用于福尔马林固定癌组织样本免疫肿瘤学研究的自动化多重免疫荧光检测 panel

摘要

本研究优化并实施了一种六重标志物多重免疫荧光检测方案，采用自动化染色仪以获得更一致的结果并缩短操作时间。该方法可被任何实验室直接应用于免疫肿瘤学研究。

摘要

免疫肿瘤学的持续发展需要更深入地理解癌症免疫学的机制。对来自福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）活检组织样本的免疫谱型分析，已成为理解肿瘤免疫学复杂性以及发现癌症免疫治疗新型预测性生物标志物的关键工具。组织的免疫谱型分析需要在肿瘤微环境中联合评估多种标志物，包括炎性细胞亚群和免疫检查点。新型多重免疫组织化学方法的出现，使得对单个组织切片进行多参数分析的效率显著高于传统的单重免疫组织化学（IHC）。一种 commercially available 的多重免疫荧光（IF）方法基于酪胺信号放大技术，结合多光谱显微分析，可在组织中实现不同标志物信号的更好分离。该方法可兼容已针对FFPE组织样本上的标准IHC优化过的非偶联一抗。本文详细描述了一种自动化方案，可实现对癌组织样本进行六重标志物多重免疫荧光标记，所用抗体组合包括PD-L1、PD-1、CD68、CD8、Ki-67以及AE1/AE3细胞角蛋白，并以4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）作为细胞核复染剂。该多重抗体组合方案在自动化IHC染色仪中进行了优化，染色时间短于手动操作流程，可由任何实验室研究人员直接应用并根据需要调整，用于人类FFPE组织样本的免疫肿瘤学研究。本文还介绍了几种对照和工具，包括一种用于新多重免疫荧光抗体组合精细质量控制的滴加对照方法，有助于该技术的优化与验证。

引言

对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤组织样本进行免疫谱型分析已成为肿瘤免疫学研究中的关键组成部分，尤其在临床试验背景下，用于发现和验证癌症免疫治疗的新型预测性生物标志物^1,2。使用化学显色剂（如二氨基联苯胺）的显色免疫组化（IHC）仍是病理诊断中对活检组织进行免疫标记的标准技术³。标准IHC也可用于癌症组织的免疫谱型分析，包括定量分析肿瘤相关淋巴细胞亚群以及评估免疫检查点分子（如程序性细胞死亡配体1（PD-L1））的表达水平^4,5。然而，标准IHC存在局限性，即每张组织切片只能标记一种抗原。由于免疫谱型研究通常需要分析多个标志物的联合表达情况，若使用标准IHC，则需对多张组织切片分别染色，每张切片仅染一种标志物，因此在分析核心针活检等小组织样本时会受到显著限制。此外，标准IHC方法在评估由不同细胞群体共表达的标志物时也存在局限，例如PD-L1等免疫检查点标志物常在肿瘤相关巨噬细胞和癌细胞中均有表达。这一局限性已在病理学家使用标准单重IHC对多种细胞类型表达的IHC标志物进行定量分析时被报道⁶。开发在同一组织切片上使用多种颜色显色剂的多重显色免疫组化技术，是对传统单重IHC方法的重要改进⁷，但其仍受限于仅能标记少数几个标志物，并且在准确评估同一细胞群体中相同亚细胞区域表达的标志物时面临重要的技术挑战。

上述关于临床样本中组织可获得性的注意事项，以及多重显色免疫组化（IHC）技术的局限性，促使人们需要开发更先进的多重检测方法，以用于基于荧光标记并结合成像系统的肿瘤免疫学研究，该系统能够有效分离同一张切片上多种荧光染料的信号。其中一种技术基于酪胺信号放大法（tyramide signal amplification, TSA），结合多光谱显微成像，实现高效的颜色分离⁸。一种市售的基于TSA的试剂盒采用了专为多光谱成像优化的荧光染料⁸（见材料表）。该系统的一个关键优势在于，其可兼容那些已用于常规显色IHC并经过验证和优化的未标记一抗^9,10,11。这不仅加快了优化过程，还为引入新靶点的方案优化和抗体组合调整提供了灵活性。此外，多重免疫荧光（mIF）TSA方法可适配市售的自动化IHC染色系统，从而实现从单重显色IHC向mIF的顺利过渡。

