卵巢癌会在整个腹膜腔内形成转移灶。本文介绍了一种制备和使用叶酸受体靶向的表面增强共振拉曼散射纳米探针的方案，该探针可通过比率成像以高特异性揭示这些病灶。via 将纳米探针腹腔内注射至活体小鼠，所获得的图像与组织学结果具有良好的相关性。
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本文内容
摘要
摘要
卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤。大多数患者在确诊时已处于晚期（国际妇产科联盟FIGO III期或IV期），此时局部转移性扩散已经发生。然而，卵巢癌的转移扩散具有独特模式，即肿瘤种植灶最初局限于腹腔内。这一特征理论上使得以根治为目的完全切除肿瘤种植灶成为可能。但许多转移病灶为微观病灶，难以识别和治疗。中和此类微转移灶被认为是消除肿瘤复发、实现长期生存的主要目标之一。利用表面增强共振拉曼散射纳米探针进行拉曼成像，因其明亮且生物正交的光谱特征，可用于高灵敏度地勾画微观肿瘤。本文描述了两类此类纳米探针的合成方法：一种是抗体功能化的探针，靶向叶酸受体——该受体在多种卵巢癌中高表达；另一种为非靶向对照探针，二者具有不同的光谱特征。 将这两种纳米探针共同经腹腔内注射至人卵巢腺癌转移小鼠模型中。所有动物实验均经纪念斯隆-凯特琳癌症中心机构动物护理和使用委员会批准。手术暴露动物腹腔后进行冲洗，并使用拉曼显微光谱仪扫描。随后，采用经典最小二乘拟合算法解耦两种纳米探针的拉曼信号，并将其各自的信号强度比值化，从而获得靶向叶酸受体探针相对于非靶向探针的比值信号。通过该方法，可实现对微观转移灶的高特异性可视化。该方法的主要优势在于，将探针局部应用于腹腔内——可在手术过程中便捷完成——能够在不使患者暴露于全身性纳米颗粒的情况下标记肿瘤。通过采用具有不同拉曼光谱特征的靶向与非靶向纳米探针混合物，并结合比值化分析策略，可消除因纳米探针非特异性结合内脏表面而产生的假阳性信号。目前该技术的局限性在于尚无商用的宽场拉曼成像相机系统，一旦该设备可用，本技术即可应用于手术室环境。
引言
利用“表面增强拉曼散射”（SERS）纳米颗粒进行拉曼成像，在多种应用场景及多种不同肿瘤类型中均展现出在界定病灶方面的巨大潜力1,2,3,4。SERS 纳米颗粒的主要优势在于其类似指纹的光谱特征，使其能够被明确检测，且不受生物背景信号的干扰5。此外，当使用吸收峰与激发激光相匹配的报告分子（染料）时，所发射信号的强度可进一步增强，从而产生“表面增强共振拉曼散射”（SERRS）纳米颗粒，其灵敏度更高6,7,8,9,10,11,12。
需要解决的阻碍表面增强（共振）拉曼散射纳米颗粒应用的一个障碍
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方案
所有动物实验均经纪念斯隆-凯特琳癌症中心机构动物照护与使用委员会批准（#06-07-011）。
1. 金纳米星核的合成
注意：金纳米星被用作本实验中两种类型的 SERRS 纳米探针的核心。
- 在去离子水（DI水）中配制800 mL的60 mM抗坏血酸（C6H8O6）溶液，并在去离子水中配制8 mL的20 mM四氯金酸（HAuCl4）溶液。将两种溶液冷却至4 °C。
- 在4 °C下进行此反应步骤。将含有800 mL抗坏血酸溶液的锥形瓶置于磁力搅拌器上，形成稳定的漩涡。迅速将8 mL四氯金酸溶液加入漩涡中。数秒内将生成纳米星，溶液变为深蓝色。若溶液在任何时刻变为粉红色或紫色，表明生成了纳米球，应弃去该悬浮液并重新尝试合成。
- 将纳米星悬浮液倒入50 mL锥形管中，在4 °C条件下以3,220 × g离心20分钟。吸除上清液，每管中保留约200 µL溶液。注意不要扰动管底的纳米颗粒沉淀。
注意：由于仍有悬浮的纳米星存在，上清液应呈现蓝色。 - 使用微量移液器轻轻搅动溶液，使各管中的纳米颗粒重新悬浮并收集。部分沉淀可能紧贴管底难以分散，即使剧烈吹打也无法重悬，该....
