本文介绍一种从新鲜或冷冻组织中快速分离高质量细胞核的方案，适用于后续的大规模平行RNA测序。方案中包括去污剂-机械法和低渗-机械法两种组织破碎与细胞裂解方法，均可用于细胞核的分离。
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摘要
摘要
检测单个细胞的基因表达能够识别细胞类型和细胞状态。单细胞RNA测序已成为研究细胞转录谱的有力工具，尤其适用于中枢神经系统等异质性组织。然而，单细胞测序所需的组织解离方法可能引起基因表达的实验性改变以及细胞死亡。此外，这些方法通常仅限于新鲜组织，从而限制了对存档样本和生物样本库材料的研究。单细胞核RNA测序（snRNA-Seq）为转录组研究提供了一种有吸引力的替代方案，因为它能够准确鉴定细胞类型，允许对冷冻或难以解离的组织进行研究，并减少解离过程诱导的转录变化。本文介绍了一种用于快速分离细胞核以进行下游snRNA-Seq的高通量实验方案。该方法可从新鲜或冷冻的脊髓样本中分离细胞核，并可与两种大规模并行的液滴包裹平台联合使用。
引言
神经系统由多种异质性细胞群组成，这些细胞表现出形态学、生物化学和电生理学特性上的广泛多样性。尽管批量RNA测序（bulk RNA sequencing）在确定不同条件下组织范围内基因表达变化方面具有重要作用，但它无法检测单个细胞水平上的转录变化。近年来，单细胞转录组分析技术的进步使得研究人员能够根据细胞的分子特征将其分类为不同的功能群体，甚至可用于识别近期处于活跃状态的神经元亚群。1,2,3,4 在过去十年中，单细胞RNA测序（scRNA-Seq）技术的发展使得对单个细胞基因表达的研究成为可能，从而揭示了细胞类型的多样性。5
诸如大规模并行单细胞RNA测序（scRNA-Seq）等可扩展技术的出现，为测序异质性组织（包括中枢神经系统的多个区域）提供了平台。6,7,8,9,10,11,12,13,14,15然而，单细胞解离方法可能导致细胞死亡以及基因表达的实验性改变。16近期研究已对单细胞测序方法进行了改进，以保留内源性转录谱。1,3,4,17,18,19这些策略尤其适用于检测感觉刺激或行为后即刻早期基因（IEG）的表达。3,4未来，该策略还可用于研究疾病状态或应激反应下组织的动态变化。在这些方法中，单核RNA测序（snRNA-Seq）是一种颇具前景的方法，无需进行诱导应激的细胞解离，可用于难以解离的组织（如脊髓）以及冷冻组织。4,17,18,19该方法基于先前的细胞核分离技术20,21,22,23,25 ，通常在低温条件下快速破坏组织并裂解细胞，通过离心将细胞核与细胞碎片分离。4分离得到的细胞核可用于多种微流控液滴包裹平台进行下游的高通量测序。4,7,24,25该方法能够捕捉数千个细胞在某一时间点的转录活性快照。
在分离和测序前，有多种策略可用于从细胞中释放细胞核，每种方法都有其各自的优缺点。本文中，我们描述并比较了两种可用于从成年脊髓组织中分离细胞核以进行后续高通量单核RNA测序（snRNA-Seq）的实验方案：去污剂-机械裂解法和低渗-机械裂解法。去污剂-机械裂解法可实现完全的组织解离，并获得较高的细胞核终末产量。低渗-机械裂解法则具有可控程度的组织解离，可在最终细胞核产量的数量与纯度之间进行权衡选择。这两种方法在RNA得率、每个细胞核检测到的基因数量以及细胞类型分析方面表现相当，均可成功用于snRNA-Seq。
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方案
