用于检测中性粒细胞介导的炎症事件的 MUB40 肽

摘要

本文介绍了一种检测固定和通透处理的组织切片中中性粒细胞存在情况，以及评估活体纯化中性粒细胞活化状态的实验方案。其中，MUB₄₀ 肽可结合存在于中性粒细胞特异性颗粒和三级颗粒中的乳铁蛋白。通过通透处理或中性粒细胞活化暴露颗粒内容物，即可实现对中性粒细胞的标记。

摘要

此处，我们提供一种涉及使用 MUB 的实验方案₄₀，一种合成肽，能够结合中性粒细胞特异性颗粒和三级颗粒中高浓度储存的糖基化乳铁蛋白。本方案详细介绍了MUB₄₀ 直接与荧光染料偶联的抗体可用于固定和通透组织中中性粒细胞的染色，也可用于活细胞成像以检测中性粒细胞的活化和脱颗粒。目前中性粒细胞的检测方法主要依赖于物种特异性的单克隆抗体，而这些抗体并不总是适用于所有实验应用。MUB₄₀ 不能穿透细胞膜，因此无法进入未活化/未透化的中性粒细胞内与乳铁蛋白接触。MUB₄₀ 具有识别多种宿主来源乳铁蛋白的优势，因此在涉及多种研究模型的实验中特别有用，可减少重复试剂的使用数量，并通过一步染色法简化实验流程。

引言

中性粒细胞是先天免疫系统的主要组成部分之一，通常被募集到全身各处的炎症部位。中性粒细胞的研究在很大程度上受到其短暂寿命的限制 体外 （少于8小时），且在基础状态或激活后受限于检测工具。本文提供了一种经过充分验证的方案，用于在固定/通透样本中广泛且特异性地检测哺乳动物中性粒细胞。同时，我们还提供了使用MUB对活中性粒细胞进行染色的详细方案₄₀利用活体中性粒细胞染色方案，可精确定位中性粒细胞活化的时间与位置。该方案适用于希望研究中性粒细胞活化或颗粒释放的研究人员。除抗菌功能外，中性粒细胞现已被认为是参与多种疾病及免疫应答（包括固有免疫和适应性免疫）的免疫调节细胞。^1,2中性粒细胞存在于大多数炎症组织中，在感染组织中数量较多，也见于炎性肿瘤³，肠易激综合征和克罗恩病发作期间⁴以及在非感染性炎症区域，如类风湿关节炎（RA）患者的滑膜组织⁵中性粒细胞含有四类预先形成的颗粒，分别为嗜天青颗粒（α）、特异性颗粒（β1）、三级颗粒（β2）和分泌小泡（γ）。⁶迁移至炎症部位后，募集的中性粒细胞被激活，并依次分泌颗粒内容物（包含黏附分子、抗菌化合物及免疫调节分子），从而促进进一步的细胞募集，并有助于感染的清除（但也可能导致宿主组织损伤）。⁷尽管中性粒细胞被认为是先天免疫的关键组成部分，但迄今为止可用于研究中性粒细胞的检测试剂很少，能够用于评估活体中性粒细胞活化状态的试剂则更少。

目前检测中性粒细胞的方法依赖于针对细胞表面暴露抗原（如 Ly-6G）产生的单克隆抗体² 或在基础条件下特异性储存于中性粒细胞颗粒中的蛋白质（例如， 髓过氧化物酶，乳铁蛋白）。单克隆抗体的优点包括在不同检测条件下具有强结合力、高灵敏度和良好的通用性。然而，使用单克隆抗体特别是抗Ly-6G抗体也存在若干缺点。这些缺点主要在于其特异性，因为Ly-6G存在于骨髓中大多数髓系细胞以及所有粒细胞（包括嗜酸性粒细胞）表面；因此，仅依靠该标志物区分中性粒细胞与嗜酸性粒细胞需要更复杂的分析方法⁸单克隆抗体的另一个常见权衡问题是其宿主特异性范围通常较窄，导致难以在多个动物物种之间进行比较研究。抗体检测方法的第三个缺点是在使用活细胞时尤为明显，特别是当使用活细胞或 体内 是它们可能破坏细胞功能或导致细胞活化。例如，在小鼠中给予抗 Ly-6G 抗体常用于中性粒细胞耗竭和短暂性中性粒细胞减少症⁹此外，已有研究表明，抗体注射可刺激中性粒细胞的抗肿瘤功能¹⁰最后，抗体检测中性粒细胞无法揭示细胞的活化状态。

