低血清条件下诱导心脏前体细胞向内皮细胞分化

摘要

本方案描述了一种心脏前体细胞的内皮分化技术，重点介绍血清浓度和细胞接种密度如何影响内皮分化潜能。

摘要

心脏祖细胞（CPCs）在损伤后心脏再生中可能具有治疗潜力。在成年哺乳动物心脏中，内源性CPCs极为稀少，但扩增后的CPCs可能对细胞治疗具有应用价值。其应用的前提是能够通过明确且高效的方案，可控地分化为多种心脏谱系细胞。此外，从患者或临床前疾病模型中分离的CPCs在体外扩增后，可为研究疾病机制提供有价值的工具。 体外 扩增后，从患者或临床前疾病模型中分离的CPCs可为疾病机制的研究提供有效的研究工具。

目前的研究使用不同的标志物来鉴定心脏祖细胞（CPCs）。然而，并非所有这些标志物均在人类中表达，这限制了某些临床前研究的转化价值。无论分离技术或标志物表达如何，均可适用的分化方案将有助于实现CPCs在细胞治疗应用中的标准化扩增与预处理。本文描述了在低胎牛血清（FBS）浓度和低细胞密度条件下对CPCs进行预处理，可促进其向内皮细胞分化。通过使用小鼠和大鼠CPCs的两个不同亚群，我们证明在以下方案中，层粘连蛋白（laminin）比纤连蛋白（fibronectin）更适合作为此目的的基质：在含有维持多能性添加剂并添加3.5% FBS的培养基中培养2–3天后，将CPCs以低于60%融合度接种于层粘连蛋白上，并在不含添加剂、仅含低浓度FBS（0.1%）的培养基中培养20–24小时，随后转入内皮细胞分化培养基进行分化。由于CPCs为异质性细胞群体，血清浓度和孵育时间可能需要根据特定CPC亚群的特性进行调整。考虑到这一点，该技术也可应用于其他类型的CPCs，为研究CPCs的分化潜能与机制及其在来源于相应疾病模型的CPCs中如何受疾病影响提供了有效方法。 <60%融合度，并在无添加物、低浓度FBS（0.1%）的培养基中培养20–24小时，随后转入内皮细胞分化培养基进行分化。由于CPCs为异质性细胞群体，血清浓度和孵育时间可能需要根据特定CPC亚群的特性进行调整。考虑到这一因素，该技术也可适用于其他类型的CPCs，为研究CPCs的分化潜能与机制及其在来源于相应疾病模型的CPCs中如何受疾病影响提供了有效方法。

引言

近期研究表明，成年哺乳动物心脏中存在常驻的心脏祖细胞（CPCs）^1,2,3，且CPCs可能在心脏损伤后细胞治疗中具有应用价值^4,5。此外，从患有罕见心肌病的患者或相应疾病模型中分离出的扩增CPCs，可为药物筛选和疾病机制研究提供有效的模型^6,7。

从成年心脏中分离出的心脏祖细胞（CPCs）具有干细胞/祖细胞特性^1,2,3,8，表现为多能性、克隆形成能力以及自我更新能力。然而，存在多种不同的（亚）群CPCs，其表面标志物谱各不相同，例如c-kit、Sca-1等，或通过不同的分离技术获得（表1）。目前已建立多种培养与分化方案^{1,2,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18}。这些方案主要在生长因子和血清成分上存在差异，通常根据培养目的进行调整，可能导致实验结果和结局的不同，包括分化效率的差异。

基于标记物的分离技术：

可根据特定的表面标志物表达来分离CPCs^{1,2,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18}。先前的研究表明，c-kit和Sca-1 可能是分离驻留型CPCs的最佳标志物^{1,11,14,19,20}。由于这些标志物中没有一种对CPCs具有真正的特异性，通常会联合使用多种标志物。例如，尽管CPCs表达低水平的c-kit²¹，但其他细胞类型（包括肥大细胞²²、内皮细胞²³和造血干细胞/祖细胞²⁴）也表达c-kit。另一个问题是并非所有标志物在所有物种中均有表达。Sca-1即为一例，其在小鼠中表达，但在人类中不表达²⁵。因此，在涉及临床试验及使用人类样本的研究中，采用不依赖于分离标志物的方案可能更具优势。

