本文介绍一种从新鲜或冷冻组织中快速分离高质量细胞核的方案，适用于后续的大规模平行RNA测序。方案中包括去污剂-机械法和低渗-机械法两种组织破碎与细胞裂解方法，均可用于细胞核的分离。
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摘要
摘要
检测单个细胞的基因表达能够识别细胞类型和细胞状态。单细胞RNA测序已成为研究细胞转录谱的有力工具，尤其适用于中枢神经系统等异质性组织。然而，单细胞测序所需的组织解离方法可能引起基因表达的实验性改变以及细胞死亡。此外，这些方法通常仅限于新鲜组织，从而限制了对存档样本和生物样本库材料的研究。单细胞核RNA测序（snRNA-Seq）为转录组研究提供了一种有吸引力的替代方案，因为它能够准确鉴定细胞类型，允许对冷冻或难以解离的组织进行研究，并减少解离过程诱导的转录变化。本文介绍了一种用于快速分离细胞核以进行下游snRNA-Seq的高通量实验方案。该方法可从新鲜或冷冻的脊髓样本中分离细胞核，并可与两种大规模并行的液滴包裹平台联合使用。
引言
神经系统由多种异质性细胞群组成，这些细胞表现出形态学、生物化学和电生理学特性上的广泛多样性。尽管批量RNA测序（bulk RNA sequencing）在确定不同条件下组织范围内基因表达变化方面具有重要作用，但它无法检测单个细胞水平上的转录变化。近年来，单细胞转录组分析技术的进步使得研究人员能够根据细胞的分子特征将其分类为不同的功能群体，甚至可用于识别近期处于活跃状态的神经元亚群。1,2,3,4 在过去十年中，单细胞RNA测序（scRNA-Seq）技术的发展使得对单个细胞基因表达的研究成为可能，从而揭示了细胞类型的多样性。5
诸如大规模并行单细胞RNA测序（scRNA-Seq）等可扩展技术的出现，为测序异质性组织（包括中枢神经系统的多个区域）提供了平台。6,7,8,9,
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方案
所有动物实验均按照国家神经疾病和中风研究所动物护理和使用委员会批准的协议进行。所有实验均使用性别平衡的8至12周龄ICR/CD-1野生型小鼠。小鼠的操作应遵循当地机构动物护理和使用委员会的指南。
1. 材料与缓冲液的准备
- 所有缓冲液均需在使用当天配制，并置于冰上预冷（参见表1）。
- 若采用去污剂-机械裂解法，需配制去污剂裂解缓冲液（每份样品用量 > 500 μL）、低蔗糖缓冲液（每份样品用量 > 6 mL）、蔗糖密度缓冲液（每份样品用量 > 12.5 mL）以及重悬溶液（每份样品用量 > 1 mL）。
- 若采用低渗-机械裂解法，需配制低渗裂解缓冲液（每份样品用量 > 5 mL）、HEB培养基（每份样品用量 > 5 mL）、低蔗糖缓冲液（每份样品用量 > 3 mL）、蔗糖密度缓冲液（每份样品用量 > 12.5 mL）以及重悬溶液（每份样品用量 > 1 mL）。
- 在开始实验前，向25 mL低蔗糖缓冲液中加入25 μL二硫苏糖醇（DTT），并向25 mL蔗糖密度梯度缓冲液中加入另外25 μL DTT。
- 用铝箔覆盖解剖操作表面，以尽量减少纸巾或实验台防护垫中的纤维对样品的污染，这些纤维可能堵塞用于捕获单个细胞核的微流控通道。
- 使用RNase去污染溶液喷洒解剖工具和实验台区域。此外，若采用去污剂-机....
