卵巢癌会在整个腹膜腔内形成转移灶。本文介绍了一种制备和使用叶酸受体靶向的表面增强共振拉曼散射纳米探针的方案，该探针可通过比率成像以高特异性揭示这些病灶。via 将纳米探针腹腔内注射至活体小鼠，所获得的图像与组织学结果具有良好的相关性。
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摘要
摘要
卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤。大多数患者在确诊时已处于晚期（国际妇产科联盟FIGO III期或IV期），此时局部转移性扩散已经发生。然而，卵巢癌的转移扩散具有独特模式，即肿瘤种植灶最初局限于腹腔内。这一特征理论上使得以根治为目的完全切除肿瘤种植灶成为可能。但许多转移病灶为微观病灶，难以识别和治疗。中和此类微转移灶被认为是消除肿瘤复发、实现长期生存的主要目标之一。利用表面增强共振拉曼散射纳米探针进行拉曼成像，因其明亮且生物正交的光谱特征，可用于高灵敏度地勾画微观肿瘤。本文描述了两类此类纳米探针的合成方法：一种是抗体功能化的探针，靶向叶酸受体——该受体在多种卵巢癌中高表达；另一种为非靶向对照探针，二者具有不同的光谱特征。 将这两种纳米探针共同经腹腔内注射至人卵巢腺癌转移小鼠模型中。所有动物实验均经纪念斯隆-凯特琳癌症中心机构动物护理和使用委员会批准。手术暴露动物腹腔后进行冲洗，并使用拉曼显微光谱仪扫描。随后，采用经典最小二乘拟合算法解耦两种纳米探针的拉曼信号，并将其各自的信号强度比值化，从而获得靶向叶酸受体探针相对于非靶向探针的比值信号。通过该方法，可实现对微观转移灶的高特异性可视化。该方法的主要优势在于，将探针局部应用于腹腔内——可在手术过程中便捷完成——能够在不使患者暴露于全身性纳米颗粒的情况下标记肿瘤。通过采用具有不同拉曼光谱特征的靶向与非靶向纳米探针混合物，并结合比值化分析策略，可消除因纳米探针非特异性结合内脏表面而产生的假阳性信号。目前该技术的局限性在于尚无商用的宽场拉曼成像相机系统，一旦该设备可用，本技术即可应用于手术室环境。
引言
利用“表面增强拉曼散射”（SERS）纳米颗粒进行拉曼成像，在多种应用场景及多种不同肿瘤类型中均展现出在界定病灶方面的巨大潜力1,2,3,4。SERS 纳米颗粒的主要优势在于其类似指纹的光谱特征，使其能够被明确检测，且不受生物背景信号的干扰5。此外，当使用吸收峰与激发激光相匹配的报告分子（染料）时，所发射信号的强度可进一步增强，从而产生“表面增强共振拉曼散射”（SERRS）纳米颗粒，其灵敏度更高6,7,8,9,10,11,12。
需要解决的阻碍表面增强（共振）拉曼散射纳米颗粒应用的一个障碍13 以及其他多种纳米颗粒结构14,15 用于临床的一个关键因素是其给药方式，因为静脉注射会导致药物的全身暴露，因而需要进行 extensive testing 以排除潜在的不良反应。本文提出了一种不同的范式，即局部应用纳米颗粒 体内，直接注入腹腔内，随后进行冲洗步骤以清除未结合的纳米颗粒1该方法与目前正在研究的新型治疗策略一致，后者同样采用将药物局部灌注至腹腔的技术，即腹腔热灌注化疗（hyperthermic intraperitoneal chemotherapy, HIPEC）。因此，该原理本身相对易于整合到临床工作流程中。我们已研究了纳米颗粒在腹腔给药后的生物分布，未观察到任何可检测到的全身循环吸收现象。1此外，局部给药方法可避免网状内皮系统对纳米颗粒的截留，从而显著减少所需的纳米颗粒数量。然而，当抗体功能化的纳米颗粒外用时，即使没有靶标存在，也容易黏附在内脏表面。为了最大限度地减少因纳米颗粒非特异性黏附导致的假阳性信号，我们采用一种比率检测策略：由分子靶向的纳米探针提供特异性信号，而一种具有不同拉曼光谱的非靶向对照纳米探针则用于校正非特异性背景信号16,17我们最近在弥漫性卵巢癌小鼠模型中展示了这种局部应用的表面增强共振拉曼比率光谱方法1.