本文介绍了一种基于自动化多重免疫荧光TSA染色并结合多光谱扫描仪成像的免疫肿瘤学研究用多重免疫荧光（mIF）检测方案。任何具备文中所述仪器设备和试剂的实验室用户均可对该方案进行适配与修改。该方案包含六种针对癌瘤免疫谱型分析的一抗组合：PD-L1、PD-1、CD68（泛巨噬细胞标记物）、CD8（细胞毒性T细胞）、Ki-67以及AE1/AE3（泛细胞角蛋白，作为上皮标记物用于识别癌瘤细胞）。近期一项研究报道了通过以显色免疫组化（IHC）作为标准参照，对人工操作的TSA多重免疫荧光方案进行优化的过程¹². 本文介绍的改进方法采用了一种市售的七色TSA试剂盒，并在自动化染色仪中进行了优化，将染色时间从3–5天显著缩短至14小时，同时提高了染色结果的一致性。除本文提供的详细主实验方案外，还包含 补充材料 部分包括 "液滴控制" 方法，一种用于评估新mIF panel的附加质量控制流程，以及针对优化、故障排除和开发新多重panel的技术说明，以帮助实验室用户建立并优化定制mIF panel的mIF TSA方法。

方案

注意： 本方案介绍如何在自动化染色仪上使用 TSA 技术对六种抗体（CD68、ki67、PD-L1、PD-1、CD8 和 AE1/AE3）组成的 mIF 面板进行免疫谱型分析（参见材料表）。该方案还描述了如何进行“缺失对照”（drop controls），以对新建立的 mIF 面板进行质量控制（参见补充材料）。在本方案中，使用来自人扁桃体（阳性对照）的八张未染色 FFPE 切片和来自人肺腺癌的八张未染色切片进行染色。第一张切片用于包含全部六种标志物的全多重染色，第二张切片用于同型对照（不使用任何一抗），其余六张切片用于缺失对照（参见补充材料）。强烈建议额外设置组织自发荧光对照，且在所有多重研究中均应包含该对照（参见补充材料）。然而，研究人员可根据自身项目目标选用其他肿瘤类型和对照。对于此前无 mIF TSA 方法及多光谱扫描技术经验的实验室操作人员，建议阅读《多重免疫组化开发指南》（可在线获取，网址：http://info.perkinelmer.com/2016-lp-Opalassaydevelopmentguide-lp）。尽管该指南描述的是手动操作流程，但仍为 mIF 染色方法提供了良好的入门指导。本方案所使用的所有组织切片均已匿名化处理，并符合《赫尔辛基宣言》的要求。

1. 组织样本

1. 选择含有淋巴组织增生的FFPE人扁桃体样本作为阳性对照，并选择已知PD-L1阳性的FFPE人肺腺癌样本。复查所选肺癌组织块的苏木精-伊红（H&E）切片，以确认肿瘤的存在。应避免使用坏死区域广泛的肿瘤，因为这可能会增加非特异性背景染色。
   注意：在本优化过程中，避免使用储存10年或更长时间的石蜡包埋组织块，以及石蜡块中呈现干燥外观的组织（请咨询组织学技术人员）。
2. 使用切片机从每个组织块连续切取10张厚度为4 µm的连续切片。将切片展于用于免疫组化（IHC）的带正电荷的玻璃载玻片上，每张载玻片放置一张切片。
   注意：切片必须平整贴附，不得有皱褶，因为皱褶可能导致染色伪影。将连续切片的载玻片按顺序编号为1至10。
3. 对第一张切片制作新的H&E染色切片。在病理医师协助下复查H&E切片，以确认扁桃体组织或肺部肿瘤在组织块中仍然存在。
   注意：该H&E切片可在后续多光谱分析和表型鉴定中，辅助选择感兴趣区域。
4. 将未染色的切片置于塑料载玻片盒中，于4 °C保存，最长可保存三个月。