不依赖标记物的分离技术：

目前存在多种主要的CPC分离技术，这些技术主要不依赖于表面标志物的表达，但可根据需要通过连续筛选特定标志物阳性的亚群进行优化（另请参见 表1）。(1) 侧群（side population, SP）技术最初基于原始造血干细胞群体排出DNA染料Hoechst 33342的能力而被鉴定²⁶ 通过ATP结合盒（ABC）转运蛋白²⁷心脏SP细胞已被不同研究团队分离，并报道其表达多种标志物，各研究间的报告存在一些细微差异。^2,8,13,14(2) 成纤维细胞集落形成单位（CFU-Fs）最初是基于类似间充质基质细胞（MSC）的表型定义的。分离得到的MSC在培养皿中培养以诱导集落形成。这类具有集落形成能力的、类似MSC的CFU-Fs可从成年心脏中分离获得，并具有向心脏谱系分化的潜能。¹⁵. （3）心脏球来源细胞（CDC）是从组织活检或外植体培养形成的细胞簇中分离得到的单个细胞^28,29,30,31最近研究表明，主要是 CD105⁺/CD90^-c-kit^- 细胞组分具有心肌生成和再生潜能³².

本文利用从小鼠中分离的SP-CPCs，提供了一种高效诱导内皮细胞谱系的实验方案，该方案基于先前在大鼠CPCs和小鼠SP-CPCs中的研究³³。该方案针对细胞密度、培养基中的血清含量以及培养基质等方面，对细胞的培养与扩增技术进行了特定优化。该方法不仅适用于小鼠SP-CPCs，还可应用于其他类型的CPCs，以诱导细胞从扩增状态向内皮细胞定向分化的命运转变，无论其目的是用于细胞移植，还是用于机制性的in vitro研究。

方案

用于细胞分离的小鼠使用遵循《实验动物护理和使用指南》以及瑞士动物保护法，并已获得瑞士州级主管部门的批准。

注意：从小鼠心脏分离 Sca-1⁺/CD31^- SP-CPC 的方法基本如先前所述³⁴，但有部分修改。所用材料与试剂详见材料表。所有实验中，从小鼠分离的心脏 SP-CPC 均以类似细胞系的方式进行扩增、传代和使用。本研究使用第 7 至 20 代的细胞。

1. 组织制备

注意：所有使用小鼠的实验必须根据相关指南和法规进行。本方案使用四只小鼠。在本方案的以下部分中，直径为100 mm的培养皿记为P100，直径为60 mm的培养皿记为P60。

1. 每只小鼠按 200 mg/kg 剂量腹腔注射戊巴比妥钠，通过夹趾反应确认其完全麻醉。
2. 用 70% 乙醇擦拭胸部，用剪刀剪开皮肤和胸壁，暴露胸腔。
3. 用镊子提起心脏，用剪刀在基部剪下心脏，将心脏放入含 25 mL（P60 为 5 mL）冷磷酸盐缓冲液（PBS）的 P100 培养皿中（每 P100 放 3 至 5 个心脏，每 P60 放 1 至 2 个心脏）。
4. 用镊子挤压心脏，将心腔内的血液挤出（图 1A）。
5. 将心脏放入另一含 25 mL（P60 为 5 mL）冷 PBS 的 P100 培养皿中进行清洗，用小剪刀去除心房，将心脏纵向切成两半，并再次用冰冻 PBS（25 mL/P100，5 mL/P60）清洗。
6. 将组织块转移至新的含 25 mL（P60 为 5 mL）冷 PBS 的 P100 培养皿中，用小剪刀将组织块进一步剪碎（图 1B），加入一滴用汉克平衡盐溶液（HBSS）稀释的 1 mg/mL 胶原酶 B，再用无菌剃刀刀片充分剪切组织（图 1C）。

2. 消化

1. 向步骤1.6中的培养皿中加入10 mL（P60使用2.5 mL）1 mg/mL的胶原酶B溶液。
2. 将含有剪碎的心脏组织的胶原酶B溶液置于倾斜（约30°）的P100（或P60）培养皿中，放入37 °C培养箱中（图1D）。
3. 剪碎的心脏组织最多孵育30分钟；孵育期间每10分钟用巴斯德移液管反复吹打以进行匀浆（图1E）。
   注意：步骤1.3的总孵育时间不得超过30分钟。

