼放入含有 300 mg/L MS-222 的溶液中实施安乐死（见第 2 节）。确保鳃盖停止运动且无尾部夹捏反射。通常 5 分钟即已足够。
  2. 用网捞起已处死的动物，并将其置于滤纸上。
    注意：滤纸在去除肠道周围的黏连组织时非常有用。
  3. 使用解剖剪从肛门向鳃盖处做一弧形切口，用精细镊子将切口打开。剪断肠道两端，取出所有内脏器官，并将其置于滤纸上。
    注意：操作需迅速，以减少细胞代谢和死亡。
    注意：也可在 PBS 中并置于冰上去除粘连组织。
  4. 将肠道与内脏器官分离，注意保持其方向性（前段至后段肠段），并将其拉直。通常，肠道的前段比后段更宽。解剖时需注意获取完整的肠道。
    注意：在小型鱼类中，后端非常细且脆弱，容易折断，尤其是在动物个体中 <0.7 g
  5. 用镊子将肠道在滤纸上滚动，以剥离附着在肠道上的黏连组织。
  6. 继续准备肠道组织，用于后续各项分析（第6、7和8节）。

6. 准备用于流式细胞术的肠道细胞

  1. 提前准备好0.15%胶原酶溶液的分装 aliquot（参见第2.4节）。
    注意：操作前， aliquots 应置于室温。
  2. 可选：从步骤 5.5 继续，纵向切开肠道，并用 1x PBS 清洗。
  3. 用镊子将肠道放入装有0.15%胶原酶溶液的2 mL离心管中。
  4. 将试管置于垂直的实验室旋转仪上，室温避光旋转孵育1小时。
  5. 将肠道置于 100 µm 将细胞筛置于50 mL离心管上。用5 mL注射器活塞捣碎肠道，用1×PBS洗涤3次，收集流穿样品至50 mL离心管中。
  6. 将50 mL离心管在400 x g 10 分钟，于 4 °C.
  7. 小心吸出大部分上清液，避免丢失细胞，其中部分细胞可能与黏液黏附。
  8. 重悬离心管底部的肠细胞 500 µL 加入1×PBS，置于冰上直至进行细胞分析
  9. 通过滤器过滤样品 30 µm 将细胞滤液转移至5 mL圆底管中用于流式细胞术。
  10. 设置参数（例如， 分析所用细胞数量、感兴趣区域、电压与补偿以及检测器选择等参数设置（参见材料部分）。
  11. 立即使用流式细胞仪分析细胞，操作步骤请参照使用说明书13.

7. 为共聚焦显微镜制备肠道冷冻切片

  1. 用塑料模具（参见 材料表）盛装最佳切割温度（O.C.T.）包埋剂至半满。
  2. 从步骤5.5继续，在解剖完成后立即小心地将肠道放入塑料模具中。确保肠道完全被O.C.T. 包埋剂包裹。如有必要，可向塑料模具中添加更多O.C.T. 包埋剂。
    注意：建议将肠道以“Z”字形置于O.C.T. 包埋剂中，以便于追踪其自然走向。
  3. 将塑料模具置于干冰上，直至其变浑浊（少于1分钟）。
  4. 将塑料模具于-80 °C长期保存，或立即按以下步骤进行处理。
    注意：本方案可在此处暂停。
  5. 使用-20 °C的恒冷切片机将冷冻的肠道切成10 µm厚的切片或适当厚度。
  6. 用细毛刷将肠道切片转移至载玻片上。
  7. 将载玻片浸入4% PFA中，在室温下固定15分钟。
    注意：PFA具有毒性。使用前请仔细阅读材料安全数据表。操作时应佩戴手套和护目镜，并始终在通风橱内进行。
  8. 用1× PBS洗涤载玻片3次，每次10分钟。
  9. 滴加一滴封片剂，并将盖玻片覆盖于样本上。
    注意：本方案可在此处暂停。
  10. 在共聚焦显微镜下以适当的放大倍数观察样本。

8. 实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）用肠道样本的制备

  1. 从步骤5.5继续，将肠道放入冻存管中，迅速在液氮中冷冻，并于-80 °C保存备用。
    注意：本实验方案可在此处暂停。
  2. 进行匀浆时，在肠道样本中加入200 µL 2%（v/v）预冷的1-硫代甘油/匀浆液（见材料表）或其他合适的匀浆溶液。
  3. 操作需迅速，在冰上使用实验室匀浆器以高速（设定为25–30,000 rpm）匀浆肠道样本，直至无可见组织碎片残留。通常每次5秒，重复3次即可。
  4. 按照制造商说明书14或合适的替代方法，使用商品化试剂盒（见材料表）提取RNA。如需长期保存，可将RNA在-80 °C储存。
    注意：本实验方案可在此处暂停。
  5. 使用分光光度计15测定RNA浓度，并使用RNA分析仪16评估RNA质量。
  6. 根据制造商说明书，使用cDNA合成试剂盒制备1 µg或适量的cDNA。
    注意：本实验方案可在此处暂停。进行qPCR分析时，请遵循MIQE指南17。
  7. 针对目标基因设计合适的引物对。
  8. 选择合适的内参基因，使用商品化试剂盒（见材料）通过RT-qPCR检测系统分析各基因的表达水平。
    注意：例如，每孔qPCR板中加入5 µL SYBR Green预混液、0.5 µM引物、2.5 µL稀释后的cDNA和1.5 µL水，最终体积为10 µL。