我们已鉴定出一种名为MUB的40个氨基酸肽₄₀，可在多种检测中用于标记中性粒细胞 体外 或 体内 条件以及检测活中性粒细胞的活化状态¹¹. MUB₄₀ 源自 MUB₇₀¹²，一个结构域的 Lactobacillus reuteri 最初因其结合黏液的能力而被描述的表面黏液结合蛋白^13,14. MUB₄₀ 与存在于中性粒细胞特异性颗粒和三级颗粒中高浓度的糖基化乳铁蛋白相互作用。MUB₄₀ 可通过组织病理学或荧光激活细胞分选（FACS）方案中标准的透化步骤，使细胞暴露于这些颗粒，从而实现对固定中性粒细胞的强效染色。当活的中性粒细胞保持在非活化状态时，MUB₄₀ 肽被排除在颗粒内容物之外，细胞对标志物染色呈阴性。激活后，MUB₄₀ 可与暴露的乳铁蛋白结合，从而实现该肽的强效染色。因此，MUB₄₀ 可用于确定纯化中性粒细胞的活化状态，使其成为追踪感染过程的理想标志物。MUB 还能够与活化的中性粒细胞结合，₄₀ 用于在活体动物模型中检测中性粒细胞炎症区域的工具（例如， 小鼠关节炎模型¹⁵）。本文所述方案详细介绍了如何使用荧光标记的 MUB₄₀ 可用于揭示组织学样本中的中性粒细胞，以及检测活体纯化中性粒细胞的活化状态 体外.

方案

本文所述所有方法均已通过法国机构CoRC（临床研究委员会）、CPP（人体保护委员会）和CNIL（国家信息与自由委员会）的审查与批准。

1. 使用荧光标记的 MUB₄₀ 对组织病理学组织中的中性粒细胞进行染色

1. 为进行组织病理学分析，根据样本厚度，将组织/活检样本置于适量的4%多聚甲醛（PFA）中固定30分钟至4小时。固定期间将样本置于4 °C冰箱中。
   注意：可根据使用者的具体需求替换其他固定方法或固定时间。
   1. 去除PFA，加入足量16%蔗糖溶液以完全覆盖样本，并将样本置于4 °C环境中4小时至过夜。
   2. 去除16%蔗糖溶液，加入足量30%蔗糖溶液以完全覆盖样本，并将样本置于4 °C环境中4小时至过夜。
   3. 去除30%蔗糖溶液，用纸巾轻轻吸去组织表面多余的溶液。将组织切片置于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并在干冰-乙醇浴（-72 °C）冷却的2-甲基丁烷中速冻。待组织完全冻结（约2分钟后），将样本块从2-甲基丁烷中取出，并置于干冰上，直至所有样本块处理完毕并准备进行长期保存。将冷冻的样本块于-80 °C长期保存。
2. 在切片前一晚，将组织块从-80 °C冰箱中取出，转移至-20 °C环境中过夜，以达到温度平衡。
   1. 使用冷冻切片机将OCT包埋的组织切成10至30 μm厚的切片，并将其吸附至高质量载玻片上。
      注意：可根据实验需求使用更厚或更薄的切片。
   2. 使用蜡笔或其他疏水性标记方法，在载玻片上的组织切片周围画出方框，并使其自然干燥。
   3. 通过将MUB₄₀-Cy5（或其他荧光标记的MUB₄₀版本，1 mg/mL储存液）以1:1,000比例稀释于0.1%皂苷-PBS溶液中，配制染色液。MUB₄₀的最适终浓度应为1 μg/mL。
      注意：可使用较低的终浓度（0.1–0.01 μg/mL），但可能导致信号强度降低。
      警告：皂苷粉末可能引起呼吸道刺激。务必在通风柜或受保护区域中称量皂苷。也可使用其他通透化方法，如Triton。根据制造商推荐浓度加入其他标记物（例如，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、鬼笔环肽、荧光抗体）。
   4. 将载玻片轻轻浸入0.1%皂苷-PBS溶液中3次。
   5. 小心吸去组织切片周围的多余液体，加入足量染色液以完全覆盖组织切片。将载玻片放入湿盒中以防止蒸发，在室温下避光孵育1小时。
   6. 将载玻片轻轻浸入0.1%皂苷-PBS溶液中3次，随后轻轻浸入PBS溶液中3次，最后轻轻浸入蒸馏H₂O中3次。小心吸去载玻片表面多余液体。
   7. 在组织切片旁加入少量封片剂（约20 μL，含20 mM Tris pH 8.0、0.5%没食子酸丙酯、90%甘油），然后将盖玻片轻轻覆盖在载玻片上。均匀轻压盖玻片使其贴合组织切片，并用纸巾小心吸去从盖玻片边缘溢出的封片剂。
   8. 将封片后的载玻片置于暗柜中24小时，使封片剂充分固化。也可将载玻片置于37 °C环境中1小时以加速固化。
3. 根据所需的成像方法，在荧光显微镜下对组织切片进行成像。

