用于检测中性粒细胞介导的炎症事件的 MUB40 肽

摘要

本文介绍了一种检测固定和通透处理的组织切片中中性粒细胞存在情况，以及评估活体纯化中性粒细胞活化状态的实验方案。其中，MUB₄₀ 肽可结合存在于中性粒细胞特异性颗粒和三级颗粒中的乳铁蛋白。通过通透处理或中性粒细胞活化暴露颗粒内容物，即可实现对中性粒细胞的标记。

摘要

此处，我们提供一种涉及使用 MUB 的实验方案₄₀，一种合成肽，能够结合中性粒细胞特异性颗粒和三级颗粒中高浓度储存的糖基化乳铁蛋白。本方案详细介绍了MUB₄₀ 直接与荧光染料偶联的抗体可用于固定和通透组织中中性粒细胞的染色，也可用于活细胞成像以检测中性粒细胞的活化和脱颗粒。目前中性粒细胞的检测方法主要依赖于物种特异性的单克隆抗体，而这些抗体并不总是适用于所有实验应用。MUB₄₀ 不能穿透细胞膜，因此无法进入未活化/未透化的中性粒细胞内与乳铁蛋白接触。MUB₄₀ 具有识别多种宿主来源乳铁蛋白的优势，因此在涉及多种研究模型的实验中特别有用，可减少重复试剂的使用数量，并通过一步染色法简化实验流程。

引言

中性粒细胞是先天免疫系统的主要组成部分之一，通常被募集到全身各处的炎症部位。中性粒细胞的研究在很大程度上受到其短暂寿命的限制 体外 （少于8小时），且在基础状态或激活后受限于检测工具。本文提供了一种经过充分验证的方案，用于在固定/通透样本中广泛且特异性地检测哺乳动物中性粒细胞。同时，我们还提供了使用MUB对活中性粒细胞进行染色的详细方案₄₀利用活体中性粒细胞染色方案，可精确定位中性粒细胞活化的时间与位置。该方案适用于希望研究中性粒细胞活化或颗粒释放的研究人员。除抗菌功能外，中性粒细胞现已被认为是参与多种疾病及免疫应答（包括固有免疫和适应性免疫）的免疫调节细胞。^1,2中性粒细胞存在于大多数炎症组织中，在感染组织中数量较多，也见于炎性肿瘤³，肠易激综合征和克罗恩病发作期间⁴以及在非感染性炎症区域，如类风湿关节炎（RA）患者的滑膜组织⁵中性粒细胞含有四类预先形成的颗粒，分别为嗜天青颗粒（α）、特异性颗粒（β1）、三级颗粒（β2）和分泌小泡（γ）。⁶迁移至炎症部位后，募集的中性粒细胞被激活，并依次分泌颗粒内容物（包含黏附分子、抗菌化合物及免疫调节分子），从而促进进一步的细胞募集，并有助于感染的清....

方案

本文所述所有方法均已通过法国机构CoRC（临床研究委员会）、CPP（人体保护委员会）和CNIL（国家信息与自由委员会）的审查与批准。

1. 使用荧光标记的 MUB₄₀ 对组织病理学组织中的中性粒细胞进行染色

1. 为进行组织病理学分析，根据样本厚度，将组织/活检样本置于适量的4%多聚甲醛（PFA）中固定30分钟至4小时。固定期间将样本置于4 °C冰箱中。
   注意：可根据使用者的具体需求替换其他固定方法或固定时间。
   1. 去除PFA，加入足量16%蔗糖溶液以完全覆盖样本，并将样本置于4 °C环境中4小时至过夜。
   2. 去除16%蔗糖溶液，加入足量30%蔗糖溶液以完全覆盖样本，并将样本置于4 °C环境中4小时至过夜。
   3. 去除30%蔗糖溶液，用纸巾轻轻吸去组织表面多余的溶液。将组织切片置于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并在干冰-乙醇浴（-72 °C）冷却的2-甲基丁烷中速冻。待组织完全冻结（约2分钟后），将样本块从2-甲基丁烷中取出，并置于干冰上，直至所有样本块处理完毕并准备进行长期保存。将冷冻的样本块于-80 °C长期保存。
2. 在切片前一晚，将组织块从-80 °C冰箱中取出，转移至-20 °C环境中过夜，以达到温度平衡。
   1. 使用冷冻切片机将OCT包埋的组织切成10至30 μm厚的切片，并将其吸附至高质量载玻....