2. 在自动化染色仪上创建新的多重免疫荧光染色程序：试剂注册

注意：在自动染色机软件中，试剂必须先添加到试剂列表中，然后才能在实验方案中使用。有关自动染色机型号和软件版本的信息，请参见材料表。

1. 在自动染色机软件中点击 试剂 选项卡。点击 添加 以定义一种新试剂。输入名称（例如，"520 TSA Reagent"）和缩写名称（例如，"520 TSA"），注意缩写名称最多为八个字符。从下拉菜单中选择 辅助试剂，并设置供应商。请勿更改 单染/双染 选项，默认保持为 单染/连续双染。将默认染色程序设置为 程序 F，将默认 HIER 程序设置为 ER1 20。
2. 保存新试剂，并对 表 1 中列出的所有试剂重复步骤 2.1。

3. 自动染色机：容器的注册

1. 在每个容器的侧面写明将要使用的试剂名称。扫描容器侧面的条形码，在弹出的窗口中从列表中选择正确的试剂，选择有效期并保存。
2. 对表1中列出的所有试剂重复步骤3.1的操作。
3. 注册Open Research Kit，扫描试剂盒侧面的两个条形码，并按照屏幕提示操作。将该试剂盒命名为"Multiplex Research Kit 1."，并将1x三(羟甲基)氨基甲烷（Tris）缓冲盐溶液作为该试剂盒的一部分进行注册（表1）。

4. 自动染色仪：mIF 实验方案程序的建立

1. 新的自动染色机上已预装名为 Opal 7 Multiplex 的基础多重染色程序（参见材料表中的型号和软件版本）。在程序界面中，将筛选条件由“"首选"”更改为“"全部"”，以查找该程序。如果设备中不存在该基础程序，请联系制造商协助更新自动染色机的软件。
2. 所有修改均应在原始程序的副本上进行。在修改前，先保存原始程序，然后点击程序选项卡，右键单击Opal 7 Multiplex程序并选择复制以创建副本。
3. 在新窗口中将程序名称更改为7 Multiplex protocol 1，并选择与正确设备对应的选项卡（落地式或台式）。参照补充表 S1中的程序设置。点击添加试剂，增加一个10分钟的过氧化物酶抑制步骤（此步骤不属于标准程序），并选择过氧化物酶抑制剂作为该步骤的试剂。
4. 确认封闭步骤使用的是PKI封闭缓冲液。确保每种一抗对应正确的试剂，二抗步骤使用HRP聚合物，并使用多光谱自动化试剂盒中提供的光谱4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）。通过在程序界面的下拉菜单中检查每个步骤所指定的试剂，确认所有选择无误。

5. 自动染色机：滴加对照的添加及同型对照方案

1. 复制名称 7 Multiplex protocol 1，并将其更改为 7 Multiplex protocol 1 CD68 DROP。将试剂 CD68 antibody 更改为 Mouse IgG，然后保存该方案。
2. 以相同方式再创建六个新方案，分别为每种drop对照各创建一个，并为完整的同型对照创建一个（将所有抗体更改为相应的同型对照抗体）。

6. 自动染色机：切片制备方案

1. 复制预染色方案 *Bake and Dewax，并将此方案重命名为 多光谱烘烤与脱蜡 2 小时。
2. 调整方案以匹配 表 2 中所示的试剂。在 60 °C 下烘烤载玻片 2 小时，在 72 °C 下脱蜡 30 秒。