该方法的总体目标是开发两种表面增强共振拉曼散射（SERRS）纳米探针，一种为靶向性探针，另一种为非特异性探针，并将其局部应用于小鼠模型，通过两种探针的比率检测来成像癌症相关生物标志物的表达水平或过表达情况 通过 拉曼成像。在本研究中，选择叶酸受体（FR）作为靶点，因为该受体在多种卵巢癌中表达上调18,19基于SERS纳米颗粒的拉曼显微成像也已用于癌细胞识别20. 两个不同的 "风味" 合成拉曼纳米颗粒，每种颗粒的指纹特征均源自不同的有机染料。这些纳米颗粒具有星形金核，外包二氧化硅壳层，在约710 nm处表现出表面等离子体共振。拉曼信号报告分子（有机染料）在二氧化硅壳层形成的同时被沉积。最后，针对叶酸受体的靶向纳米探针（αFR-NPs）通过将二氧化硅壳层与抗体偶联制备而成，而非靶向纳米探针（nt-NPs）则通过在表面修饰单层聚乙二醇（PEG）进行钝化处理。
该技术已成功用于绘制弥散性转移性卵巢癌（SKOV-3）小鼠异种移植模型中的微小肿瘤，证明了其在活体应用中的可行性。此外，该技术还可扩展应用于切除组织的肿瘤表型分析，或在减瘤术后进行切缘判定，如一项相关研究所示21。
SERRS 纳米探针为生物标志物的多靶向标记物构建提供了一个稳定的平台，其合成过程基于简单的化学反应，如图1所示。本文中，我们介绍了两类 SERRS 纳米探针的合成方案（第1-3节）、适配的卵巢癌小鼠模型的建立（第4节）、纳米探针的给药与成像（第5节），以及最终的数据分析与可视化方法（第6节）。
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方案
所有动物实验均经纪念斯隆-凯特琳癌症中心机构动物照护与使用委员会批准（#06-07-011）。
1. 金纳米星核的合成
注意：金纳米星被用作本实验中两种类型的 SERRS 纳米探针的核心。
- 在去离子水（DI水）中配制800 mL的60 mM抗坏血酸（C6H8O6）溶液，并在去离子水中配制8 mL的20 mM四氯金酸（HAuCl4）溶液。将两种溶液冷却至4 °C。
- 在4 °C下进行此反应步骤。将含有800 mL抗坏血酸溶液的锥形瓶置于磁力搅拌器上，形成稳定的漩涡。迅速将8 mL四氯金酸溶液加入漩涡中。数秒内将生成纳米星，溶液变为深蓝色。若溶液在任何时刻变为粉红色或紫色，表明生成了纳米球，应弃去该悬浮液并重新尝试合成。
- 将纳米星悬浮液倒入50 mL锥形管中，在4 °C条件下以3,220 × g离心20分钟。吸除上清液，每管中保留约200 µL溶液。注意不要扰动管底的纳米颗粒沉淀。
注意：由于仍有悬浮的纳米星存在，上清液应呈现蓝色。 - 使用微量移液器轻轻搅动溶液，使各管中的纳米颗粒重新悬浮并收集。部分沉淀可能紧贴管底难以分散，即使剧烈吹打也无法重悬，该部分应弃去。
- 将纳米颗粒悬浮液转移至透析盒（截留分子量3.5 kDa），在2 L去离子水中透析至少三天，每天更换透析液。可在4 °C下将纳米星保存于透析液中长达一个月，每3–4天更换一次水。
注意：纳米星应持续保留在透析过程中，直至按第2节所述进行硅化反应时使用。
2. 二氧化硅壳的形成
注意：合成两种类型的拉曼纳米探针。两种探针的合成步骤相同，唯一的区别在于所使用的拉曼报告分子（染料）。本实验中使用 IR780 高氯酸盐和 IR140。反应过程应始终在塑料容器中进行。该合成方法具有高度可扩展性，可根据所需注射剂量的量进行调整。此处描述的是中等规模批次的合成，可根据需要线性缩放至更小或更大的体积，试剂浓度和反应时间保持不变。两种表面增强共振拉曼散射（SERRS）纳米探针的反应可并行进行，需注意避免交叉污染。在离心洗涤步骤后或纳米颗粒储存超过一小时后，重新分散纳米颗粒沉淀时应进行超声处理。超声处理应持续至纳米颗粒明显悬浮于溶液中，通常超声 1 秒即可。