结果

组织病理学切片经 MUB₄₀-染色后的结果通常显示单个细胞分散分布于组织中。MUB₄₀ 可染色乳铁蛋白，该蛋白存在于中性粒细胞的颗粒中并呈区室化分布。因此，通常可见点状染色，或来自单个中性粒细胞的多个较大且分离的信号区域（图1）。添加第二种细胞标记物（如 DAPI）有助于将 MUB₄₀ 信号与染色细胞进行共定位分析。检测到的细胞总数取决于视野中中性粒细胞的数量，其数量可因样本来源及免疫反应强度的不同而显著变化。此处展示的是纯化固定的正常人中性粒细胞的代表性图像（图1A），以及一例溃疡性结肠炎患者组织活检样本的图像（图1B）。此外，还展示了肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）感染小鼠肺部时中性粒细胞水平相对较低的图像（

讨论

本文描述了两种利用MUB₄₀ 肽研究中性粒细胞炎症与活化的方法。我们展示了MUB₄₀ 如何用于揭示组织病理切片中的中性粒细胞，或利用活体纯化的中性粒细胞显示其活化状态。将MUB₄₀作为染色试剂使用时，其关键步骤与其他荧光检测方法相同。必须注意确保荧光信号之间的兼容性，并进行充分的洗涤步骤以去除背景染色。要获得良好的染色结果，最重要的因素包括显微镜的质量、载玻片/盖玻片以及组织切片的质量。在观察活体纯化中性粒细胞时，最关键的步骤在于纯化过程本身。中性粒细胞十分敏感，可被多种不同信号激活。为了确保实验结果具有意义，必须小心操作，使纯化后的中性粒细胞在使用前保持非活化状态。这可通过在无氧环境中进行中性粒细胞纯化操作，以限制其对氧气的暴露来实现。

MUB₄₀ 的一个局限性同时也是其优势（取决于所研究的实验问题），在于 MUB₄₀ 仅能标记活化的中性粒细胞，除非细胞经过某种方式的通透化处理。如果实验需要在活体动物或纯化细胞中追踪炎症过程，这将是一个显著优势；但如果.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	荧光标记的 MUB40 肽（也可提供其他偶联荧光染料的版本）
RI-MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	反向倒置型荧光 MUB40 肽。由 D-氨基酸合成，具有蛋白酶抗性（也可提供其他偶联荧光染料的版本）
Parformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005	组织学固定剂
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903	用于去除过量 PFA 的溶液
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)	Sakura Finetek USA	4583	用于冷冻组织以进行冰冻切片
2-Methylbutane	Sigma-Aldrich	M32631	用于冷冻组织以进行冰冻切片
Ethanol	Sigma-Aldrich	1.00974	用于干冰浴中冷冻组织
Leica Cryostat	Leica Biosystems	CM1520	用于组织切片
Glass microscopy slides	Fisher Scientific	12-518-101
Cover slips	Thor Labs	CG15CH	高精度盖玻片
Dako pen	Sigma-Aldrich	Z377821	用于防止组织染色过程中液体流失
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	用于细胞通透处理以进行免疫荧光染色
DAPI	Sigma-Aldrich	10236276001	DNA 染色剂
Alexa fluor 488 Phalloidin	Fisher Scientific	A12379	结合肌动蛋白
Prolong Gold antifade Mountant	Fisher Scientific	P36930	延长免疫荧光信号并增强抗光漂白能力
Fluorescent microscope	Various	Various	用于成像免疫荧光切片
Anoxic Cabinet	Various	Various	用于纯化活化的失活中性粒细胞
Sodium Chloride NaCL	Sigma-Aldrich	S7653
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	洗涤缓冲液组分
MACS BSA buffer	Miltenyi Biotec	130-091-376	洗涤缓冲液组分
Percoll	Sigma-Aldrich	P4937	用于中性粒细胞纯化的梯度介质
CD235a glycophorin magnetic microbeads	Miltenyi Biotec	130-050-501	用于去除污染的红细胞
LS columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	用于从中性粒细胞中去除红细胞
RPMI-1640 without Phenol Red	Sigma-Aldrich	R8755	用于中性粒细胞检测