本文介绍了用于昆虫嗅觉行为测定的风洞装置的构建与使用方法。该风洞设计支持多种方式释放气味源，既可结合视觉刺激，也可在无视觉刺激条件下进行。风洞实验是鉴定具有行为活性的挥发性化学物质的重要方法。
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摘要
摘要
嗅觉是许多昆虫与环境相互作用的最重要感觉机制，而风洞是研究昆虫化学生态学的优秀工具。昆虫能够通过感觉交互和复杂的行为，在三维环境中定位点源。量化这种行为是开发新型害虫控制工具和决策支持系统的关键环节。配备合适飞行段、具有层流气流、提供飞行中视觉反馈线索，以及具备多种施加气味方式选择的风洞，可用于测量复杂行为，从而可能识别出具有吸引力或驱避性的气味、昆虫飞行特征、视觉与气味间的相互作用，以及吸引物与环境中残留背景气味之间的相互作用。风洞的优势在于可在实验室条件下研究昆虫由气味介导的行为谱。在受控环境中获得的行为数据，为昆虫生理学与田间应用之间建立了联系。风洞必须是一种灵活的工具，应能方便地调整设置和硬件，以适应不同的研究问题。本文所述风洞装置的主要缺点是其洁净的气味背景，在为田间应用开发合成挥发性混合物时需对此给予特别关注。
引言
风洞是昆虫化学生态学研究中的重要工具，可用于在实验室条件下测试昆虫对化学信号物质的飞行反应。通过将气味释放到受控的气流中，可直接监测昆虫朝气味源进行的逆风飞行行为，从而研究其对这些刺激物的行为响应。嗅觉是许多昆虫与其生物环境相互作用的最重要感觉机制1。昆虫利用气味线索寻找合适的交配对象；同样，它们也利用来自寄主资源的复合气味来为自己或后代寻找食物。植物在提供花蜜和花粉作为回报的同时释放花香气味，以提高昆虫传粉效率。所有这些挥发性信号物质均被动扩散到环境中，昆虫需要识别并解读其各自的生物学意义。当挥发性物质释放到环境中后，其分子会随风以丝状形式传播，在较远的下风向仍能保持初始浓度，最终才因湍流和扩散而断裂并稀释2。昆虫能够检测到挥发性信号的微小变化，并据此向气味源逆风移动。当接触到有吸引力的气味时，昆虫表现出快速逆风飞行的行为，而在失去气味信号时则进行横向搜索以重新定位气味羽流3,4。昆虫触角上的嗅觉神经元在感器中呈共定位排列，可对气味羽流的接触与中断产生高分辨率的行为响应5，并使昆虫能够区分来自不同来源的相似气味分子6。飞行过程中的视觉反馈，即所谓的视动风向趋性（optomotor anemotaxis），对于识别风向、物体及相对位移至关重要2,7。通过多种感觉系统的协同作用以及复杂的行为机制，昆虫能够在三维环境中定位点源。
昆虫引诱剂和驱避剂的鉴定具有多个重要的应用价值。许多害虫的性信息素（种内信号）可以被合成并释放到空气中，以干扰其交配行为8。信息素和利己素（种间信号）均可用于大量诱捕、诱杀以及监测陷阱中，从而直接提供害虫发生状况的信息。昆虫驱避剂（例如针对蚊虫的驱避剂）9也可通过风洞生物测定法进行研究。这些方法在综合害虫治理以及为农民提供决策支持系统中发挥着重要作用。
风洞生物测定法是一种强大的方法，可用于监测物种由气味介导的行为反应，从而识别出可用于替代或减少农药使用的新害虫防控工具。
