分离具有生理活性的类囊体及其在依赖能量的蛋白质转运实验中的应用

摘要

本文介绍了高效分离具有生理活性的类囊体以及用于叶绿体双精氨酸转运（cpTat）、分泌（cpSec1）和信号识别颗粒（cpSRP）途径的蛋白质转运实验方法。

摘要

叶绿体是绿色植物中负责执行多种重要代谢途径的细胞器，其中最显著的是光合作用。在叶绿体内，类囊体膜系统包含了所有的光合色素、反应中心复合物以及大部分电子传递体，并负责依赖光的ATP合成。超过90%的叶绿体蛋白由细胞核基因编码，在细胞质中翻译后被导入叶绿体。进一步将蛋白质转运至或穿越类囊体膜则依赖于四种转运途径之一。本文介绍了一种从豌豆（Pisum sativum）中高效分离具有转运能力的类囊体的方法，并结合了通过三种依赖能量的cpTat、cpSec1和cpSRP介导途径的转运实验。这些方法可用于研究类囊体蛋白的定位、转运能量学以及蛋白质穿越生物膜的转运机制。

引言

几乎所有负责叶绿体正常功能的蛋白质机器都必须从细胞质中转运而来¹。在叶绿体被膜上，蛋白质底物通过外膜转运子（TOC）和内膜转运子（TIC）被导入²。进一步向类囊体膜和腔的靶向运输则通过双精氨酸转运途径（cpTat）³、分泌途径（cpSec1）⁴、信号识别颗粒途径（cpSRP）⁵以及自发插入途径完成⁶。为了测量转运事件的能量学和动力学，理解各途径中多样的转运机制，并将特定的蛋白质底物定位到叶绿体六个不同区室中的任意一个，必须采用一种能够高效分离生理活性叶绿体和类囊体膜的方法。

从叶绿体中分离膜组分可对影响运输热力学和动力学测定的环境因素（如盐浓度、底物浓度、ATP/GTP的存在以及pH条件）实现更佳的实验控制。 体外 环境也因相同的原因适用于研究易位的机制细节。此外，尽管用于预测叶绿体蛋白定位的软件已得到改进^7,8, 体外 转运实验相较于基于显微镜的荧光检测方法更为快速，后者需要基因编码的荧光标签、植物转化和/或特异性抗体。本文介绍了从豌豆中分....

方案

1. 初始材料

1. 将约55 g豌豆在400 mL蒸馏水中浸泡3小时，然后播种于塑料托盘（35 cm × 20 cm × 6 cm）的土壤中，并用一层薄蛭石覆盖。
2. 在20 °C、12/12小时光照/黑暗（50 µE/m²/s）条件下培养豌豆托盘²s）循环持续9至15天。
3. 根据首选方法制备蛋白质底物。
   注意：我们已采用多种方法制备蛋白质底物，包括 1） 体外 使用小麦胚芽提取物或兔网织红细胞裂解物进行体外转录翻译，反应体系中加入[³H]-亮氨酸或[³⁵S]-甲硫氨酸，2） 体外 使用偶联的转录/翻译试剂盒（如Promega的TnT试剂盒）进行翻译，并按上述方法进行放射性标记，以及3) 过表达蛋白的纯化 E. coli放射性 体外 翻译产物通常在用于转运反应前，用50 mM冷氨基酸淬灭。这些方法通常需要针对每种新的蛋白质底物进行一定的优化。有关偶联反应的示例 体外 系统，参见 Ling 和 Jarvis（2016）⁹.

2. 叶绿体的分离与定量

注意：制备类囊体的第一步是分离完整的叶绿体¹⁰。所....

结果

为了评估成功转运的底物量，建议设置一个或多个“百分比上样量”泳道。对于下文所示数据，使用了不含类囊体的最终转运反应体系的10%作为上样量。该“百分比上样量”也有助于观察前体底物的大小。该百分比代表已知且确定量的底物，可用于与转运后的底物进行比较，并可根据最初制备的蛋白量按需调整上样比例。此外，建议在0.75 mm厚的聚丙烯酰胺凝胶中，每个泳道上样的叶绿素当量少于4 µg，以避免条带扭曲和拖尾现象。以下所有底物均通过放射性标记并按如下方法制备 体外 翻译试剂盒

iOE17 通过 cpTat 途径的转运

讨论

叶绿体和类囊体的分离

过度破碎可能导致叶绿体分离效果不佳，从而在梯度离心中造成类囊体得率低下。最好轻柔地匀浆收获的组织，确保所有材料在搅拌前均完全浸没，并以15秒为周期间歇脉冲，直至完全匀浆。如有必要，可分多次进行较短时间的匀浆，每次减少组织量。

将所有与收获组织接触的材料进行冷藏，有助于分离的叶绿体在2小时内保持活性。分离后，将叶绿体置于冰上并避光保存也至关重要。

在接触分离的类囊体缓冲液中，必须包含镁离子。否则会导致基粒解堆叠，并严重影响光照下质子动力势的产生²¹。分离后的类囊体在冰上避光保存时，可用于转运反应长达2小时。

优化转运反应

分离的类囊体沉淀迅速，可能导致不同反应之间的叶绿素含量不均。因此，在使用前必须充分混匀类囊体，尤其是在准备大量样品时更应注意。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Pisum sativum 种子	Seedway LLC，美国纽约州霍尔	8686 - 小奇迹
Miracloth	Calbiochem，美国新泽西州吉布斯敦	475855-1
80% 丙酮	Sigma，美国密苏里州圣路易斯	67-64-1
带锋利刀片的搅拌机	Waring Commercial	BB155S
Polytron 10-35	Fischer Sci	13-874-617
Percoll	Sigma，美国密苏里州圣路易斯	GE17-0891-01
Beckman J2-MC 配 JA 20 转子	Beckman-Coulter	8043-30-1180
Sorvall RC-5B 配 HB-4 转子	Sorvall	8327-30-1016
1xIB 中含 100 mM 二硫苏糖醇（DTT）	Sigma，美国密苏里州圣路易斯	12/3/83	可分装后冷冻保存以供将来使用
1xIB 中含 200 mM MgATP	Sigma，美国密苏里州圣路易斯	74804-12-9	可分装后冷冻保存以供将来使用
1xIB 中含嗜热菌蛋白酶（2 mg/mL）	Sigma，美国密苏里州圣路易斯	9073-78-3	可分装后冷冻保存以供将来使用
HEPES	Sigma，美国密苏里州圣路易斯	H3375
K-Tricine	Sigma，美国密苏里州圣路易斯	T0377
山梨醇	Sigma，美国密苏里州圣路易斯	50-70-4
氯化镁	Sigma，美国密苏里州圣路易斯	7791-18-6
氯化锰	Sigma，美国密苏里州圣路易斯	13446-34-9
EDTA	Sigma，美国密苏里州圣路易斯	60-00-4
BSA	Sigma，美国密苏里州圣路易斯	9048-46-8
Tris	Sigma，美国密苏里州圣路易斯	77-86-1
SDS	Sigma，美国密苏里州圣路易斯	151-21-3
甘油	Sigma，美国密苏里州圣路易斯	56-81-5
溴酚蓝	Sigma，美国密苏里州圣路易斯	115-39-9
β-巯基乙醇	Sigma，美国密苏里州圣路易斯	60-24-2