所有动物实验均按照国家神经疾病和中风研究所动物护理和使用委员会批准的协议进行。所有实验均使用性别平衡的8至12周龄ICR/CD-1野生型小鼠。小鼠的操作应遵循当地机构动物护理和使用委员会的指南。
1. 材料与缓冲液的准备
- 所有缓冲液均需在使用当天配制，并置于冰上预冷（参见表1）。
- 若采用去污剂-机械裂解法，需配制去污剂裂解缓冲液（每份样品用量 > 500 μL）、低蔗糖缓冲液（每份样品用量 > 6 mL）、蔗糖密度缓冲液（每份样品用量 > 12.5 mL）以及重悬溶液（每份样品用量 > 1 mL）。
- 若采用低渗-机械裂解法，需配制低渗裂解缓冲液（每份样品用量 > 5 mL）、HEB培养基（每份样品用量 > 5 mL）、低蔗糖缓冲液（每份样品用量 > 3 mL）、蔗糖密度缓冲液（每份样品用量 > 12.5 mL）以及重悬溶液（每份样品用量 > 1 mL）。
- 在开始实验前，向25 mL低蔗糖缓冲液中加入25 μL二硫苏糖醇（DTT），并向25 mL蔗糖密度梯度缓冲液中加入另外25 μL DTT。
- 用铝箔覆盖解剖操作表面，以尽量减少纸巾或实验台防护垫中的纤维对样品的污染，这些纤维可能堵塞用于捕获单个细胞核的微流控通道。
- 使用RNase去污染溶液喷洒解剖工具和实验台区域。此外，若采用去污剂-机械细胞裂解法，还需用RNase去污染溶液喷洒Dounce匀浆器管和Oak Ridge管内部，并用超纯、无RNase的水冲洗Dounce管和Oak Ridge管。
- 将所有收集管（50 mL离心管、Oak Ridge管）和Dounce匀浆器管置于冰上预冷。
- 将一系列巴斯德吸管进行火焰抛光（若采用低渗-机械细胞裂解法）。
2. 脊髓的制备
- 若使用新鲜组织，通过吸入 CO2 处死小鼠。处死后，用 70% 乙醇喷洒小鼠体表，以尽量减少毛发对样本的污染。
- 使用锋利且无 RNase 的手术剪将小鼠断头。接着用镊子轻轻提起腹部皮肤，沿身体长轴剪开切口，暴露内脏器官。
- 用镊子将内脏从体腔中拉出，完成去内脏操作。请勿使用纸巾清洁操作区域或移除器官，以免引入污染物。使用剪刀在 L2 与 L3 脊椎之间剪断椎骨。
注意：经过练习后，此步骤可在 30 秒内完成。- 为推出脊髓，取一支含有冰浴 PBS 的 3 mL 注射器，并安装 25 G ¼ 英寸针头。将针头插入椎管的骶端，用两根手指夹紧椎骨，使针头周围形成密闭环境，然后推动活塞，将脊髓向前（头端）推出。将推出的脊髓置于含有冰浴 PBS 的培养皿中。
- 此时可将组织冷冻并保存于 -80 °C，或立即用于后续的去污剂-机械裂解（步骤 3）或低渗-机械裂解（步骤 4）。
- 若使用冷冻组织，需始终保持组织处于干冰上，并直接进行去污剂-机械裂解（步骤 3）或低渗-机械裂解（步骤 4）。
3. 去垢剂-机械法细胞裂解
- 将腰段脊髓置于预冷的Dounce匀浆器中，并加入500 μL预冷的去污剂裂解缓冲液。
注意：小鼠腰段脊髓重量为325.5 mg ± 63.9 mg（标准误，SEM，N = 4）。50 mg–1.5 g的组织均可成功使用。 - 使用A型杵（“松”杵）匀浆5次，然后使用B型杵（“紧”杵）匀浆5–10次。每次 strokes 之间避免将匀浆器提离裂解液，同时避免引入气泡。
- 将40 μm滤网置于预冷的50 mL锥形管上，并用1 mL低蔗糖缓冲液预先润湿。