风洞设计背后的理论原理已有详尽描述10。本文介绍风洞的构建、气味施加方式以及飞行行为，这些方法已在多个实验中用于确定风洞生物测定方案。挪威尼比奥（Nibio，Ås，挪威）的风洞（图1）由抗刮擦透明聚碳酸酯材料从头构建而成。飞行区域高67 cm，宽88 cm，长200 cm。在飞行区域前方，另设有一段长30 cm的聚碳酸酯结构。该部分作为施加气味的辅助区域。若挥发性物质接触到飞行区域内的聚碳酸酯外壳，可能在后续实验中重新释放，造成不同实验轮次间的交叉污染。因此，在辅助区域的两端均设有穿孔金属网。两个金属网均对气流形成限制，并在上风侧产生轻微正压，从而增强下风侧的层流效果。上风侧网格由穿孔金属板制成，孔径为8 mm，均匀分布在风洞横截面上，开孔面积占54%。下风侧网格孔径为3 mm，开孔面积占51%。这种设计可减少湍流，确保气味羽流沿飞行区域中心线稳定传播。气味羽流呈细长锥形，可通过烟雾可视化。在飞行区域底部铺设直径5至15 cm不等的塑料或纸制圆形标记，为昆虫飞行过程中提供视觉反馈。飞行区域上风端及辅助区域均设有25 cm × 50 cm的可开启门。在飞行区域下风端与排气过滤段之间，设有60 cm的开放操作区，用于昆虫操作。该操作区两侧覆盖0.8 mm孔径的网状织物，防止昆虫逃逸至实验室内。
风扇将空气吸入第一个过滤器外壳。空气在通过粉尘过滤器后，再经24个大容量活性炭过滤器净化，随后排入隧道中。从隧道排出的空气需经过另一个类似的过滤器外壳，然后重新释放回室内。通过通风橱将空气排至建筑物外部可能更为有利。两个过滤器外壳上的风扇以相同的风量运行。两个风扇均配有连续可调的调光开关，并使用流量计校准至不同的风速。风速取决于所测试的物种，30 cm s-1 通常是一个良好的起始点。对于小型昆虫，理想风速可适当降低；而对于飞行能力强的昆虫，可提高风速以增加其相对飞行距离。
风洞室可调控温度、湿度和光照强度。在3 mm不透明聚甲基丙烯酸甲酯板后方安装有LED灯带，用于在飞行区域上方和后方形成漫射光源。两个光源均可独立控制。
气味施加可通过多种方式实现。通常，气味在飞行 arena 上风端中央释放到气流中。根据具体的研究问题，释放点可以暴露或遮蔽。一个带有金属网（2 × 2 mm 网格尺寸）的玻璃圆筒（直径 10 cm，长 12.5 cm）可安装在下风侧，用于在视觉上遮挡气味源，同时作为昆虫的着陆平台。在许多实验中，可在释放点附近使用水平玻璃平台来呈现气味源或视觉信号。此外，还可以并排同时释放两种气味，以进行选择性实验。此时，两个释放点相距 20 cm，气味羽流从风洞中段开始重叠。通过观察昆虫逆风追随哪一股羽流，即可判断其选择。
风洞设计支持多种挥发性物质释放方法。例如，可以在背景气味（如作物植物释放的气味）前方释放特定气味11,12。此外，还可测试不同的视觉刺激13,14。实验装置必须根据每个物种及研究问题进行相应调整。
可将天然气味源（如植物部位）和来自释放装置的合成气味直接引入飞行 arena。为了将气味介导的行为与视觉分离，可以遮盖气味源，或通过外部经活性炭过滤的实验室空气供应将挥发性物质带入飞行 arena。此时，气味源被限制在玻璃瓶内，空气通过特氟龙管和玻璃管被推入风洞中的玻璃瓶，再进入风洞。释放点的气流速度应与 arena 内的风速相匹配。
为以特定混合比例释放气味，可使用喷雾器。该喷雾器为带有锥形喷嘴和内置微孔管的超声波喷嘴，可实现每分钟10 µL的液体流速。-1喷嘴连接至宽带超声波发生器，工作频率为120 kHz。注射泵将气味样品推入喷雾喷嘴。内径为0.12 mm的氟化乙烯丙烯（FEP）管将1 mL气密注射器与喷嘴相连。在乙醇中膨胀、在空气中收缩的管路接头可实现紧密连接且无内部死体积。喷嘴振动产生的气溶胶液滴大小取决于频率以及所用的具体溶剂。较小的液滴蒸发后以挥发性物质形式随风进入风洞。其他类型的喷雾装置也存在，一种利用压电驱动玻璃毛细管的低成本设计可提供类似解决方案15.