2. 使用逆向-反向-MUB₄₀-Cy5 肽可视化中性粒细胞活化

1. 采用以下方案获取人中性粒细胞。配制以下溶液，并于厌氧柜中放置过夜。暴露于氧气会启动中性粒细胞的活化，并进一步诱导细胞死亡^16,17.
   注意：中性粒细胞也可采用其他方法进行纯化 "在实验台上" 用于MUB₄₀标记实验；但需注意，氧气暴露将开始影响中性粒细胞的活化。
   1. 配制以下溶液：
      溶液1 [氯化钠（NaCl）0.9%]：将4.5 g NaCl加入500 mL H₂O中₂O. 过滤溶液。
      溶液2（6%右旋糖酐）：将6 g右旋糖酐加入0.9%氯化钠溶液中，定容至100 mL。
      溶液3（洗涤缓冲液）：将乙二胺四乙酸（EDTA）溶于pH 7.2的PBS中，使EDTA终浓度为2 mM。使用前立即将牛血清白蛋白（BSA）溶于PBS/EDTA溶液中，使BSA终浓度为10% w/v。
   2. 以650 × g离心血液采集管20分钟，期间不刹车。
   3. 在不扰动已分离血液的前提下，将采血管转移至厌氧柜中，并收集血浆组分（上层）至50 mL离心管中。
   4. 从厌氧柜中取出含有血浆的试管，于2,900 x g离心20分钟，期间开启刹车以沉淀血小板。
   5. 在不扰动已离心沉淀的血小板的前提下，轻柔地将血浆管重新转移至厌氧柜中，并用移液器将乏血小板血浆转移至一支新的50 mL离心管中（以下简称 "血浆").
2. 红细胞与白细胞的分离
   1. 使用步骤 2.1.3 中含有红细胞（RBCs）的试管，将 RBCs 合并至一个 50 mL 锥形管中（每 50 mL 管加入 5 支采血管内容物）。
   2. 加入0.9%氯化钠溶液至终体积为44 mL。最后加入6 mL 6%右旋糖酐。
   3. 轻轻翻转试管10–20次，使血液与葡聚糖混合物充分混匀。将试管静置沉降至少30分钟。
   4. 在沉降进行的同时，通过在15 mL锥形管中加入4.2 mL Percoll溶液和5.8 mL血浆制备Percoll梯度，并通过倒置管子充分混匀。
   5. 收集葡聚糖上层液，注意避免吸出红细胞。
   6. 拧紧螺旋盖，将葡聚糖管从厌氧室中取出，并以300 × g离心10分钟，期间使用刹车。
   7. 将离心管小心放回厌氧室中，避免扰动已沉淀的细胞，然后用移液器吸除上清液。
   8. 轻轻将细胞沉淀重悬于1 mL血浆中，并缓慢地加至Percoll溶液的上层。用移液管将细胞加至顶部时，注意避免引起各层之间的混合。
   9. 小心地将Percoll溶液管从厌氧室中取出（避免混匀），在800 × g下离心20分钟，不进行减速。外周血单个核细胞（PBMCs）将保留在Percoll溶液表面，而中性粒细胞将与红细胞一同形成沉淀。