7. 自动染色机：试剂的准备

1. 准备一个研究检测试剂盒。其中一种试剂必须永久与该试剂盒关联，因此将标记为1x Tris缓冲盐水（TBS）的30 mL敞口容器用1x TBS填充，并将其放置在指定为Multiplex Research Kit 1的研究检测试剂盒中的位置1（离手柄最远的位置）。该试剂将永久与此研究试剂盒关联，在后续使用中不得更改其位置。
2. 标记两个30 mL敞口容器，分别为多光谱阻断液和多光谱二抗。将来自多光谱染色试剂盒的封闭缓冲液/抗体稀释液30 mL加入多光谱阻断液容器中；将来自多光谱染色试剂盒的抗小鼠/抗兔二抗聚合物30 mL加入多光谱二抗容器中。
3. 准备十个7 mL敞口容器。所需体积（以微升计）为600 + (150 × [玻片数量])。本实验中每种抗体将应用于12张玻片（6张扁桃体和6张肺组织）。所有容器的标签及体积详见表3。
4. 对于每种一抗管，首先加入抗体稀释液，然后按表3所示体积加入浓缩的一抗，通过轻柔吹打混匀。
5. 准备一个7 mL敞口容器用于DAPI染色，每毫升双蒸水中加入4滴DAPI浓缩液；共16张玻片需进行DAPI染色（600 + [150 × 16] = 3,000 µL）。向容器中加入3 mL双蒸水和12滴光谱DAPI。每次实验均需新鲜配制DAPI溶液。
6. 准备一个7 mL敞口容器用于过氧化物酶抑制剂。全部16张玻片均需使用过氧化物酶抑制剂处理（600 + [150 × 16] = 3,000 µL）。向容器中加入3 mL过氧化物酶阻断液。
7. 在配制荧光工作液前，向厂家提供的每种冻干荧光染料管中加入75 µL二甲基亚砜，重悬所有冻干荧光染料。通过移液器吹打混匀。此即TSA荧光染料储备液。储存于4 °C。
8. 准备六个滴定容器，每种荧光染料各一个。 所需体积（以微升计）为350 + (150 × [玻片数量])。本实验中每种荧光染料将应用于16张玻片（8张扁桃体和8张肺组织）。所有容器的标签及体积详见表4。
9. 当所有试剂均已登记并配制完成后，将各容器置于支架上的任意位置，并将所有试剂装载至全自动染色仪上。仪器探针将确认每种试剂的体积。

8. 自动染色仪：样本设置与多光谱染色

1. 在自动染色机软件中，点击屏幕顶部的“载玻片设置”。点击“添加研究”。在弹出窗口中填写研究编号、研究名称和备注。
   1. 从下拉列表中选择进行染色操作的研究人员姓名。分配体积保持为 150 µL。在 制备程序 中选择 多光谱脱蜡。点击 确定 并 添加载玻片。在 备注 栏中输入 "多重染色1 肺组织 123ABC"。按以下要求填写各项： 组织类型 = 测试组织；分配体积 = 150 µL；染色模式 = 单次，常规；标记物 = 阴性；染色 = 输入 "7重多重染色程序1"；制备 = 多光谱烘烤，脱蜡2小时；HIER = 使用ER1进行HIER处理20分钟。
2. 点击 添加载玻片，并修改备注和程序以添加滴加对照载玻片和同型对照载玻片。当所有载玻片均已添加至研究中后，关闭 添加载玻片 窗口并打印标签。将标签贴至每张载玻片对应的标签区域。
3. 将载玻片装入支架中，按正确方向盖上盖片，将支架插入自动染色机，并降下托盘。设备将自动扫描载玻片标签。
4. 当所有载玻片和试剂均完成扫描和测量后，运行按钮（►）将变为可点击状态。若自动染色机检测到任何错误（如试剂体积不足），受影响的托盘旁将出现黄色警示符号。若发生错误，请右键点击警示符号并排除故障。 
5. 立即启动染色程序或设定延迟启动。该程序持续时间约为14小时。注意：请确保程序结束时能够立即取出载玻片，因为过度洗涤可能影响染色结果。 