3. 过滤

1. 向剪碎并均质化的心脏组织中加入 10 mL（P60 培养皿用 5 mL）含 2% FBS 的冷 HBSS。
   注意：含 2% FBS 的 HBSS 可终止胶原酶 B 活性。
2. 将心脏组织通过 100 µm 滤膜过滤，以去除未消化的组织，随后在室温（RT）下以 470 × g 离心 5 分钟（图 1F，黄色滤膜）。
3. 弃去上清液，将沉淀物重悬于 5 mL（P60 培养皿用 3 mL）红细胞裂解缓冲液中，冰上孵育 5 分钟，期间偶尔轻轻振荡。
4. 加入 10 mL PBS（以终止裂解反应），并通过 40 µm 滤膜过滤样品，以排除包括残留心肌细胞在内的较大细胞（图 1F，蓝色滤膜）。
5. 在室温（RT）下以 470 × g 离心 5 分钟（不启用刹车）。弃去上清液，将沉淀物重悬于 1 mL 含 10% FBS 的 DMEM 中。
6. 用血细胞计数板对部分细胞进行计数。用含 10% FBS 的 DMEM 重悬细胞，调整细胞浓度至 1 × 10⁶ 个细胞/mL。
   注意：每只小鼠可获得约 5 × 10⁶ 个去除了心肌细胞和红细胞的细胞。
7. 将细胞分装至两个离心管中（图 2）：在 管 A 中加入 1.5 mL 用于 Hoechst 33342 染色并加入维拉帕米；在 管 B 中加入 18.5 mL 用于 Hoechst 33342 染色，随后进行染色和流式细胞术分选（步骤 4.1 和 4.2）心脏侧群（SP）细胞。

4. 通过流式细胞术分选心脏SP细胞

注意：维拉帕米通过抑制多药耐药性（MDR）ABC转运蛋白的活性来阻断 Hoechst 的外排。Hoechst 33342 是一种可与DNA结合的染料，可用于活细胞中检测细胞周期，因其荧光信号与DNA含量相关。能够外排 Hoechst 33342 的细胞在两个发射波长通道（450 nm，Hoechst 蓝色；650 nm，Hoechst 红色）的低荧光区域呈现，位于保留 Hoechst 的“主群体”之外，因此被称为“侧群”（side population, SP）。SP细胞富集具有前体细胞特性的细胞，并高表达多药耐药性ABC转运蛋白（如 MDR1 和 ABCG2）。在本方案后续部分，Hoechst 33342 简称为 Hoechst。为获得理想结果，需注意对光敏感材料进行避光保护。

