本研究优化并实施了一种六重标志物多重免疫荧光检测方案，采用自动化染色仪以获得更一致的结果并缩短操作时间。该方法可被任何实验室直接应用于免疫肿瘤学研究。
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本文内容
摘要
摘要
免疫肿瘤学的持续发展需要更深入地理解癌症免疫学的机制。对来自福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）活检组织样本的免疫谱型分析，已成为理解肿瘤免疫学复杂性以及发现癌症免疫治疗新型预测性生物标志物的关键工具。组织的免疫谱型分析需要在肿瘤微环境中联合评估多种标志物，包括炎性细胞亚群和免疫检查点。新型多重免疫组织化学方法的出现，使得对单个组织切片进行多参数分析的效率显著高于传统的单重免疫组织化学（IHC）。一种 commercially available 的多重免疫荧光（IF）方法基于酪胺信号放大技术，结合多光谱显微分析，可在组织中实现不同标志物信号的更好分离。该方法可兼容已针对FFPE组织样本上的标准IHC优化过的非偶联一抗。本文详细描述了一种自动化方案，可实现对癌组织样本进行六重标志物多重免疫荧光标记，所用抗体组合包括PD-L1、PD-1、CD68、CD8、Ki-67以及AE1/AE3细胞角蛋白，并以4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）作为细胞核复染剂。该多重抗体组合方案在自动化IHC染色仪中进行了优化，染色时间短于手动操作流程，可由任何实验室研究人员直接应用并根据需要调整，用于人类FFPE组织样本的免疫肿瘤学研究。本文还介绍了几种对照和工具，包括一种用于新多重免疫荧光抗体组合精细质量控制的滴加对照方法，有助于该技术的优化与验证。
引言
对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤组织样本进行免疫谱型分析已成为肿瘤免疫学研究中的关键组成部分，尤其在临床试验背景下，用于发现和验证癌症免疫治疗的新型预测性生物标志物1,2。使用化学显色剂（如二氨基联苯胺）的显色免疫组化（IHC）仍是病理诊断中对活检组织进行免疫标记的标准技术3。标准IHC也可用于癌症组织的免疫谱型分析，包括定量分析肿瘤相关淋巴细胞亚群以及评估免疫检查点分子（如程序性细胞死亡配体1（PD-L1））的表达水平4,5。然而，标准IHC存在局限性，即每张组织切片只能标记一种抗原。由于免疫谱型研究通常需要分析多个标志物的联合表达情况，若使用标准IHC，则需对多张组织切片分别染色，每张切片仅染一种标志物，因此在分析核心针活检等小组织样本时会受到显著限制。此外，标准IHC方法在评估由不同细胞群体共表达的标志物时也存在局限，例如PD-L1等免疫检查点标志物常在肿瘤相关巨噬细胞和癌细胞中均有表达。这一局限性已在病理学家使用标准单重IHC对多种细胞类型表达的IHC标志物进行定量分析时被报道6。开发在同一组织切片上使用多种颜色显色剂的多重显色免疫组化技术，是对传统单重IHC方法的重要改进
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方案
注意： 本方案介绍如何在自动化染色仪上使用 TSA 技术对六种抗体（CD68、ki67、PD-L1、PD-1、CD8 和 AE1/AE3）组成的 mIF 面板进行免疫谱型分析（参见材料表）。该方案还描述了如何进行“缺失对照”（drop controls），以对新建立的 mIF 面板进行质量控制（参见补充材料）。在本方案中，使用来自人扁桃体（阳性对照）的八张未染色 FFPE 切片和来自人肺腺癌的八张未染色切片进行染色。第一张切片用于包含全部六种标志物的全多重染色，第二张切片用于同型对照（不使用任何一抗），其余六张切片用于缺失对照（参见补充材料）。强烈建议额外设置组织自发荧光对照，且在所有多重研究中均应包含该对照（参见补充材料）。然而，研究人员可根据自身项目目标选用其他肿瘤类型和对照。对于此前无 mIF TSA 方法及多光谱扫描技术经验的实验室操作人员，建议阅读《多重免疫组化开发指南》（可在线获取，网址：http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp）。尽管该指南描述的是手动操作流程，但仍为 mIF 染色方法提供了良好的入门指导。本方案所使用的所有组织切片均已匿名化处理，并符合《赫尔辛基宣言》的要求。
1. 组织样本
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结果
本方案将产生如图所示的结果 图2从扁桃体对照的染色评估开始，首先观察表面鳞状上皮细胞。可与病理学家共同回顾扁桃体样本的组织学特征，并结合H&E滑片作为参考。如果在同一组织块上使用相同标记物进行显色免疫组化切片，则可用这些切片来确认mIF滑片上各标记物的密度和分布情况。如图所示 图2A，扁桃体组织应在扁桃体表面鳞状上皮中显示出清晰可辨的AE1/AE3细胞角蛋白染色（图2A；标记为红色伪彩色），淋巴组织中无背景染色。染色应位于细胞质，偶见膜强化，细胞核必须为阴性。隐窝中的网状上皮应同时对细胞角蛋白（红色）和PD-L1呈阳性图2A；绿色伪彩）。随后应识别扁桃体的滤泡生发中心。生发中心应易于辨认，并富含Ki-67阳性淋巴细胞（
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讨论
当前癌症免疫治疗的革命正在为癌症患者开辟全新且富有前景的治疗选择13。免疫肿瘤学领域的进展需要更深入地了解炎症性肿瘤微环境，这不仅有助于理解致癌过程中所涉及免疫机制的生物学特性，也有助于发现可用于新型免疫治疗的预测性生物标志物1,2。由于癌症免疫学具有复杂的生物学特性，通常需要对肿瘤组织样本进行分析，以不断扩展免疫标志物的检测清单。这些标志物在组织中不同细胞群体之间相互作用，并经常共表达1,2,5。临床试验通常采用小体积活检样本，例如穿刺活检或内镜活检，在治疗过程的不同时间点采集，以评估和监测患者的治疗反应。此类活检所提供的组织量有限，从而限制了可用于癌症免疫谱型分析的组织切片数量。当使用传统技术（如标准单重免疫组化）时，这一限制尤为严峻。因此，迫切需要开发新的癌症免疫谱型分析方法，采用多.......