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结果

使用我们自制的口服插管装置，成功对不同性别的斑马鱼（平均体重：1.03 ± 0.16 g）进行了多种重组蛋白纳米颗粒（细菌包涵体）的插管给药（图1）。我们成功完成了口服插管操作，并实现了较低的平均死亡率（6.8%）（表1）。斑马鱼分别接受30 µL或50 µL纳米颗粒悬浮液的插管给药，插管后24小时内计算死亡率。实验由两名操作者完成，其中R在斑马鱼口服插管方面的经验少于J。结果表明，即使新手操作者也能独立完成口服插管实验，并通过本方案轻松实现较高的存活率。根据我们的经验，最佳斑马鱼体重为1 g，但我们已成功对低至0.5 g的个体完成插管。

为了更好地了解荧光纳米颗粒IBsTNFα（一种以包涵体形式存在的重组细胞因子蛋白纳米结构）是否通过我们的方法递送至斑马鱼体内，并被斑马鱼肠道摄取，我们进行了流式细胞分析。将纳米颗粒（100 µg/鱼，5...

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讨论

本方案是对 Collymore 等人先前描述的经口插管技术的改进et al.4。本方案详细描述了经口插管方法，并包括为后续分析准备肠道的步骤。我们的方法提高了操作斑马鱼的速度，使单人能够快速完成整个操作流程，且不同操作者之间的差异较小。本方案与之前方法的一个主要区别在于，我们不仅通过观察动物健康状况（例如，无出血）以及所给予液体是否泄漏来评估经口插管实验的成功与否，还通过后续分析（流式细胞术、共聚焦显微镜和定量 PCR）检测生物活性纳米颗粒在肠道中的摄取情况来加以验证。我们发现，经插管给予的荧光标记纳米颗粒存在于肠道中。

从实际应用角度来看，插管设备成本低廉、精确且可重复使用：基本装置由一个可重复使用的100 µL玻璃（例如，Hamilton）注射器连接一根31 G针头构成，针头顶部带有一段硅胶管。一段剪裁过的无菌吸头套在硅胶管上，每次给药均可更换新的吸头。注射器可重复使用，细针头使得对小型鱼类进行插管的成功率很高。此外，也可将剪裁过的无菌吸头直接套在针头上而不使用硅胶管，从而更便...

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披露

作者声明不存在任何竞争利益。

致谢

本工作获得了西班牙科学部、欧洲委员会以及AGAUR基金对NR的资助（AGL2015-65129-R MINECO/FEDER和2014SGR-345 AGAUR）。RT获得了AGAUR（西班牙）的博士前奖学金，JJ获得了中国国家留学基金管理委员会（中国）的博士生奖学金，NR获得了西班牙科学与创新部（MINECO）的拉蒙·卡哈尔计划（RYC-2010-06210，2010年）支持。我们感谢Torrealba博士在蛋白质表达方面的专业指导，感谢巴塞罗那自治大学“显微技术服务中心”的N. Barba以及“流式细胞术服务中心”的M. Costa博士提供的有益技术协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
硅胶管Dow Corning508-001内径 0.30 mm，外径 0.64 mm
鲁尔锁针头Hamilton7750-2231 G，Kel-F 接头
鲁尔锁注射器Hamilton81020/01100 μL，Kel-F 接头
滤芯式移液器吸头Nerbe Plus07-613-830010 μL
MS-222Sigma AldrichE10521粉末
10x PBSSigma AldrichP5493
滤纸 Filter-LabRM14034252
胶原酶Gibco17104019
DMEM Gibco31966杜氏改良伊格尔培养基
青霉素和链霉素Gibco15240
细胞筛Falcon352360
CellTrics 滤膜 Sysmex Partec04-004-2326 (Wolflabs)孔径 30 µm 的滤膜，带 2 mL 储液池
组织冷冻包埋剂（O.C.T. 化合物）SAKURA4583
冷冻切片用塑料模具SAKURA4557一次性乙烯基模具，25 mm × 20 mm × 5 mm
载玻片Thermo Scientific10149870SuperFrost Plus 载玻片
盖玻片Labbox COVN-024-20024´24 mm
多聚甲醛（PFA）Sigma-Aldrich158127
Atto-488 NHS 酯Sigma-Aldrich41698
碳酸氢钠Sigma-AldrichS5761
DMSOSigma-AldrichD8418
Maxwell RSC simplyRNA 组织试剂盒PromegaAS1340
1-巯基甘油/匀浆液PromegaMaxwell RSC simplyRNA 组织试剂盒内含将 20 μL 1-巯基甘油加入 1 mL 匀浆液中（终浓度 2%）
垂直实验室旋转混合仪 Suministros Grupo Esper10000-01062
冷冻切片机Leica CM3050S
匀浆器KINEMATICAPolytron PT1600E
流式细胞仪 Becton DickinsonFACS Canto
5 mL 圆底管Falcon352058
共聚焦显微镜LeicaSP5
通风橱Kottermann2-447 BST
Nanodrop 1000Thermo Fisher ScientificND-1000分光光度计
Agilent 2100 生物分析系统AgilentG2939ARNA 生物分析仪
Maxwell 仪器PromegaAS4500 
iScript cDNA 合成试剂盒 Bio-rad1708891
CFX384 实时荧光定量 PCR 检测系统 Bio-Rad1855485
iTaq 通用 SYBR Green Supermix 试剂盒Bio-rad172-5120
水 Sigma-AldrichW4502
冻存管 Thermo Fisher Scientific375418CryoTube 冻存管
封片剂Sigma-AldrichF6057含 DAPI 的 Fluoroshield 封片剂

参考文献

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