1. 在有无维拉帕米存在下用Hoechst染色
   1. 向细胞悬液中加入维拉帕米（终浓度为83.3 µM）和Hoechst（终浓度为5 µg/10⁶细胞）。对于试管A，使用维拉帕米和Hoechst；对于试管B，仅使用Hoechst。在37 °C水浴中孵育90分钟，每20分钟颠倒一次试管（图1G）。
   2. 在室温下以470 × g离心5分钟，弃去上清液，将每管沉淀重悬于HBSS中（1 × 10⁶细胞/mL）。
   3. 从试管B中取1.5 mL等分试样用于单染和阴性对照（图2）：(i) 异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗Sca-1抗体；(ii) 别藻蓝蛋白（APC）标记的抗CD31抗体；(iii) 未染色细胞（阴性对照）。
      注：此处使用同型对照以建立分离方案。
   4. 将试管A和B以及单染和阴性对照等分试样在室温下以470 × g离心5分钟，以洗去Hoechst和维拉帕米。
   5. 弃去上清液，将试管A和(iii) 阴性对照的沉淀分别重悬于250 µL HBSS中，置于冰上避光保存直至分选。
   6. 将试管B的沉淀重悬于200 µL HBSS中，将(i, ii) 单染等分试样的沉淀分别重悬于100 µL HBSS中。加入FITC标记的抗Sca-1抗体（0.6 µg/10⁷细胞）和APC标记的抗CD31抗体（0.25 µg/10⁷细胞）。在冰上避光孵育30分钟，期间不时轻轻振荡。
   7. 向各管中加入2 mL HBSS，在室温下以470 × g离心5分钟。
   8. 弃去上清液，将所有沉淀用1 mL HBSS重悬，再次按上述条件离心。弃去上清液。将单染等分试样的沉淀重悬于200 µL HBSS中，将试管B的沉淀重悬于HBSS中（20 × 10⁶细胞/mL）。
   9. 将样品置于冰上并避光保存，直至进行分选。
2. 流式细胞术分选
   1. 在无菌的1.5 mL分选管中加入含2% FBS的500 µL HBSS。
   2. 在冰上用7-氨基放线菌素D（7-AAD）（0.15 µg/10⁶细胞）染色10分钟，以排除死细胞。
   3. 使用以下参数分选心脏侧群细胞（SP）：采用350 nm（紫外光）激发Hoechst，通过450/50 nm带通滤光片收集Hoechst蓝光发射荧光，通过670/30 nm带通滤光片收集Hoechst红光发射荧光，喷嘴尺寸为100 µm，压力为15 psi。
   4. 分析时，对分选样品记录5 × 10⁵个事件，对阴性对照、维拉帕米对照和单染样品各记录1 × 10⁵个事件。
      注：心脏SP细胞约占0.5%–2%（图1H），但不同实验室和不同样本之间可能存在差异。Sca-1⁺/CD31^-亚群约占总心脏SP细胞的1%–11%（图1I），不同实验室和样本间也可能存在差异。在本方案后续部分中，Sca-1⁺/CD31^- SP-CPCs简称为SP-CPCs。

5. 分离的SP-CPCs原代培养

注意：本实验方案中使用了三种不同的培养基，分别称为培养基1（依据Noseda et al.）⁸、培养基2和培养基3，其组成详见材料表。

1. 使用前将培养基1预热至37 °C，并将离心机冷却至4 °C。在4 °C条件下以470 × g离心分选管6分钟，然后用培养基1重悬细胞。
2. 将细胞接种于含4 mL培养基1的透气性P60培养皿中。每3天更换一次培养基，直至细胞融合度达到70% - 80%。
   注意：步骤5.2可能需要约2 - 3周时间。