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披露
本工作由全球生物制剂研发部门MedImmune资助，&D 为阿斯利康（AstraZeneca）的部门。C.W.、K.R. 和 C.C.H. 为 Perkin Elmer 公司员工，该公司生产了本研究中所使用的试剂（TSA 试剂盒）及多光谱扫描仪。M.S.、K.D.、A.H.、W.Z.、C. Bagnall、C. Brown、J.C.、A.L.、K.S.、M.R. 和 J.R.C. 为 MedImmune 公司员工，持有阿斯利康的股票所有权和/或股票权益或期权。
致谢
编辑支持由MedImmune的Deborah Shuman提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| "InForm 2.4.2" 光谱解混与图像分析软件 | PerkinElmer | CLS151066 | 文中称为 "光谱解混软件" |
| "Phenochart 1.0.9" 用于多光谱成像区域选择与整张切片扫描浏览的 QPTIFF 软件 | PerkinElmer | CLS151067 | 文中称为 "QPTIFF 软件" |
| #1.5 盖玻片 | Sigma Aldrich | 2975246 | |
| 200 证明乙醇 | Koptec | V1001 | |
| 20x Tris-缓冲盐溶液 | VWR | J640-4L | |
| 抗体稀释液 | DAKO | S2203 | |
| 抗 CD68 小鼠单克隆抗体 | DAKO | M087601-2 | 克隆号 PG-M1 |
| 抗 CD8 兔单克隆抗体 | Ventana | M5392 | 克隆号 SP239 |
| 抗 CK 小鼠单克隆抗体 | DAKO | M351501-2 | 克隆号 AE1/AE3 |
| 抗 ki67 小鼠单克隆抗体 | DAKO | M724001-2 | 克隆号 MIB-1 |
| 抗 PD-1 兔单克隆抗体 | Cell Signaling | #86163 | 克隆号 D4W2J |
| 抗 PD-L1 兔单克隆抗体 | Ventana | 790-4905 | 克隆号 SP263 |
| Bond 脱蜡液 | Leica | AR9222 | 文中称为 "脱蜡液" |
| Bond 抗原修复液 1 | Leica | AR9961 | 文中称为 "ER1" |
| Bond 抗原修复液 2 | Leica | AR9640 | 文中称为 "ER2" |
| Bond 开放式容器，30 mL | Leica | OP309700 | 文中称为 "30 mL 开放式容器" |
| Bond 开放式容器，7 mL | Leica | OP79193 | 文中称为 "7 mL 开放式容器" |
| Bond Polymer Refine 检测试剂盒 | Leica | DS9800 | 文中称为 "显色检测试剂盒" |
| Bond 研究用检测试剂盒 | Leica | DS9455 | 文中称为 "研究检测试剂盒" |
| Bond 滴定试剂盒 | Leica | OPT9049 | 文中称为 "滴定试剂盒" |
| Bond Universal Covertile Novocastra | Leica | S21.2001 | 文中称为 "盖片" |
| Bond 洗涤液 10X 浓缩液 | Leica | AR9590 | 文中称为 "10x 洗涤液" |
| BondRX 自动染色机 | Leica | 文中称为 "自动染色仪" | |
| BondRX 软件版本 5.2.1.204 | Leica | 文中称为 "自动染色仪软件" | |
| Opal 7 色自动化 IHC 试剂盒 | PerkinElmer | NEL801001KT | 文中称为 "多光谱染色试剂盒" |
| 过氧化物酶阻断剂 | Leica | RE7101 | |
| ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂 | Thermo | P36965 | 文中称为 "载玻片封片剂" |
| Starfrost 载玻片 | Fisher | 15-183-51 | |
| Vectra Polaris 多光谱显微镜，配备 "Vectra 3.0.5" 显微镜控制软件 | PerkinElmer | CLS143455 | 文中称为 "显微镜控制软件" |
参考文献
- Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges. Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).
- Taube, J. M., et al. Implications....
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