- 在A管（50 mL锥形管）中，混合10 mL异丙醇、500 µL正硅酸乙酯（TEOS）、200 µL去离子水和60 µL染料（高氯酸IR780或IR140，20 mM溶于DMF（二甲基甲酰胺））。
- 在B管（15 mL锥形管）中，混合3 mL乙醇和200 µL氢氧化铵。对第1.4步得到的纳米星进行超声处理以分散溶液中的聚集体，并将1.2 mL纳米星溶液加入该管中。
注意：氢氧化铵溶液具有高度挥发性，难以准确移取。建议在使用前将其保存于4 °C，以便于移液操作。 - 将A管置于涡旋混合器上，形成稳定的涡流。迅速将B管中的内容物加入涡流中，并继续混合约5秒。立即转移至摇床，在室温下以300 rpm振荡反应15分钟。
- 反应15分钟后，加入乙醇至50 mL管满，以终止反应。在4 °C条件下，以3,220 × g离心20分钟。
- 小心吸除上清液，保留约0.5 mL溶液，注意不要扰动沉淀。加入1 mL乙醇，用移液器吹打重悬纳米颗粒。转移至1.5 mL离心管中，通过在11,000 × g离心4分钟、吸除上清液，并用超声处理约1秒重新分散沉淀，重复此洗涤步骤共4次。
注意：在此阶段，硅化纳米颗粒可按照第3节所述进行功能化修饰，或额外增加一次洗涤步骤后重悬于去离子水中，于4 °C保存最多一周。
3. 表面功能化
注意： IR780 SERRS 纳米探针将通过 PEG 交联剂与叶酸受体靶向抗体偶联，形成 αFR-NPs；IR140 SERRS 对照纳米探针则将偶联钝化 PEG 单分子层，用于制备 nt-NPs。两种类型的纳米探针均通过分别但平行进行的巯基-马来酰亚胺反应生成。
- 通过在11,000 × g 条件下离心4分钟，吸除上清液，并将沉淀物用1 mL乙醇超声重悬，洗涤纳米颗粒两次。再重复洗涤一次，但将沉淀物重悬于1 mL 85%乙醇、10% 3-MPTMS（3-巯基丙基三甲氧基硅烷）和5%去离子水中。在室温下孵育1–2小时，以在颗粒表面引入巯基。
- 将巯基功能化的纳米颗粒在11,000 × g 条件下离心4分钟，吸除上清液后通过超声将沉淀重悬，依次用乙醇洗涤两次、去离子水洗涤两次，最后重悬于HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）缓冲液（10 mM，pH 7.1）中，置于一旁备用。
注意：应使用MES（2-(N-吗啉代)乙磺酸）缓冲液或HEPES缓冲液。盐浓度较高的缓冲液（如PBS，磷酸盐缓冲盐水）可能引起纳米颗粒聚集。 - 对于抗体功能化的αFR-NPs，将200 µg抗体（抗叶酸结合蛋白抗体克隆[LK26]）与十倍摩尔过量的PEG交联剂（聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺戊酸酯醚 N′-(3-马来酰亚胺丙酰基)乙胺，CAS: 851040-94-3）溶于500 µL MES缓冲液（10 mM，pH 7.1）中，反应30分钟。
- 使用离心过滤装置（截留分子量100 kDa）对抗体-PEG反应液进行离心，以去除未反应的交联剂并浓缩抗体。本研究中所用离心过滤装置的离心条件为：23 °C下，14,000 × g 离心10分钟。将滤膜倒置后放入新离心管中，在1,000 × g 条件下离心2分钟，回收结合后的抗体。