6. SP-CPCs 的扩增与分化

1. 细胞培养
   1. 培养 3 × 10⁵ 个细胞⁵ T75 培养瓶中含 8 mL 培养基 1 的 SP-CPCs。
   2. 将SP-CPCs在37℃孵育 °C，5% CO₂₂ 待细胞融合度达到70% - 80%时，每2 - 3天更换一次培养基。
      注意：细胞数量应根据所用CPCs的类型、倍增时间及细胞大小进行调整。
2. 不同血清浓度下SP-CPC的生长与存活
   1. 在 T75 培养瓶中用 8 mL 培养基 1 培养 SP-CPCs 2 - 3 天。小心吸除培养基，用 5 mL 预热（37 °C）的 PBS 温和洗涤一次。 °C）HBSS。
   2. 在细胞培养箱中用5 mL胰蛋白酶-EDTA处理细胞5分钟，加入5 mL培养基1以终止胰蛋白酶活性，然后将细胞悬液转移至15 mL离心管中。
   3. 以 470 × g 离心细胞 g 在室温下孵育5分钟。
   4. 将细胞重悬于培养基1或培养基2（谱系诱导培养基）中，并以2.5 × 10⁵细胞/孔的密度接种于6孔板中。⁵ 将SP-CPCs接种于含不同血清浓度培养基的P60培养皿中，每皿3 mL。
   5. 从步骤6.2.4的培养皿中收集在培养基1或培养基2中培养2天后的培养液，用于收集死亡细胞，并将其置于15 mL离心管中。
   6. 将贴壁细胞按照步骤 6.2.2 进行胰酶消化，并将细胞悬液收集至步骤 6.2.5 的 15 mL 离心管中。在 840 x g 室温下孵育5分钟。
   7. 吸弃上清液，加入1 mL培养基1或培养基2用于细胞计数。用0.4%台盼蓝对SP-CPCs染色，计数台盼蓝阳性（死亡细胞）和台盼蓝阴性（活细胞）的细胞数量。
      注：细胞活力（步骤 6.2.7）以台盼蓝染色阴性细胞数占总细胞数的比例表示。
3. 内皮分化诱导
   1. 用10 μg/mL的层粘连蛋白预包被（6孔）培养板 µ微克/毫升的层粘连蛋白（LN）或纤连蛋白（FN）
      1. 配制含有10的基质溶液 µg/mL 的 LN 或 FN 与 F12 培养基（或 PBS）混合。每孔加入 2 mL 基质溶液，在 37 °C 下孵育 30 分钟 °C.
      2. 吸出孔板中的溶液，每孔加入 2 mL PBS，直至使用。
   2. 吸弃步骤 6.1.2 中细胞的培养基，用 5 mL 温热（37 °C) HBSS 洗涤后，在细胞培养箱中用 5 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液处理 5 分钟，加入 5 mL 培养基 1 以终止胰蛋白酶活性，将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中。
   3. 以 470 x g 离心细胞 g 室温下孵育5分钟。吸除上清液，加入培养基2用于细胞计数。
   4. 接种 8 × 10⁴ 个细胞⁴ 每孔加入3 mL Medium 2重悬细胞，接种于包被好的培养板中，并置于37℃培养 °在37°C下孵育20 - 24小时。将培养基更换为3 mL的Medium 3。
      注意：我们建议在最初 20 - 24 小时内使用含低浓度血清且不含补充物的培养基。我们建议使用 <60% 细胞汇合度（即（步骤6.3.4的细胞数量需根据细胞大小和生长速率进行调整）。
   5. 将细胞培养21 d，每3 d更换一次培养基。
   6. 通过使用内皮细胞标志物（如血管性血友病因子，vWF）对分化细胞进行染色，并进行荧光显微镜观察，以验证其内皮细胞特性。
      1. 用 1 mL PBS 洗涤细胞，并在室温下用 3.7% 甲醛固定 2 分钟。
      2. 用含 0.1% Triton X 的 ddH₂O 处理细胞使其通透₂O（或 PBS）孵育 30 分钟，并在室温下用 10% 山羊血清封闭 1 小时。
      3. 在4℃下用抗血管性血友病因子抗体（1:100）孵育细胞48小时 °C
      4. 用 1 mL PBS 洗涤细胞 3 次，每次 10 分钟。在避光条件下，室温下用 Alexa Fluor 546 标记的山羊抗兔二抗（1:500）孵育 1 小时。
      5. 用1 mL PBS再次洗涤3次，每次10分钟。在避光条件下，室温用4’6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI；1:500）染色细胞核5分钟。
      6. 用 1 mL PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。将细胞装片后于 4 ℃ 保存 °C
         注意：步骤6.1和6.3中的培养条件（基质、培养基、添加试剂和FBS浓度）在文中有所描述。 图3.
4. 管形成实验
   1. 制备基底膜基质（例如，Matrigel（下文简称基质）板。
      1. 在 4 ℃ 解冻基质 °C 过夜。
      2. 用100 μL的0.1%明胶溶液包被96孔板 µ冰上放置基质液 L。
         注意：必须避免基质中出现任何气泡。为防止基质凝胶化，必须在冰上进行培养板的包被。
      3. 将培养板置于37 °30 分钟，C
   2. 吸弃细胞培养基（在完成步骤 6.3.5 后），用 5 mL 预热至 37℃ 的 PBS 温和地冲洗细胞 °C) HBSS洗涤，并在细胞培养箱中用胰蛋白酶-EDTA处理5分钟。加入培养基3以终止胰蛋白酶活性，将细胞悬液转移至15 mL离心管中。
   3. 以 470 × g 离心细胞 g 在室温下孵育5分钟。吸除上清液，加入1 mL Medium 3，轻轻吹打混匀。
   4. 使用35 μm细胞滤网过滤细胞 µ若细胞发生聚集体，则使用 m 细胞滤筛。
   5. 计数细胞，并接种 2 x 10³ 至 4 × 10³ 细胞在100 µ在每个基质包被的孔中加入 L 的培养基3。将培养板置于37 °在细胞培养箱中孵育16小时。
   6. 使用明场显微镜在2倍放大倍数下拍摄图像。
      注意：如果胰蛋白酶消化不完全，可将胰蛋白酶-EDTA作用时间延长至最多7 - 8分钟。