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结果
本研究中，我们从成年小鼠腰段脊髓中分离细胞核，用于后续的大规模并行RNA测序。该方案包括三个主要步骤：组织破碎与细胞裂解、匀浆化以及蔗糖密度梯度离心（图1）。在数秒内，去垢剂-机械裂解法即可获得粗制细胞核样品，其中含有大量细胞核以及细胞和组织碎片（图2A，表2）。经过十五分钟，低渗-机械裂解法获得的粗制细胞核样品中碎片较少，但细胞核数量也更少（图2B，表2）。两种粗制样品均经过匀浆化处理（图2C 和 D），随后进行蔗糖密度梯度离心，最后重悬于含0.04% BSA的PBS中（图2E 和 F
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讨论
本实验方案的最终目标是分离出含有高质量RNA的细胞核，用于后续的转录组分析。我们改进了单核RNA测序（snRNA-Seq）方法，以全面分析脊髓中的所有细胞类型。最初我们发现，传统的细胞解离方法在单细胞RNA测序中效果不佳，因为脊髓神经元特别容易发生细胞死亡。此外，细胞解离过程可诱导多种活动相关基因和应激反应基因的表达，升高幅度可达数百倍。3,4,16 鉴于单细胞制备方法存在上述缺陷，我们及其他研究者已转而采用细胞核作为替代材料。16,17,18,24 该方法也可应用于人类组织，包括冷冻保存的脊髓组织。4,
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披露
我们没有需要披露的利益冲突。
致谢
本工作得到了美国国家神经疾病与卒中研究所（NINDS，项目编号：1 ZIA NS003153 02）和美国国家耳聋与其他沟通障碍研究所（NIDCD，项目编号：1 ZIA DC000059 18）院内研究计划的支持。我们感谢 L. Li 和 C.I. Dobrott 提供的技术支持与有益讨论，并感谢 C. Kathe 对稿件的审阅。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 蔗糖 | Invitrogen | 15503-022 | |
| 1 M HEPES (pH = 8.0) | Gibco | 15630-080 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| 乙酸镁（MgAc） | Sigma Aldrich | M5661-50G | |
| 0.5 M EDTA (pH = 8.0) | Corning | MT-46034CI | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Sigma Aldrich | 10197777001 | 使用前立即加入DTT |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| 无核酸酶水 | Crystalgen | 221-238-10 | |
| 1 M Tris-HCl (pH = 7.4) | Sigma Aldrich | T2194 | |
| 5 M NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| 1 M MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Nonidet P40 | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| Glutamax (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| B27 (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| 1x PBS | Crystalgen | 221-133-10 | |
| 0.04% BSA | New England Biolabs | B9000S | |
| 0.2 U/μL RNA酶抑制剂 | Lucigen | 30281-1 | |
| 橡树岭离心管 | Thermo Scientific | 3118-0050 | |
| 一次性带棉塞硼硅酸盐玻璃巴斯德吸管 | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| 玻璃组织匀浆器（2 mL） | Kimble | 885303-002 | |
| 大间隙玻璃研杵 | Kimble | 885301-0002 | |
| 小间隙玻璃研杵 | Kimble | 885302-002 | |
| T 10 Basic Ultra Turrax 匀浆仪 | IKA | 3737001 | |
| 分散工具（S 10 N – 5G） | IKA | 3304000 | |
| 台盼蓝染液（0.4%） | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 40 μm 细胞筛 | Falcon | 352340 | |
| MACS SmartStrainers，30 μm | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| 锥形管 | Denville Scientific | 1000799 | |
| Sorvall Legend XTR 离心机 | Thermo Fisher Scientific | 75004505 | |
| Fiberlite F15-6 x 100y 固定角转子 | Thermo Fisher Scientific | 75003698 | |
| 刻度移液管：5 mL，10 mL | Denville Scientific | P7127 | |
| 血细胞计数板 | Daigger Scientific | EF16034F | |
| Chemgenes 条形码微珠 | Chemgenes | Macosko-2011-10 | |
| RNA酶清除剂 RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | |
| 带细胞筛帽的 Falcon 试管（35 μm） | Corning | 352235 | |
| MoFlo Astrios 细胞分选仪 | Beckman Coulter | B25982 | |
| Chromium i7 多重试剂盒，96 次反应 | 10X Genomics | 120262 | |
| Chromium 单细胞 3’ 文库与凝胶微珠试剂盒 v2，4 次反应 | 10X Genomics | 120267 | |
| Chromium 单细胞 A 芯片试剂盒，16 次反应 | 10X Genomics | ||
| 组织培养皿（60 mm x 15 mm） | Corning | 353002 |
参考文献
- Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
- Hu, P., et al.
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.
Step 3.1 was updated from:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.
to:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.
Step 3.6 was updated from:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.
to:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.
Step 5.5 was updated from:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
to:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
Step 5.6 was updated from:
Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.
to:
Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.
Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:
- Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
- Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
- Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
- Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.
to:
- Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
- Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
- Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
- Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.
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