3. 去除污染的红细胞
   1. 将700 μL PBS + 10% BSA加入14 mL洗涤缓冲液中，配制14 mL洗涤缓冲液溶液。
   2. 将Percoll溶液管重新放回厌氧室中。用移液器吸除Percoll和PBMCs，并将沉淀的细胞用1 mL洗涤缓冲液重新悬浮。由于红细胞污染，待重悬的细胞沉淀呈红色。
   3. 加入200 μL抗CD235a（血型糖蛋白）磁珠至重悬细胞中，轻轻混匀，孵育至少15分钟。此步骤使磁珠结合污染的红细胞，以便后续去除。
   4. 用2 mL洗涤缓冲液洗涤分离柱，重复3次。
   5. 用移液器将中性粒细胞/红细胞混合液缓慢加至分离柱顶部，同时在分离柱下方持有一个15 mL离心管以收集流出的细胞。收集流穿液时，液体应呈浑浊状，并因红细胞仍结合在柱上而逐渐失去红色。
   6. 向柱顶加入2 mL洗涤缓冲液，并收集到同一个15 mL离心管中。当2 mL洗涤液流尽时，流出液应变得澄清，表明所有中性粒细胞已被收集完毕。
   7. 轻轻混匀试管，确保中性粒细胞均匀分布，取10 μL用于细胞计数。记录细胞计数时的最终体积。采用任何标准细胞计数方法对细胞总数进行计数。
   8. 从厌氧室中取出中性粒细胞管，在300 × g条件下离心20分钟，离心时使用刹车。
   9. 将沉淀的中性粒细胞重新放回厌氧室，用移液管吸除洗涤缓冲液。用血浆重悬中性粒细胞沉淀，细胞密度最高为10⁷ PMN/mL
4. 纯化中性粒细胞的计数及使用MUB进行可视化₄₀
   1. 加入1 μL RI-MUB₄₀- 将Cy5（1 mg/mL）加入1 mL无酚红的RPMI 1640培养基中，用移液器充分混匀。
   2. 为本实验方案的目的，结果已根据添加强效中性粒细胞激活试剂N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（FMLP）的情况进行描述。向RPMI/RI-MUB中加入1 μm的FMLP。₄₀-Cy5 管，通过上下吹打混匀。
      注意：从这一点开始，每项实验方案将根据所要解决的科学问题而有所不同。
   3. 转移1 mL RPMI/RI-MUB₄₀-将Cy5/FMLP混合物加入玻璃底显微镜培养皿中。向该培养皿中加入相当于10的纯化细胞体积⁶ 总中性粒细胞。轻轻吹打混匀。
   4. 将培养皿放入倒置荧光显微镜中并开始图像采集。例如，建议在加入中性粒细胞激活试剂（如FMLP或细菌）之前，先采集基线图像。在此示例中，开始采集RPMI/RI-MUB的图像₄₀-Cy5/中性粒细胞，并在稍后时间点，用移液器将中性粒细胞激活试剂加入玻璃培养皿中，继续进行图像采集。
      注意：可根据科学需求对这些步骤进行修改。
   5. 根据所用显微镜的特性处理获取的图像或延时电影。