结果

小鼠SP-CPC的分离：

本研究中，我们采用了根据SP表型分离的小鼠CPCs，而大鼠CPCs的结果则经修改并引用自先前的报告（已获许可）（图8）³³。

高密度与低密度细胞及不同血清浓度下的细胞增殖：

我们之前的研究表明，心肌谱系标志物的mRNA表达在培养的最初24小时内即发生变化。已知细胞外基质会影响细胞命运决定，包括内皮分化³⁵。为了探索促进CPCs向内皮谱系分化的适宜条件，本研究在6孔板（生长面积：9.6 cm²/孔）上使用了纤连蛋白（FN）和层...

讨论

本方案的优势：

本方案提供了一种CPCs向内皮细胞分化的技术。我们发现，在低血清浓度和低细胞密度条件下，内皮分化效率得以提高，且在此条件下，层粘连蛋白（LN）比纤连蛋白（FN）更适合作为基质。我们使用了两种不同类型的CPCs：大鼠CPCs（以类似细胞系的方式使用）和小鼠SP-CPCs（经分离与扩增获得）。值得注意的是，该方案适用于这两种CPCs。目前的技术已能够使科研人员从基因修饰小鼠、临床前疾病模型以及人体中分离并扩增原代CPCs^28,36。将本方案应用于分离获得的CPCs，不仅有助于疾病机制的研究，也有助于探索新的治疗靶点。