- 向含有裂解缓冲液中粗提细胞核的Dounce匀浆器中加入1 mL低蔗糖缓冲液，通过移液轻轻吹打混合2–3次。
- 将粗提的细胞核悬液经40 μm滤网过滤至预冷的50 mL锥形管中。
- 再向40 μm滤网上加入1 mL低蔗糖缓冲液，最终体积为3 mL低蔗糖缓冲液和500 μL裂解缓冲液。
- 若合并多个脊髓样本，重复步骤3.1–3.6，并在同一锥形管中汇集。
- 在4 °C下以3,200 x g离心10分钟。离心完成后弃去上清液。进入第5步。
4. 低渗-机械法细胞裂解
- 将腰段脊髓放入含有 5 mL 低渗裂解缓冲液的组织培养皿中。使用弹簧剪的钝端将脊髓纵向切开，再用弹簧剪将脊髓切成 3–4 mm 的组织块，但不要过度剪碎。
注意：可成功使用的组织量为 50 mg–1.5 g。 - 在冰上孵育 15 分钟，期间轻柔摇晃 2–3 次。
- 加入 5 mL HEB 培养基以稀释低渗裂解缓冲液。
- 使用 5 mL 移液管吹打组织 10 次，或直至所有组织块能顺畅通过移液管口。
- 依次使用三支火焰抛光、内径逐渐变窄（约 900–600 μm）的巴斯德移液管进行吹打。
- 对每支移液管吹打 5–15 次，待组织沉降后，吸取 1–2 mL 含解离细胞核的上清液，经 40 μm 滤网过滤至预冷的 50 mL 尖底离心管中。
- 使用最小口径的巴斯德移液管吹打后，确保匀浆液能顺畅流过移液管尖端。将剩余溶液全部经 40 μm 滤网过滤至 50 mL 尖底离心管中。
注意：总吹打次数可根据需要调整。小鼠脊髓的脑膜组织会残留下来，但必须充分吹打所有可见的脊髓组织块。将剩余匀浆液全部通过 40 μm 滤网。吹打过程中应避免产生气泡。
- 将过滤后的样品在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 10 分钟。离心结束后，弃去上清液。继续进行第 5 步。
5. 匀浆与蔗糖密度梯度
- 在完成步骤3或步骤4后，使用3 mL低蔗糖缓冲液重悬沉淀。轻轻旋转以使沉淀从管壁脱离，促进重悬。将样品置于冰上静置2分钟，然后转移至Oak Ridge管中。
- 使用匀浆器在1档设置下，在低蔗糖缓冲液中匀浆细胞核15–30秒，期间保持样品处于冰上。
注意：若使用一个腰段脊髓样本，则使用15秒；若使用合并样本或整个脊髓，则使用30秒。 - 使用移液管将12.5 mL密度蔗糖缓冲液小心地铺在低蔗糖缓冲液匀浆液下方，注意避免产生破坏密度层的气泡。
- 在4 °C条件下，以3,200 × g离心20分钟。
- 离心完成后，立即以轻弹方式弃去上清液。
注意：如有需要，可一并弃去残留体积（小于400 μL）的蔗糖缓冲液，以获得体积更小且更纯净的终样品；但该残留液体中仍含有细胞核，为最大化细胞核得率，也可予以保留。 - 使用100 μL至1 mL重悬液，重悬管壁上残留的细胞核。避免接触去污剂法提取后残留的髓鞘“皱层”。
- 将细胞核通过孔径为30–35 μm的滤网过滤，并收集至预冷的离心管中。
- 使用血细胞计数板在10倍物镜下计数细胞核，以确定细胞核得率。
注意：可加入台盼蓝以可视化细胞核，细胞核应呈蓝色。注意记录细胞碎片的量。 - 继续进行步骤6或步骤7。
6. 大规模并行snRNA测序：学术平台7
- 进行大规模并行的单核RNA测序（例如，Drop-Seq）方法，如先前所述7 并作如下修改：4
- 将细胞核调整至最终浓度为每微升225个细胞核 μL.
- 以每微升250个条形码微珠的浓度制备微珠 μL.