- 用移液器将第3.2步制备的IR780纳米颗粒加入含有抗体的离心管中，并用移液器反复吹打混匀。室温下孵育至少30分钟，或 alternatively 在4 °C下过夜孵育，以形成αFR-NPs。
- 为制备nt-NPs，将1% w/v的甲氧基封端（m）PEG5000-马来酰亚胺（CAS: 99126-64-4）溶于DMSO中，加入到第3.2步制备的IR140 SERRS纳米颗粒中，在500 µL MES缓冲液（10 mM，pH 7.1）中于室温反应至少30分钟，或 alternatively 在4 °C下过夜反应。
- 用于小鼠给药（第5节）时，将两种类型的纳米探针均在11,000 × g 条件下离心4分钟，吸除上清液以去除未反应的游离抗体/PEG，然后分别重悬于MES缓冲液（10 mM，pH 7.1）中，浓度为600 pM。重悬纳米颗粒时应尽量减少不必要的超声暴露，以防止抗体变性。
4. 小鼠模型构建
- 建立人卵巢腺癌（SKOV-3）细胞系的稳定培养。可选地，为实现通过生物发光/荧光进行监测，可使用转染的 SKOV-3 Luc+/GFP+ 细胞。将细胞培养于含 10% 胎牛血清的 RPMI（Roswell Park Memorial Institute）培养基中，每周传代两次。用于注射时，用 0.25% 胰蛋白酶/0.05% EDTA 处理细胞 3 分钟以使其脱落，随后用 PBS 洗涤并重悬于 100 µL 含 2 × 106 个细胞的 PBS 中。
- 为建立卵巢微转移模型，将 200 µL 悬浮的 SKOV-3 细胞通过腹腔注射注入裸雌鼠（FOXn1nu/FOXn1nu 小鼠，6–8 周龄）。约 4 周后将出现腹膜播散性转移。若使用 SKOV-3 Luc+ 细胞，可通过眶后注射 50 µL PBS 中含 2 mg 虫荧光素酶底物（beetle luciferin）的方式，利用生物发光监测肿瘤生长情况。
5. 纳米探针注射与成像
- 按照第1-3节所述方法制备纳米探针（αFR-NPs和nt-NPs），并以1:1比例混合，最终每种纳米探针在MES缓冲液（10 mM，pH 7.1）中的浓度为300 pM。可选步骤：在小型（100 µL）锥形管中制备每种纳米探针30 pM的参考标准品。
- 每只小鼠腹腔注射1 mL纳米颗粒悬浮液，并轻轻按摩腹部以使纳米颗粒在腹腔内均匀分布。将小鼠放回饲养笼中。25分钟或更长时间后，通过CO2窒息法处死小鼠。
- 将小鼠固定于手术平台，呈仰卧位（若需进行全腹部成像，平台应可安装至直立式显微镜载物台上）。
- 使用有齿镊子和解剖剪刀去除皮肤以暴露腹膜，并做一条长2至3 cm的矢状切口，充分暴露整个腹腔。将腹膜瓣固定在平台上。使用塑料冲洗瓶以至少60 mL PBS冲洗腹腔内部。
注意：为实现无障碍的全腹部成像，需移动或切除肠管。若选择切除，应结扎肠系膜血管以减少血液流入腹腔。 - 或者，若需对特定器官成像，可在PBS冲洗后将其切除，并置于显微镜载玻片上。
- 使用有齿镊子和解剖剪刀去除皮肤以暴露腹膜，并做一条长2至3 cm的矢状切口，充分暴露整个腹腔。将腹膜瓣固定在平台上。使用塑料冲洗瓶以至少60 mL PBS冲洗腹腔内部。
- 将平台或载玻片转移至配备直立光学系统和电动载物台的拉曼显微光谱仪；使用商业系统，配备300 mW 785 nm激光二极管，光栅刻线密度为每毫米1,200条，中心波数设为1,115 cm-1。
- 使用白光光学系统对目标区域进行聚焦，该系统与拉曼激光共焦。选择成像区域及所需分辨率；本研究中采用高速采集模式（在持续激光照射下采集光谱，同时显微镜载物台持续移动，有效空间分辨率为14.2 µm × 200 µm；物镜放大倍数为5×，激光功率100 mW，每点曝光时间<100 ms）。