9. 多光谱切片的封片

1. 从自动染色机中取出载玻片，并将其存放在盛有1x TBS的染色架中。
2. 使用1.5号盖玻片和15 µL封片介质（见材料表）封固样本。用移液器吸头轻轻按压盖玻片以去除气泡。
3. 将载玻片置于实验台面上，室温下避光静置过夜固化。未完全固化的载玻片可在小心操作下立即进行扫描。

10. 多光谱扫描仪

1. 打开多光谱扫描仪及其计算机电源（有关型号和软件信息，请参见材料表）。启动显微镜控制软件。按下设备前面的触控按钮，打开多光谱扫描仪的前门。扫描仪中的每个弹簧加载载具可容纳四张载玻片。将所有载玻片装入载具中，并在将载具装入设备前记录其顺序。
2. 选择编辑方案，然后点击新建…；接着创建方案名称多重检测面板1和抗体缺失对照。创建研究名称多重检测面板开发，点击创建方案，输入全片扫描滤光片 DAPI；然后选择全片扫描和像素分辨率 0.50 µm (20X)。所有滤光片和波段均应被包含。若未全部包含，请点击编辑滤光片和波段，选中全部五个滤光片（DAPI、FITC、CY3、Texas Red 和 CY5），然后点击设置曝光。
3. 通过选择装有肺腺癌多重染色样本的载具来加载载具。使用图形用户界面选择正确的载玻片。通过手动或自动对焦功能对组织进行对焦。导航至DAPI染色效果良好的区域，点击自动曝光以设置曝光时间（单位为毫秒，范围为0–2,000 ms）。
4. 对“全片扫描”和“MSI区域”两列中的全部五个滤光片组重复相同操作。在为每个滤光片和放大倍数设置曝光前，务必导航至染色效果良好的区域并对显微镜重新对焦。对20倍全片扫描和20倍多光谱成像（MSI）区域中的全部五个滤光片执行自动曝光。设置像素分辨率为0.50 µm (20x)。保存方案后，点击返回回到Vectra软件主界面；然后点击扫描载玻片。
5. 打开每张载玻片的界面，将任务设置为扫描。将研究设置为多重检测面板开发，将方案设置为多重检测面板1和抗体缺失对照，将载玻片ID设置为多重肺ABC123、CD68缺失对照肺ABC123等。 当所有载玻片均被标记且任务设置完成后，点击扫描。自动化多光谱扫描仪将使用全部五个滤光片对所有载玻片进行全片扫描。

11. 多光谱扫描仪：多光谱成像

1. 扫描完成后，打开 QPTIFF 软件（"Phenochart"），然后单击左上角的加载切片（Load Slide）。这将打开一个 QPTIFF 文件，即五通道全切片扫描图像。每个图层包含来自多个荧光染料的信息，因此其用途有限，但组织结构和广泛的表达模式清晰可见，可用于选择质谱成像（MSI）区域。
2. 使用左侧的下拉树导航并打开研究中正确的切片。在右上角使用用户姓名首字母登录。
3. 使用屏幕顶部的印章（Stamp）工具选择五个用于质谱成像（MSI）的区域。如有条件，应咨询病理学家。在选择用途（Select for）下选择采集（Acquisition）；在视野大小（Size in fields）下选择1×1；在视野限制（Field restriction）下选择0.5 µm（20×）。根据细胞角蛋白（CK）染色结果（主要在 Cy5 通道），从整体扫描图像中选择多个同时包含肿瘤组织（CK+）和间质组织（CK−）的区域。对每张切片重复此操作。
4. 完成所有质谱成像（MSI）区域的选择后，关闭Phenochart软件，返回到Vectra软件。将每张切片的任务类型从扫描（Scan）更改为质谱成像（MSI），然后再次单击扫描（Scan）以执行质谱成像数据采集。