结果

组织病理学切片经 MUB₄₀-染色后的结果通常显示单个细胞分散分布于组织中。MUB₄₀ 可染色乳铁蛋白，该蛋白存在于中性粒细胞的颗粒中并呈区室化分布。因此，通常可见点状染色，或来自单个中性粒细胞的多个较大且分离的信号区域（图1）。添加第二种细胞标记物（如 DAPI）有助于将 MUB₄₀ 信号与染色细胞进行共定位分析。检测到的细胞总数取决于视野中中性粒细胞的数量，其数量可因样本来源及免疫反应强度的不同而显著变化。此处展示的是纯化固定的正常人中性粒细胞的代表性图像（图1A），以及一例溃疡性结肠炎患者组织活检样本的图像（图1B）。此外，还展示了肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）感染小鼠肺部时中性粒细胞水平相对较低的图像（

讨论

本文描述了两种利用MUB₄₀ 肽研究中性粒细胞炎症与活化的方法。我们展示了MUB₄₀ 如何用于揭示组织病理切片中的中性粒细胞，或利用活体纯化的中性粒细胞显示其活化状态。将MUB₄₀作为染色试剂使用时，其关键步骤与其他荧光检测方法相同。必须注意确保荧光信号之间的兼容性，并进行充分的洗涤步骤以去除背景染色。要获得良好的染色结果，最重要的因素包括显微镜的质量、载玻片/盖玻片以及组织切片的质量。在观察活体纯化中性粒细胞时，最关键的步骤在于纯化过程本身。中性粒细胞十分敏感，可被多种不同信号激活。为了确保实验结果具有意义，必须小心操作，使纯化后的中性粒细胞在使用前保持非活化状态。这可通过在无氧环境中进行中性粒细胞纯化操作，以限制其对氧气的暴露来实现。

MUB₄₀ 的一个局限性同时也是其优势（取决于所研究的实验问题），在于 MUB₄₀ 仅能标记活化的中性粒细胞，除非细胞经过某种方式的通透化处理。如果实验需要在活体动物或纯化细胞中追踪炎症过程，这将是一个显著优势；但如果...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	荧光标记的 MUB40 肽（也可提供其他偶联荧光染料的版本）
RI-MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	反向倒置型荧光 MUB40 肽。由 D-氨基酸合成，具有蛋白酶抗性（也可提供其他偶联荧光染料的版本）
Parformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005	组织学固定剂
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903	用于去除过量 PFA 的溶液
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)	Sakura Finetek USA	4583	用于冷冻组织以进行冰冻切片
2-Methylbutane	Sigma-Aldrich	M32631	用于冷冻组织以进行冰冻切片
Ethanol	Sigma-Aldrich	1.00974	用于干冰浴中冷冻组织
Leica Cryostat	Leica Biosystems	CM1520	用于组织切片
Glass microscopy slides	Fisher Scientific	12-518-101
Cover slips	Thor Labs	CG15CH	高精度盖玻片
Dako pen	Sigma-Aldrich	Z377821	用于防止组织染色过程中液体流失
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	用于细胞通透处理以进行免疫荧光染色
DAPI	Sigma-Aldrich	10236276001	DNA 染色剂
Alexa fluor 488 Phalloidin	Fisher Scientific	A12379	结合肌动蛋白
Prolong Gold antifade Mountant	Fisher Scientific	P36930	延长免疫荧光信号并增强抗光漂白能力
Fluorescent microscope	Various	Various	用于成像免疫荧光切片
Anoxic Cabinet	Various	Various	用于纯化活化的失活中性粒细胞
Sodium Chloride NaCL	Sigma-Aldrich	S7653
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	洗涤缓冲液组分
MACS BSA buffer	Miltenyi Biotec	130-091-376	洗涤缓冲液组分
Percoll	Sigma-Aldrich	P4937	用于中性粒细胞纯化的梯度介质
CD235a glycophorin magnetic microbeads	Miltenyi Biotec	130-050-501	用于去除污染的红细胞
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	用于从中性粒细胞中去除红细胞
RPMI-1640 without Phenol Red	Sigma-Aldrich	R8755	用于中性粒细胞检测