注意：如需要，可将第5.1步中含参考纳米探针的管子放置于成像区域内，作为后续分析的内部参考标准。确保除激光外无其他杂散光源进入物镜。
- 使用白光光学系统对目标区域进行聚焦，该系统与拉曼激光共焦。选择成像区域及所需分辨率；本研究中采用高速采集模式（在持续激光照射下采集光谱，同时显微镜载物台持续移动，有效空间分辨率为14.2 µm × 200 µm；物镜放大倍数为5×，激光功率100 mW，每点曝光时间<100 ms）。
- 可选步骤：将样本在含4%多聚甲醛的PBS中于4 °C固定过夜，用于组织学处理与验证。在4 °C条件下用PBS漂洗至少两次，每次不少于15分钟。将样本保存于70%乙醇水溶液中，直至进行常规组织学处理及石蜡包埋。为验证肿瘤组织，可从石蜡块不同深度切取5 µm厚切片，并进行苏木精-伊红（H&E）染色。
6. 数据处理与可视化
注意：所有数据处理均使用内部开发的图形用户界面完成，该界面基于商业软件构建。所用的所有功能在其他计算环境中均有通用的等效工具。
- 通过检测每种风味的纯悬浮液获取其参考光谱。参考光谱可来源于纳米探针的点扫描、在孔板中对纳米探针成像，或在参考管的实验扫描中加入内部参考（见步骤5.1）。
- 对参考光谱进行预处理，方法包括基线扣除（Whittaker滤波，λ = 200）、按曲线下面积归一化，以及Savitzky-Golay导数滤波（二次多项式拟合，一阶导数，宽度 = 15步）。这些预处理后的光谱将作为经典最小二乘法（CLS）模型的参考。
- 以与参考光谱相同的方式对图像中的样本数据进行预处理。使用可用的CLS算法计算每个样本点的CLS得分。直接CLS（DCLS）得分即为样本光谱投影到参考光谱广义逆矩阵（Moore-Penrose逆）所定义线性空间中的坐标。也可采用其他拟合算法（如非负最小二乘法、偏最小二乘法等）。
注意：某些拟合算法可能产生负值得分，这在本实验背景下无物理意义。若出现此情况，可设定阈值以排除负值得分，或改用受约束的非负最小二乘法算法。 - 计算目标纳米颗粒在参考光谱上的得分（ScoresαFR）与非目标纳米颗粒在参考光谱上的得分（Scoresnt）之间的逐点比值。若得分为非负数，该比值可用对数形式表示：
R = log10(ScoresαFR/ Scoresnt)。
比值R宜采用以零为中心的发散色阶显示，以反映探针相对丰度的数量级差异。所得图像可叠加至样本的白光图像上，以揭示叶酸受体过表达区域。
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结果
出于质量控制的目的，可在合成过程中使用多种方法对纳米颗粒进行表征，包括透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）、纳米颗粒追踪分析以及紫外-可见光吸收光谱，如图2所示。
通过该方法，可验证金纳米星核（见第1节）、二氧化硅壳的形成（第2节）以及后续的表面功能化（第3节）（图2）。通常，金纳米星核的尺寸（流体动力学直径）约为80 nm，二氧化硅壳厚度约为20 nm，因此硅化后的纳米颗粒总尺寸约为120 nm，与αFR抗体偶联后约为140 nm。紫外/可见光吸收光谱也可用于验证纳米颗粒的形貌。金纳米星核在水中的吸收峰通常位于670 nm处，硅化后吸收峰则红移至约710 nm处。若吸收峰出现在较短波长处，则表明纳米颗粒呈球形形貌或发生聚集。典型的反应产率和浓度如Table 1所示，其结果在很大程度上取决于...