- 用 0.7% 烷基硫酸钠（sarkosyl）配制裂解缓冲液。
- 调节流速至35 μL 每分钟用于珠子，35 μL 每分钟用于细胞核，以及 200 μ每分钟升（L/min）用于油。
7. 高通量单核RNA测序：商业平台26
- 按照制造商的说明，使用商业平台（例如，Chromium 单细胞基因表达解决方案）进行高通量 snRNA 测序26，并作如下修改：
- 在逆转录完成后，根据目标细胞回收率，在计算出的 cDNA 扩增循环数基础上额外增加一个 PCR 循环，以补偿与完整细胞相比从细胞核中获得的 cDNA 减少的问题。
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结果
本研究中，我们从成年小鼠腰段脊髓中分离细胞核，用于后续的大规模并行RNA测序。该方案包括三个主要步骤：组织破碎与细胞裂解、匀浆化以及蔗糖密度梯度离心（图1）。在数秒内，去垢剂-机械裂解法即可获得粗制细胞核样品，其中含有大量细胞核以及细胞和组织碎片（图2A，表2）。经过十五分钟，低渗-机械裂解法获得的粗制细胞核样品中碎片较少，但细胞核数量也更少（图2B，表2）。两种粗制样品均经过匀浆化处理（图2C 和 D），随后进行蔗糖密度梯度离心，最后重悬于含0.04% BSA的PBS中（图2E 和 F
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讨论
本实验方案的最终目标是分离出含有高质量RNA的细胞核，用于后续的转录组分析。我们改进了单核RNA测序（snRNA-Seq）方法，以全面分析脊髓中的所有细胞类型。最初我们发现，传统的细胞解离方法在单细胞RNA测序中效果不佳，因为脊髓神经元特别容易发生细胞死亡。此外，细胞解离过程可诱导多种活动相关基因和应激反应基因的表达，升高幅度可达数百倍。3,4,16 鉴于单细胞制备方法存在上述缺陷，我们及其他研究者已转而采用细胞核作为替代材料。16,17,18,24 该方法也可应用于人类组织，包括冷冻保存的脊髓组织。4,
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披露
我们没有需要披露的利益冲突。
致谢
本工作得到了美国国家神经疾病与卒中研究所（NINDS，项目编号：1 ZIA NS003153 02）和美国国家耳聋与其他沟通障碍研究所（NIDCD，项目编号：1 ZIA DC000059 18）院内研究计划的支持。我们感谢 L. Li 和 C.I. Dobrott 提供的技术支持与有益讨论，并感谢 C. Kathe 对稿件的审阅。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 蔗糖 | Invitrogen | 15503-022 | |
| 1 M HEPES (pH = 8.0) | Gibco | 15630-080 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| 乙酸镁（MgAc） | Sigma Aldrich | M5661-50G | |
| 0.5 M EDTA (pH = 8.0) | Corning | MT-46034CI | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Sigma Aldrich | 10197777001 | 使用前立即加入DTT |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| 无核酸酶水 | Crystalgen | 221-238-10 | |
| 1 M Tris-HCl (pH = 7.4) | Sigma Aldrich | T2194 | |
| 5 M NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| 1 M MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Nonidet P40 | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| Glutamax (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| B27 (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| 1x PBS | Crystalgen | 221-133-10 | |
| 0.04% BSA | New England Biolabs | B9000S | |
| 0.2 U/μL RNA酶抑制剂 | Lucigen | 30281-1 | |
| 橡树岭离心管 | Thermo Scientific | 3118-0050 | |
| 一次性带棉塞硼硅酸盐玻璃巴斯德吸管 | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| 玻璃组织匀浆器（2 mL） | Kimble | 885303-002 | |
| 大间隙玻璃研杵 | Kimble | 885301-0002 | |
| 小间隙玻璃研杵 | Kimble | 885302-002 | |
| T 10 Basic Ultra Turrax 匀浆仪 | IKA | 3737001 | |
| 分散工具（S 10 N – 5G） | IKA | 3304000 | |
| 台盼蓝染液（0.4%） | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 40 μm 细胞筛 | Falcon | 352340 | |
| MACS SmartStrainers，30 μm | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| 锥形管 | Denville Scientific | 1000799 | |
| Sorvall Legend XTR 离心机 | Thermo Fisher Scientific | 75004505 | |
| Fiberlite F15-6 x 100y 固定角转子 | Thermo Fisher Scientific | 75003698 | |
| 刻度移液管：5 mL，10 mL | Denville Scientific | P7127 | |
| 血细胞计数板 | Daigger Scientific | EF16034F | |
| Chemgenes 条形码微珠 | Chemgenes | Macosko-2011-10 | |
| RNA酶清除剂 RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | |
| 带细胞筛帽的 Falcon 试管（35 μm） | Corning | 352235 | |
| MoFlo Astrios 细胞分选仪 | Beckman Coulter | B25982 | |
| Chromium i7 多重试剂盒，96 次反应 | 10X Genomics | 120262 | |
| Chromium 单细胞 3’ 文库与凝胶微珠试剂盒 v2，4 次反应 | 10X Genomics | 120267 | |
| Chromium 单细胞 A 芯片试剂盒，16 次反应 | 10X Genomics | ||
| 组织培养皿（60 mm x 15 mm） | Corning | 353002 |
参考文献
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.
Step 3.1 was updated from:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.
to:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.
Step 3.6 was updated from:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.
to:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.
Step 5.5 was updated from:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
to:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
Step 5.6 was updated from:
Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.
to:
Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.
Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:
- Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
- Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
- Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
- Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.
to:
- Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
- Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
- Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
- Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.
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