12. 光谱解混

注意：光谱解混步骤是实现切片通道分离和图像分析所必需的。在使用inForm软件进行光谱解混之前，必须利用仅用单一荧光染料染色以及仅用DAPI染色的肺腺癌切片建立光谱库。该程序也在前述的多重IHC检测开发指南中有描述。

1. 当完成质谱成像（MSI）数据采集后，使用光谱解混软件（"InForm"）打开位于 MSI 文件夹中的文件。这些文件以 .im3 为扩展名。
2. 在 图像格式 下选择 多光谱；在 样本格式 下选择 荧光；在 光谱库来源 下选择 InForm。
3. 为选择荧光染料，从肺腺癌组织库切片所建立的光谱库中选择并加载全部六种荧光染料及 DAPI。点击 准备全部（左下角）。光谱解混软件将使用提供的光谱特征对所有已打开的图像进行光谱解混。
4. 与病理医师共同评估染色模式，并与同一组织连续切片中相同靶标的显色单染结果进行比对。

13. 荧光强度与信号衰减的评估

注意：计数工具显示为带有一个小棕色方框的箭头，是多重检测优化过程中最重要的工具，应频繁使用（参见补充材料）。在光谱解混软件中使用计数工具评估信噪比，其最小值应超过10:1（有关使用滴控对照评估多重染色的故障排除方法，请参见补充材料）。

1. 13.1. 在光谱解混软件中打开图像后，启用计数工具并扫描图像，以评估每个通道的荧光强度。肺组织中的目标强度应介于 10 至 20 个归一化计数之间。归一化计数工具如图 1所示。
2. 若任一标记物的信号最大计数低于 10，或正常信号区域计数低于 5，则应排除该切片，以避免自发荧光和非特异性染色干扰真实信号。
3. 若任一通道的最大计数超过 30，则应排除该切片，以防止光谱溢出或光谱解混效率降低。
4. 通过调整 TSA 浓度来调节过高或过低的归一化计数。

14. 多光谱图像分析

1. 在spectral unmixing software中打开一个或多个MSI文件，并仅选择在至少一个已打开图像中出现的荧光染料进行解混。点击Prepare All，对当前所有已打开的彩色图像进行解混，以获得光谱解混后的图像。
2. 选择计数工具，通过将光标悬停在感兴趣区域上，对每幅图像中的信号计数进行检测。
3. 选择眼睛图标以打开视图编辑器。选择并调整每个独立通道的显示强度。
4. 选择Configure以打开组织分割、细胞分割、表型鉴定和评分模块。这些工具可用于多重染色与显色单染之间的客观验证，并可用于生成定量的表型分析数据（Figure S1）。
5. 使用Export选项卡导出表型分析模块生成的灰度图像、荧光图像、类Pathview风格的无压缩TIFF图像以及数据文件，用于进一步分析、存档和展示（Figure S1）。

结果

本方案将产生如图所示的结果 图2首先评估扁桃体对照组织的染色情况，从表面的鳞状上皮细胞开始。可与病理学家共同回顾扁桃体样本的组织学特征，并结合H&E切片作为参考。如果在同一组织块上使用相同标记物进行显色免疫组化染色，则可用其确认mIF切片上各标记物的密度和分布情况。如图所示 图2A，扁桃体组织应在扁桃体表面鳞状上皮中呈现清晰明确的AE1/AE3细胞角蛋白染色（图2A；标记为红色伪彩色），淋巴组织中无背景染色。染色应位于细胞质，偶见膜强化，细胞核必须为阴性。隐窝中的网状上皮应同时对细胞角蛋白（红色）和PD-L1呈阳性图2A；绿色伪彩）。随后应识别扁桃体的滤泡生发中心。生发中心应易于辨认，并富含Ki-67阳性淋巴细胞（