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讨论
本方案描述了两种物质的合成方法 "风味" SERRS纳米探针的制备及其在小鼠体内用于叶酸受体过表达的卵巢肿瘤的拉曼成像研究，采用比值算法进行分析。相较于其他光学成像技术（如荧光成像），拉曼成像的主要优势在于纳米探针信号具有高度特异性，不会与任何生物来源的信号发生混淆。在本研究的拉曼成像实施方式中，纳米颗粒并非通过静脉注射给予，而是通过腹腔内局部注射，并随后进行一次洗涤步骤。该方法一旦转化为临床应用，将为外科医生提供一种优雅的解决方案，使其能够可视化并彻底切除所有卵巢癌种植病灶，包括那些因体积过小而无法通过肉眼识别、且由于缺乏与体循环相连的供血血管而无法被系统性注射的成像剂靶向的微小病灶。同时，由于我们的SERRS纳米颗粒不会被吸收进入体循环，因此潜在的副作用风险被降至最低。本研究是越来越多证据中的一个范例，表明经过精心设计的纳米结构可在成像和治疗技术方面提供超越传统方法的独特优势22,23,24,
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披露
• M.F.K. 是本研究相关多项已授权或待审批专利申请的发明人之一。M.F.K. 是 RIO Imaging, Inc. 的联合创始人，该公司致力于将 SERRS 纳米粒子技术转化为临床应用。
• 作者声明不存在其他竞争性财务利益。
致谢
特此致谢以下资助来源（致 M.F.K.）：NIH R01 EB017748、R01 CA222836 和 K08 CA16396；Damon Runyon-Rachleff 创新奖 DRR-29-14；Pershing Square Sohn 癌症研究联盟颁发的 Pershing Square Sohn 奖；以及纪念斯隆-凯特琳癌症中心分子成像中心（MSKCC Center for Molecular Imaging） & 纳米技术中心（CMINT）和技术开发资助。同时感谢MSKCC NIH核心资助（P30-CA008748）提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂名称 | |||
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| 3-MPTMS | Sigma-Aldrich | 175617 | |
| 氢氧化铵 (28%) | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| 抗叶酸受体抗体 [LK26] | AbCam | ab3361 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| 二甲基亚砜（无水） | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| IR140 | Sigma-Aldrich | 260932 | |
| IR780 高氯酸盐* | Sigma-Aldrich | 576409 | 已停产* |
| 异丙醇 | Sigma-Aldrich | 650447 | |
| N,N-二甲基甲酰胺 | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| PEG 交联剂 | Sigma-Aldrich | 757853 | |
| PEG-马来酰亚胺 | Sigma-Aldrich | 900339 | |
| 四氯金酸 | Sigma-Aldrich | 244597 | |
| 正硅酸四乙酯 | Sigma-Aldrich | 86578 | |
| *IR792 | Sigma-Aldrich | 425982 | *替代品 |
| 设备名称 | |||
| 透析盒 (3,500 MWCO) | ThermoFIsher | 87724 | |
| 离心过滤器 | Millipore | UFC510096 | |
| inVia 共聚焦拉曼显微镜 | Renishaw | ||
| MATLAB (v2014b) | Mathworks | ||
| PLS 工具箱 (v8.0) | Eigenvector research |
参考文献
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