可使用合成混合物或顶空采集样品与喷雾器配合。样品用纯乙醇稀释至所需浓度。对于挥发性物质采集样品，可将其稀释至与采集时间相对应的体积。例如，采集3小时的挥发性样品应稀释至1800 µL，在喷雾器以10 µL min-1的释放速率下，相当于持续释放3小时。
飞行行为的识别可直接通过人工观察或事后视频分析完成。应将定向飞行与随机飞行区分开来。气味介导的行为可通过以下特征进行识别：在气味羽流中呈之字形飞行、在羽流内部时呈直线逆风飞行，以及在失去与羽流接触时呈环形返回。当失去吸引性羽流后，昆虫也可能开始以逐渐增大的弧度进行之字形飞行，以重新接触丢失的羽流3,4。这种行为在野外环境中至关重要，因为追踪吸引性气味的昆虫需要应对湍流和风向变化。飞行模式并非一致，而是因昆虫目而异。例如，较强的飞行者如丽蝇，其逆风定向速度更快，搜索范围更广，相较于蛾类更为显著，因此需要提高风速以促进其相对飞行路径的延长。
昆虫的飞行过程也可以进行拍摄记录。使用单个相机，可通过绘制x y坐标来描述简单的飞行特征16。通过使用两个同步帧捕获的相机，可利用外部软件重建三维飞行轨迹17。随后可对飞行轨迹进行分析，以获取有关飞行速度和距离、相对于风向的飞行角度，以及飞行特征与气味羽流之间关系的详细信息。目前已有定制和商业化的设备及软件，可实现逐帧自动追踪。应使用校准帧来标定真实空间，建议采用直线型广角镜头以最小化镜头畸变。应注意减少视觉背景噪声，例如风洞实验区内的边缘和角落，并最大限度提高昆虫与背景之间的对比度。通过使用红外光源，可利用黑白CCD相机拍摄昆虫的反射光（例如，来自夜行性蚊虫的反射）17。
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方案
1. 准备玻璃试管
- 准备玻璃管（例如，直径 2.8 cm，长 13 cm），并用塑料卡扣盖封闭一端。
- 将 10 只昆虫分别放入带盖的玻璃管中，并用橡皮筋将纱布固定在另一端开口上。让昆虫在风洞室的温度、光照条件和湿度下适应至少 2 小时。
注意：每根管内昆虫的数量取决于物种种类和研究问题。
2. 准备气味源
- 喷雾器操作步骤。
- 用稀释后的顶空收集样品或合成气味混合物填充1 mL气密注射器。
注意：稀释后的顶空样品或合成气味混合物的具体成分取决于昆虫种类和研究问题。通常，所用浓度应与真实气味源的自然释放速率相当。 - 使用管路接头将注射器尖端连接至FEP管，并将注射器插入注射泵中。
- 启动注射泵。
- 启动宽带超声发生器。
注意：可通过从释放点下方照射手电筒光束来确认喷雾器中气溶胶的释放。 - 每次处理之间，使用96%乙醇运行喷雾器至少10分钟，以清洗管路内部和喷嘴。所有清洗操作应使用专用于纯乙醇的独立注射器。
- 使用后，用96%乙醇清洁注射器及喷嘴尖端。
- 用稀释后的顶空收集样品或合成气味混合物填充1 mL气密注射器。
- 真实气味源操作步骤。
- 将真实气味源放入风洞中，或置于2 L顶空采集罐内。
- 将顶空采集罐连接至实验室气流系统，并将气体释放至风洞中。
注意：植物材料应在实验开始前尽快采集，并将切口端插入盛水的小瓶中以防止萎蔫。所用植物材料的种类和数量，或其他真实气味源的类型和量，取决于昆虫种类和研究问题。
- 将装有昆虫的玻璃管放置于距离气味/视觉源下风向180 cm、距地面30 cm处的支架上，管子的封闭端应朝向上风方向。
3. 开始实验方案
- 使用两台摄像机捕捉两个不同的视角。将摄像机安装在飞行区域上方，并调整角度以获取两个不同的视图。
- 打开盖子。
- 启动计时器。
注意：不同物种响应所需的时间不同，例如，苹果果蛀蛾（Argyresthia conjugella）在4至5分钟内即会响应11，而葡萄园卷蛾（Lobesia botrana）则可能需要长达20分钟才能响应18。 - 观察飞行模式，特别注意飞行特征及逆风定向行为。根据预定义的行为类别对飞行表现进行评分，例如，起飞、短距离定向飞行（至少20 cm）、长距离定向飞行（距离气味源< 5 cm）以及降落。
注意：使用两台摄像机进行拍摄并结合三维追踪技术，可更详细地分析飞行特征。通常情况下，摄像机安装在飞行区域上方，并调整角度以获取两个不同的视角。 - 收集降落在风洞壁上、气味羽流范围之外的昆虫，并将其重新放回固定装置中。
注意：每只昆虫可给予一次对气味产生逆风飞行反应的机会，之后不再重复使用。 - 在不同处理之间更换洁净的玻璃装置。
注意：应频繁进行对照处理，以识别可能的污染源。 - 实验结束后，用CO2或冷冻法处死昆虫。
注意：根据研究问题的不同，可对雌虫进行卵发育评分，或进行肉眼检查以确认翅或触角的状态。
4. 清洁
- 用乙醇和水清洗所有金属和玻璃器件，并放置至干燥。
- 将所有金属和玻璃器件加热至 300 °C，持续 6 h，以去除污染物。
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结果
丽蝇对来自死亡动物的气味反应强烈，这些气味代表了一种短暂的幼虫生长基质19,20. 以死亡小鼠作为天然气味源，我们研究了15日龄交配后雌性果蝇的飞行行为细节 C. vicina, 有或没有视觉刺激位于气味释放点旁边13为了消除自然视觉线索，我们采用了上述玻璃罐系统。风速为 30 cm s-1 丽蝇在风洞的下风端表现出超过80%的起飞和定向飞行行为，其中超过60%的个体能够以受控且定向的运动向风洞的上风区域前进（图2）。视觉线索对定向飞行行为没有显著影响。然而，为了有效展示在自然条件下使丽蝇能够将卵产在尸体上的完整行为谱（起飞、定向飞行和降落），需要添加视觉线索以标记气味源。使用视觉线索使在气味源处的降落率从14%显著提高到40%。这是从一个更大的风洞实验中简化而来的实验方法。...