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结果
出于质量控制的目的，可在合成过程中使用多种方法对纳米颗粒进行表征，包括透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）、纳米颗粒追踪分析以及紫外-可见光吸收光谱，如图2所示。
通过该方法，可验证金纳米星核（见第1节）、二氧化硅壳的形成（第2节）以及后续的表面功能化（第3节）（图2）。通常，金纳米星核的尺寸（流体动力学直径）约为80 nm，二氧化硅壳厚度约为20 nm，因此硅化后的纳米颗粒总尺寸约为120 nm，与αFR抗体偶联后约为140 nm。紫外/可见光吸收光谱也可用于验证纳米颗粒的形貌。金纳米星核在水中的吸收峰通常位于670 nm处，硅化后吸收峰则红移至约710 nm处。若吸收峰出现在较短波长处，则表明纳米颗粒呈球形形貌或发生聚集。典型的反应产率和浓度如Table 1所示，其结果在很大程度上取决于.......
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讨论
本方案描述了两种物质的合成方法 "风味" SERRS纳米探针的制备及其在小鼠体内用于叶酸受体过表达的卵巢肿瘤的拉曼成像研究，采用比值算法进行分析。相较于其他光学成像技术（如荧光成像），拉曼成像的主要优势在于纳米探针信号具有高度特异性，不会与任何生物来源的信号发生混淆。在本研究的拉曼成像实施方式中，纳米颗粒并非通过静脉注射给予，而是通过腹腔内局部注射，并随后进行一次洗涤步骤。该方法一旦转化为临床应用，将为外科医生提供一种优雅的解决方案，使其能够可视化并彻底切除所有卵巢癌种植病灶，包括那些因体积过小而无法通过肉眼识别、且由于缺乏与体循环相连的供血血管而无法被系统性注射的成像剂靶向的微小病灶。同时，由于我们的SERRS纳米颗粒不会被吸收进入体循环，因此潜在的副作用风险被降至最低。本研究是越来越多证据中的一个范例，表明经过精心设计的纳米结构可在成像和治疗技术方面提供超越传统方法的独特优势22,23,24,
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披露
• M.F.K. 是本研究相关多项已授权或待审批专利申请的发明人之一。M.F.K. 是 RIO Imaging, Inc. 的联合创始人，该公司致力于将 SERRS 纳米粒子技术转化为临床应用。
• 作者声明不存在其他竞争性财务利益。
致谢
特此致谢以下资助来源（致 M.F.K.）：NIH R01 EB017748、R01 CA222836 和 K08 CA16396；Damon Runyon-Rachleff 创新奖 DRR-29-14；Pershing Square Sohn 癌症研究联盟颁发的 Pershing Square Sohn 奖；以及纪念斯隆-凯特琳癌症中心分子成像中心（MSKCC Center for Molecular Imaging） & 纳米技术中心（CMINT）和技术开发资助。同时感谢MSKCC NIH核心资助（P30-CA008748）提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂名称 | |||
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| 3-MPTMS | Sigma-Aldrich | 175617 | |
| 氢氧化铵 (28%) | Sigma-Aldrich | 338818 | |
| 抗叶酸受体抗体 [LK26] | AbCam | ab3361 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| 二甲基亚砜（无水） | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| IR140 | Sigma-Aldrich | 260932 | |
| IR780 高氯酸盐* | Sigma-Aldrich | 576409 | 已停产* |
| 异丙醇 | Sigma-Aldrich | 650447 | |
| N,N-二甲基甲酰胺 | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| PEG 交联剂 | Sigma-Aldrich | 757853 | |
| PEG-马来酰亚胺 | Sigma-Aldrich | 900339 | |
| 四氯金酸 | Sigma-Aldrich | 244597 | |
| 正硅酸四乙酯 | Sigma-Aldrich | 86578 | |
| *IR792 | Sigma-Aldrich | 425982 | *替代品 |
| 设备名称 | |||
| 透析盒 (3,500 MWCO) | ThermoFIsher | 87724 | |
| 离心过滤器 | Millipore | UFC510096 | |
| inVia 共聚焦拉曼显微镜 | Renishaw | ||
| MATLAB (v2014b) | Mathworks | ||
| PLS 工具箱 (v8.0) | Eigenvector research |
参考文献
- Oseledchyk, A., Andreou, C., Wall, M. A., Kircher, M. F. Folate-Targeted Surface-Enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detection of Microscopic Ovarian Cancer. ACS Nano. 11 (2), 1488-1497 (2017).
- Andreou, C., et al.
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