讨论

当前癌症免疫治疗的革命正在为癌症患者开辟全新且富有前景的治疗选择¹³。免疫肿瘤学领域的进展需要更深入地了解炎症性肿瘤微环境，这不仅有助于理解致癌过程中所涉及免疫机制的生物学特性，也有助于发现可用于新型免疫治疗的预测性生物标志物^1,2。由于癌症免疫学具有复杂的生物学特性，通常需要对肿瘤组织样本进行分析，以不断扩展免疫标志物的检测清单。这些标志物在组织中不同细胞群体之间相互作用，并经常共表达^1,2,5。临床试验通常采用小体积活检样本，例如穿刺活检或内镜活检，在治疗过程的不同时间点采集，以评估和监测患者的治疗反应。此类活检所提供的组织量有限，从而限制了可用于癌症免疫谱型分析的组织切片数量。当使用传统技术（如标准单重免疫组化）时，这一限制尤为严峻。因此，迫切需要开发新的癌症免疫谱型分析方法，采用多...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
"InForm 2.4.2" 光谱解混与图像分析软件	PerkinElmer	CLS151066	文中称为 "光谱解混软件"
"Phenochart 1.0.9" 用于多光谱成像区域选择与整张切片扫描浏览的 QPTIFF 软件	PerkinElmer	CLS151067	文中称为 "QPTIFF 软件"
#1.5 盖玻片	Sigma Aldrich	2975246
200 证明乙醇	Koptec	V1001
20x Tris-缓冲盐溶液	VWR	J640-4L
抗体稀释液	DAKO	S2203
抗 CD68 小鼠单克隆抗体	DAKO	M087601-2	克隆号 PG-M1
抗 CD8 兔单克隆抗体	Ventana	M5392	克隆号 SP239
抗 CK 小鼠单克隆抗体	DAKO	M351501-2	克隆号 AE1/AE3
抗 ki67 小鼠单克隆抗体	DAKO	M724001-2	克隆号 MIB-1
抗 PD-1 兔单克隆抗体	Cell Signaling	#86163	克隆号 D4W2J
抗 PD-L1 兔单克隆抗体	Ventana	790-4905	克隆号 SP263
Bond 脱蜡液	Leica	AR9222	文中称为 "脱蜡液"
Bond 抗原修复液 1	Leica	AR9961	文中称为 "ER1"
Bond 抗原修复液 2	Leica	AR9640	文中称为 "ER2"
Bond 开放式容器，30 mL	Leica	OP309700	文中称为 "30 mL 开放式容器"
Bond 开放式容器，7 mL	Leica	OP79193	文中称为 "7 mL 开放式容器"
Bond Polymer Refine 检测试剂盒	Leica	DS9800	文中称为 "显色检测试剂盒"
Bond 研究用检测试剂盒	Leica	DS9455	文中称为 "研究检测试剂盒"
Bond 滴定试剂盒	Leica	OPT9049	文中称为 "滴定试剂盒"
Bond Universal Covertile Novocastra	Leica	S21.2001	文中称为 "盖片"
Bond 洗涤液 10X 浓缩液	Leica	AR9590	文中称为 "10x 洗涤液"
BondRX 自动染色机	Leica		文中称为 "自动染色仪"
BondRX 软件版本 5.2.1.204	Leica		文中称为 "自动染色仪软件"
Opal 7 色自动化 IHC 试剂盒	PerkinElmer	NEL801001KT	文中称为 "多光谱染色试剂盒"
过氧化物酶阻断剂	Leica	RE7101
ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂	Thermo	P36965	文中称为 "载玻片封片剂"
Starfrost 载玻片	Fisher	15-183-51
Vectra Polaris 多光谱显微镜，配备 "Vectra 3.0.5" 显微镜控制软件	PerkinElmer	CLS143455	文中称为 "显微镜控制软件"