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讨论
风洞是识别多种昆虫引诱性气味和驱避性气味的有效工具4,9。在充分了解所研究昆虫的生态学、生物学和行为特征的基础上，可轻松识别其飞行特性，并可根据需要调整环境条件、风速、视觉刺激以及气味施加方式。在首次研究新物种时，建议使用最具吸引力的气味源来精细优化风洞参数。对于利它素，通常采用活体寄主植物材料或天然食物来源；而对于信息素，则使用关在笼中释放性信息素的雌性或雄性个体（取决于所研究的昆虫种类）。为了鉴定驱避性物质，还需设置一个具有吸引力的气味源，以评估其拮抗作用9。这些初步结果还可作为后续实验的基准参照。
应考虑风洞的尺寸，以提供足够的空间供昆虫自由活动并展现其固有的飞行特性。对于飞行能力强且体型较大的昆虫，可能需要较大的飞行区域；而对于较小的昆虫，则可使用部分区域。风速应根据所研究的昆虫种类而定，并调整至适合其飞行能力的水平。在使用所有气味物质时，尤其是信息素时，应注意避免污染，并应频繁进行对照处理，以防止得出错误结论...
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致谢
M. Tasin 得到了瑞典可持续发展研究理事会（Formas，资助号 2013-934）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 飞行实验区 | 任意 | NA | 根据滤芯外壳定制结构 |
| 滤芯外壳 × 2 | Camfill Farr | 用于容纳粉尘和活性炭过滤器 | |
| 风扇 × 2 | Fischbach | 型号 D640/E35 | 带连续调光开关的静音风扇 |
| 穿孔网格 | 任意 | NA | 需要两种不同开孔面积，例如 54% 和 51% |
| 流量计 | Swema air | Swema air 300 | 用于测定风速 |
| 超声波喷雾器 | SonoTek | 带锥形喷嘴和插入式微孔管的喷雾喷头 | |
| 宽带超声波发生器 | SonoTek | 函数信号发生器 | |
| 注射泵 | CMA microdialysis | CMA 102 | 液体输送 |
| FEP 管路 | CMA microdialysis | 内径 0.12 mm | |
| 管路接头 | CMA microdialysis | 零内体积连接器 | |
| 气密注射器 | 任意 | NA | 1000 µL 注射器，用于顶空样品采集和合成混合物 |
| 气密注射器 | 任意 | NA | 1000 µL 注射器，用于清洗喷雾器 |
| 手电筒 | 任意 | NA | 小型光源，用于检查喷雾器释放情况 |
| 计时器 | 任意 | NA | 带报警功能的计时器 |
| 昆虫释放支架 | 任意 | NA | 金属结构 |
| 照明设备 | 任意 | NA | 推荐使用 LED，因其产热低 |
| 加湿器 | 任意 | NA | 尺寸取决于风洞室体积 |
| 温度控制 | 任意 | NA | 温度范围取决于物种 |
| 玻璃管 | 任意 | NA | 用于盛放昆虫的玻璃管（直径 2.8 cm，长 13 cm） |
| 卡口盖 | 任意 | NA | 与玻璃管匹配的卡口盖 |
| 纱布 | 任意 | NA | 用于封闭玻璃管口的织物 |
| 橡皮筋 | 任意 | NA | 用于固定纱布 |
| 玻璃圆筒 | 任意 | NA | 用于气味封闭和着陆平台的圆筒（直径 10 cm，长 12.5 cm） |
| 玻璃广口瓶 | 任意 | NA | 用于动态顶空采集的玻璃瓶 |
| 连接件和管路 | 任意 | NA | 管路和连接件需根据玻璃瓶类型选择 |
| 空气供应 | 任意 | NA | 来自实验室空气或气瓶 |
| 活性炭过滤器 | 任意 | NA | 用于净化外部空气供应 |
| 小瓶 | 任意 | NA | 装有水的小瓶，用于保持植物材料新鲜 |
| 烘箱 | 任意 | NA | 将金属和玻璃器皿加热至 300 摄氏度以去污染 |
参考文献
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