心肌前体细胞目前正处于细胞治疗的临床试验阶段^4,5，通过从患者体内分离细胞，并在体外处理后回输 体外 扩增。在这方面，本文所述方案有助于在移植前识别出增强此...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养基
Iscove's 改良 Dulbecco's 培养基（IMDM）	ThermoFisher	#12440
Dulbecco改良型Eagle培养基（DMEM）/F12营养混合物	默克	#D8437
青霉素-链霉素（P/S）	ThermoFisher	#15140122
胎牛血清（FBS）	Hyclone	#SH30071	3.5%（谱系诱导时为0.1%）
L-谷氨酰胺	ThermoFisher	#25030	终浓度 2 mM
谷胱甘肽	默克	#G6013
重组人表皮生长因子（EGF）	Peprotech	#AF-100-15
重组碱性成纤维细胞生长因子（FGF）	Peprotech	#AF-100-18B
B27 补充剂	ThermoFisher	#17504044
心肌营养素1	Peprotech	#250-25
凝血酶	Diagontech AG，瑞士	#100-125
Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-)	ThermoFisher	#14170
0.05 % 胰蛋白酶-EDTA	ThermoFisher	#25300
T75 培养瓶	Sarstedt	#83.3911
内皮分化
内皮细胞生长培养基（EGM）-2 BulletKit	Lonza	#CC-3162
Ham's F-12K（Kaighn's）培养基	ThermoFisher	#21127
层粘连蛋白	默克	#L2020
纤连蛋白	默克	#F4759	用ddH2O稀释
6孔板	Falcon	#353046
甲醛溶液	默克	#F1635	在 PBS 中稀释 1:10（终浓度为 3.7%）
Triton X-100	默克	#93420	0.1% 的 ddH2O 溶液
正常山羊血清（10%）	ThermoFisher	#50062Z
抗血管性血友病因子抗体	Abcam	#ab6994	1:100，溶于10%山羊血清中
山羊抗兔IgG，Alexa Fluor 546	ThermoFisher	#A11010	1:500，溶于10%山羊血清中
4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）	ThermoFisher	#62247	1:500，溶于ddH2O
SlowFade 抗荧光淬灭试剂盒	ThermoFisher	#S2828
BX63 宽场显微镜	奥林巴斯
管状结构形成
96孔板	Falcon	#353072
带滤网帽的5 ml圆底管	Falcon	#352235
基质胶生长因子减量	康宁	#354230
IX50 宽场显微镜	奥林巴斯
Sca-1+/CD31- 心脏侧群细胞的分离34
试剂
戊巴比妥钠 50 mg/ml 兽用	院内医院药房	#9077862	工作溶液：200 mg/kg
磷酸盐缓冲液（PBS），不含 CaCl₂，不含 MgCl₂	ThermoFisher	#20012
Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), 酚红(-)	ThermoFisher	#14175	配制 500 mL HBSS 加 2% FBS  用于淬灭胶原酶B活性
Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），含1 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸	ThermoFisher	#331885	配制 DMEM + 10% FBS  + 25 mM HEPES + P/S 用于Hoechst染色
青霉素-链霉素  (P/S)	ThermoFisher	#15140122
HEPES 1 M	ThermoFisher	#15630080	终浓度 25 mM
胎牛血清（FBS）	Hyclone	#SH30071
RBC裂解缓冲液（10X）	BioLegend	#420301/100mL	用ddH₂O稀释至1×，并通过0.2 μm滤膜过滤 µm 滤膜
胶原酶B	默克	#11088807001	终浓度为1 mg/mL的HBSS溶液，经0.2 μm滤膜过滤 µm 滤膜
双苯并咪唑 H33342 三盐酸盐（Hoechst）	默克	#B2261	用ddH₂O配制1 mg/mL溶液
盐酸维拉帕米	默克	#V4629	终浓度 83.3 µM
APC 小鼠抗大鼠 CD31	BD Biosciences	#551262	0.25 µ克/107细胞
FITC 标记大鼠抗小鼠 Ly-6A/E (Sca-1)	BD Biosciences	#557405	0.6 µ克/107细胞
7-氨基放线菌素D (7-ADD)	ThermoFisher	#A1310	0.15 µ克/106细胞
APC 标记的大鼠 IgG2a k 同型对照	BD Biosciences	#553932	0.25 µ克/107细胞
FITC 标记的大鼠 IgG2a κ 同型对照	BD 生物科学	#554688	0.6 µ克/107细胞
材料
27G针头	Terumo	#NN-2719R
18G针头	Terumo	#NN-1838S
一次性使用无菌1 mL注射器	CODAN	#62.1640
移液管 3.5 mL	Sarstedt	#86.1171.001
细胞筛 40 µm blue	BD Biosciences	#352340
细胞滤网 100 µm 黄色	BD Biosciences	#352360
Lumox 培养皿 50	Sarstedt	#94.6077.305
P100 培养皿	康宁	#353003
60 mm 培养皿	康宁	#353004
小鼠
行	年龄	繁殖
C57BL/6NRj / 雄性	12 周	自主研发
产品名称	公司	目录编号
试剂
Iscove's 改良 Dulbecco's 培养基 (IMDM)	ThermoFisher	#12440
Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）/F12 Ham营养混合物	默克	#D8437
青霉素-链霉素  (P/S)	ThermoFisher	#15140122
胎牛血清（FBS）	Hyclone	#SH30071
L-谷氨酰胺	ThermoFisher	#25030
谷胱甘肽	默克	#G6013
B27 补充剂	ThermoFisher	#17504044
重组人表皮生长因子（EGF）	Peprotech	#AF-100-15
重组碱性成纤维细胞生长因子（FGF）	Peprotech	#AF-100-18B
心肌营养素1	Peprotech	#250-25
凝血酶	Diagontech AG，瑞士	#100-125
内皮细胞生长培养基（EGM）-2 BulletKit	Lonza	#CC-3162
培养基成分概述。部分信息与上述内容相同，但按培养基1-3的成分顺序进行整理。
产品名称	培养基18	培养基2	培养基3
试剂	培养	谱系诱导	内皮分化
Iscove's 改良 Dulbecco's 培养基 (IMDM)	35%	35%
Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）/F12 Ham营养混合物	65%	65%
青霉素-链霉素  (P/S)	1%	1%
胎牛血清（FBS）	3.5%	≤0.1%
L-谷氨酰胺	2 mM	2 mM
谷胱甘肽	0.2 nM	0.2 nM
B27 补充剂	1.3%
重组人表皮生长因子（EGF）	6.5 ng/mL
重组碱性成纤维细胞生长因子（FGF）	13 ng/mL
心肌营养素1	0.65 ng/mL
凝血酶	0.0005 U/mL		试剂盒中包含的所有必要组分
内皮细胞生长培养基（EGM）-2 BulletKit			试剂盒中包含所有必需组分